לכידה אופטית של חלקיקים

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור מערך ללכידה אופטית באמצעות מפתח (aperture) לצורך לכידה של חלקיקים בגודל של כ-20 ננומטרים. לשם כך, גלאי מתווסף למערך קיים של לכידה אופטית בלייזר כדי לאפשר מדידה. לאחר מכן, תמיסת הננוחלקיקים למדידה מוזרקת לתוך תא מיקרופלואידי עם מלכודת ננו-חורים כפולה (double nano hole trap), והתא נטען אל תוך מערך הלכידה האופטית.

כאשר חלקיק נכנס למפתח המואר, העברת האור עולה באופן דרמטי עקב טעינה דיאלקטרית. אם החלקיק מנסה לעזוב את המפתח, העברה מופחתת גורמת לשינוי במומנטום החוצה מהחור, ובהתאם לחוק השלישי של ניוטון, הדבר מביא לכוח המושך את החלקיק בחזרה אל תוך החור ובכך לוכד אותו. החלקיק גורם להסטה לכיוון האדום (red shifting) של עקומת ההעברה, שניתן לנטרה.

לפיכך, המלכודת יכולה לשמש כחיישן. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אירועי לכידה של ננו-חלקיקים, כולל פריסה (unfolding) של חלבונים כלואים, כפי שניתן לראות משינויים בעוצמת הלייזר דרך החור הננומטרי הכפול. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לכידה אופטית באמצעות כוח גרדיאנט, הוא היכולת ללכוד ננו-חלקיקים קטנים יותר בעוצמות לייזר נמוכות יותר.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביוכימיה, כגון כיצד חלבונים בודדים מתקפלים ומתקשרים, וכיצד חלקיקי וירוס מדביקים תאים חיים? באופן כללי, חוקרים עלולים להתקשות ביישום שיטה זו בשל הקושי בשילוב של ננו-חורים כפולים (double nana hole) במערכת לכידה בלייזר קיימת. מערך הלכידה האופטית מבוסס על ערכת פינצטה אופטית של Thor Lab, המצוידת במודול למדידת כוח.

דיודה פוטו-אבאלנשה (avalanche photo diode) משמשת להחלפת גלאי הרבעים במודול מדידת הכוח. בעת הגדרת מערכת הלכידה האופטית, יש להרכיב הגנה לעיניים בכל פעם שהלייזר פועל. ודאו שהקרן תישאר בתוך אזור בטוח על ידי עבודה בחדר סגור והגבלת הקרן בתוך מערך הלכידה ככל האפשר; יש להימנע מענידת תכשירי השתקפות.

יש ללבוש כפפות לטקס. כדי להבטיח את ניקיון האופטיקה, יש להכין את ערכת הפינצטה האופטית ואת מודול מדידת הכוח. על פי הנחיות היצרן, ערכת הפינצטה האופטית המורכבת היא בעלת תכנון של מיקרוסקופ אור הפוך ומורכבת מהמרכיבים הבאים: לייזר מלכוד, עדשת יעד בטבילה בשמן של 100x, במה למיקום דגימה בעלת שלושה צירים ומצלמת CCD.

שים לב כי מומלץ להשתמש בהגנה מפני פריקה אלקטרוסטטית בעת טיפול בדיודות לייזר. מודול מדידת הכוח מאפשר כיול של הפינצטה האופטית באמצעות זיהוי מיקום של המישור המוקדי האחורי של העדשה המקבצת. במקום מודולי מדידת הכוח, נעשה שימוש ב-APD (גלאי פוטו- avalanche) מבוסס סיליקון או ב-PD (פוטודיודה).

בגלאי מיקום רבעוני (Quadrant position detector), הכנס גם נגד-קבל או מסנן RC המשתמש בנגד של 200 kilo oh ובקבל של 100 picofarad. רכיב זה משמש להפחתת רעשים בתדר גבוה ולהקלה על זיהוי אירועי לכידה באוסצילוסקופ. השתמש בכבל קואקסיאלי כדי לחבר את מסנן ה-RC לאחר ה-A PD. לאחר מכן, השתמש בכבלים קואקסיאליים ובמתאם T כדי לחבר את האוסצילוסקופ ואת מודול רכישת הנתונים למסנן ה-RC.

המערכת מוכנה כעת להטענת הדגימה. מפתח הננו-חורים הכפול מורכב משני ננו-חורים שנכרתו אל תוך שכבת זהב באמצעות קרן יונים ממוקדת. עובי השכבה הוא 100 nanometers והיא נתמכת על ידי תשתית זכוכית.

החורים הננומטריים חופפים כדי ליצור שני שפיצים חדים. ננו-חלקיקים יילכדו במרווח שבין שפיצים אלו על ידי אור לייזר, הפוגע בחור הננומטרי הכפול.

יש לכרסם בסרט המתכת גם סימני רישום גדולים כדי לסייע בזיהוי מיקום החורים הננומטריים הכפולים במיקרוסקופ האופטי. יש למקם סימנים אלו במרחק של כ-100 microns מהחורים הננומטריים הכפולים. שפכו 10 grams של poly dimethyl suboxane או בסיס PDMS וגרם אחד של סוכן ריפוי לכוס חד-פעמית. ערבבו במשך מספר דקות.

לאחר מכן, בצעו ריקום של התערובת בתא ואקום עד להסרה מלאה של כל הבועות. לאחר מכן, שפכו 1.5 grams של PDMS לתוך צלחת פטרי בעלת קוטר של תשעה סנטימטרים. בצעו ציפוי סבב (spin coat) של ה-PDMS על קרקעית צלחת הפטרי במהירות של 950 RPM למשך 65 שניות לאחר תחילת הסיבוב.

העובי אינו קריטי כל עוד הוא נמוך מ-80 microns. הניחו בעדינות שלוש עד חמש זכוכית כיסוי מספר 1.5 על גבי ה-PDMS באופן שאינו חופף, ובצעו ריקום למשך 30 דקות.

אם במהלך הפינוא כיסויי הזכוכית החליקו והערמו אחד מעל השני, הסיטו אותם בעדינות זה מזה. וודאו ששכבת ה-PDMS מתחת לכיסויי הזכוכית נשארת דקה ואחידה. לאחר מכן, פנו שוב את צלחת הפטרי למשך 30 דקות.

הוציאו את צלחת הפטרי מתא הוואקום וחממו אותה על פלטה מחממת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 85 °C כדי להמיס את ה-PDMS. לאחר שה-PDMS התמצק, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך לאורך השוליים של אחת הזכוכיתים המכסות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה בעלת קצה דק או להב, הרימו בעדינות את הזכוכית; שכבה דקה של PDMS תיצמד לזכוכית המכסה.

הניחו את זכוכית הכיסוי עם ה-PDMS בתוך צלחת פטרי חדשה. לאחר מכן, בעזרת להב תער, גזרו חלון בגודל של שלושה מילימטרים על שלושה מילימטרים ב-PDMS. חלון זה יהווה את התא שבו יישמר תמיסת הננו-חלקיקים.

השתמשו בחיתוך לייזר כדי לייצר מחזיק לשקף מיקרוסקופ מאקריליק עם חור בקוטר שלושה רבעי אינץ' במרכזו. הדביקו את היקף החור באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי. השתמשו בלהב תער כדי להסיר שאריות סרט הדבקה מיותרות.

הנח את זכוכית המיקרוסקופ המוכנה על אחת לוחות הכיסוי המצופים ב-PDMS, כך שה-PDMS יהיה כלוא בין הזכוכית לאקריליק. באמצעות מיקרופיפט, הוסף מספר טיפות של תמיסת ננו-ספירות פוליסטירן בריכוז 0.05% weight per volume לחלון ה-PDMS.

הוסף טיפה על שכבת הזהב שבה נמצאים הננו-חורים. הנח את דגימת הזהב מעל לכיסויים (cover slips), כך שהננו-חורים יהיו בתוך חלון ה-PDMS. ודא שלא קיימות בועות בתא.

לאחר מכן, לחץ את דגימת הזהב כנגד המכסה. נגב בעדינות כל עודף של תמיס, כיוון שנעשה שימוש בעדשת שקיעה בשמן. הוסף טיפה של שמן בצדו השני של זכוכית המכסה, מעל חלון ה-PDMS.

שימו לב למיקום של חורי הננו. הכניסו את המיקרוסקופ. החליקו את השקופית אל תוך מחזיק השקופיות כאשר השמן פונה כלפי מטה, ולאחר מכן הורידו את מחזיק השקופיות עד ששמן השקיעה יבוא במגע עם המיקרוסקופ.

המטרה היא לבצע כיוון גס של במי הצעמידה כך שסימני הרישום שחורטו בסרט הזהב יהיו מתחת לעדשה. באמצעות תוכנה לרכישת תמונות כגון Thor site, הנכללת כחלק מערכת הלכידה, מצא את סימני הרישום על סרט הזהב ועקוב אחר קווי ההכוונה עד לחורי הננו.

מקם את השקופית כך שסימני ההכוונה ואזורים פתוחים אחרים יפנו ממרכז המסך. העברה מרובה של אור עלולה להזיק ל-A PD; הדלק את הלייזר. מכיוון שהמראה הדיכרואית אינה מושלמת, צריכה להופיע נקודה מקרן הלייזר בקרבת מרכז המסך.

השתמש בתוכנת הבקר של במת הפיזו. בצע כיוונון עדיף נוסף של היישור בכל שלושת הצירים. כאשר היישור יהיה נכון, ייצפה מתח PD מקסימלי, המעיד על העברה מרבית דרך הננו-מפתח.

כעת, לאחר שהמערכת הוגדרה והדגימה הוטענה, ניתן לאסוף נתוני לכידה אופטית. בעזרת סימני העזר, מקמו את הנקודה קרוב למיקום ידוע של ננו-חור. הננו-חורים הכפולים יהיו קטנים מדי מכדי שניתן יהיה להבחין בהם בבירור, והם יופיעו כנקודות קטנות על המסך.

העברת האור דרך הדגימה מודגשת על ידי רמת האות באוסצילוסקופ. כוון את הדגימה באופן נוסף כדי למקסם את העברת האור. היזהר מסימני זיהוי ומשריטות גלויות ובלתי גלויות, שכן העברת האור תהיה גבוהה באזורים אלו; חורים ננומטריים יגרמו לקפיצות פתאומיות בעברת האור, בעוד ששריטות יגרמו לשינויים הדרגתיים יותר.

בצעו שינויים הדרגתיים יותר באמצעות לוח הגלים. התאימו את קיטוב האור כדי להשיג את העברת האור הגבוהה ביותר, מכיוון שמבנה הננו-חורים הכפול הוא מקוטב. כדי לרכוש נתונים, דגמו את המתח של ה-APDs באמצעות מודול רכישת הנתונים למשך הזמן הרצוי.

זמני הרכישה הם בדרך כלל מאות שניות. במקרה זה, נעשה שימוש בתוכנה מותאמת אישית לרכישת נתונים, והמתח נדגם 2000 פעמים לשנייה. באמצעות MATLAB, סננו את הנתונים שנרכשו באמצעות מסנן KY Gole והציגו אותם מול הזמן בגרף כדי להראות לכידה של ננו-חלקיקי פוליסטירן בגודל 20 nanometer; התמסורה דרך הננו-חור הכפול נמדדה כפונקציה של הזמן.

לאחר מכן שורטט גרף של תמסורת אופטית ב-PD. לאורך זמן, אירוע הלכידה הוא פתאומי באופן אופייני עם קצה חד המראה מעבר ברור בין שתי רמות הספק של תמסורת כפי שמוצג בדוגמה זו; לעיתים קרובות חלה עלייה ברעש האות במצב הלכידה. עלייה זו ברעש נובעת מהתנועה בראונית של החלקיק הלכוד.

שימו לב כי ללא החלקיק הלכוד, מקור רעש זה אינו קיים. ייתכן שיופיעו בתוצאות ארטיפקטים שאינם מעידים על אירועי לכידה. יש להשמיט תוצאות המראות סחף המתבטא בשינויים איטיים בתמסירה לאורך פרק זמן של דקות, כפי שמוצג כאן. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Raman וספקטרוסקופיה פלואורסצנטית, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע למהות הננו-חלקיק הלכוד לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים ללמוד ננו-חלקיקים רלוונטיים ביולוגית ברמת המולקולה הבודדת. לדוגמה, כדי לזהות קישור חלבונים וללמוד זיהום נגיפי, שניהם ברמת המולקולה הבודדת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לשלב מלכודת אופטית כפולה של nho במערכת לייזר T של מיקרוסקופ הפוך לצורך לכידה של ננו-חלקיקים בודדים.