Name: Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב ג elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למדו כיצד לבצע readout מולקולרי להסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב-C. elegans באמצעות GFP-tagged EGL-4. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של לוקליזציה תת-תאית בנוירונים AWC לחקר פלסטיות חושית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לסקוט המילטון, וחברי המעבדה &#39;האלורן לקריאה מדוקדקת של כתב היד הזה. אנו מודים גם למבקר האנונימי שלנו לקבלת הצעות מצוינות והערות תובנה.

1. בנייה של ה-GFP תייגה EGL-4 בעלי חיים מבטאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט ההיתוך GFP translational :: EGL-4 תחת האמרגן לגן ODR-3 (שימוש 2678 נ&quot;ב ישירות במעלה זרם של קודון ההתחלה): (עמ &#39;) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 כונני אמרגן הביטוי בזוגות נוירון amphid: AWA; AWB; AWC; וחולשה באפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריק פלסמיד (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 לחי wildtype (N2) בגיל 50 ng / μl עם סמני הזרקה משותפת תוך שימוש בטכניקות ניבטה שורת טרנספורמציה סטנדרטיות 8: (עמ &#39;) הפרנציסקאני-1: : 9-GFP (25 ng / μl), ו( p) ODR-1 :: dsRed 10 (25 ng / μl). ODR-1 ביטוי אמרגן כוננים בזוגות AWB amphid נוירון AWC ו, וביטוי הפרנציסקאני-1 אמרגן הכוננים בcoelomocytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכפיף את בעלי החיים המהונדסים המבטאים את מערכי extrachromosomal המפורט בשלב 1.2 לסגולים (UV) / פרוטוקול האינטגרציה trimethylpsoralen (TMP)11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האקונומיקה לסנכרן את חי 12 ולטפח אותם על צלחות צמיחה נמטודות מדיה (NGM) המכילות OP50 E. coli לL4 הבמה. שטוף L4 חי מצלחות NGM עם M9 חיץ להסיר OP50 E. חיידקי קולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ M9 ולהוסיף 50-100 μl של 30 מיליליטר פתרון TMP עובד על תולעת הגלולה בצינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 מיקרוגרם /. עטוף את צינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 בנייר כסף כדי לחסום אור הסביבה, ולהתסיס בעדינות על כתף במשך 15 דקות בצינור microcentrifuge העטוף בנייר האלומיניום 1.5 מ&quot;ל. להעביר את התולעים בפתרון TMP / תולעת לצלחת NGM unseeded גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את התולעים בצלחת NGM לUV 350 μJ (x100) באמצעות 2400 Stratalinker. ואז להוסיף תולעים לצלחת NGM OP50 מכילה ודגירה בחושך במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 50 תולעים מהונדסים לכ 10 צלחות seeded (2-5 תולעים כל צלחת). העברת P0 זה לצלחות חדשות בכל שעות 24 במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק F1 משובט 250nimals (חיה 1 לכל צלחת). לשכפל את חי 2-4 F2 מכל צלחת F1. בדקו חי F3 כדי לחפש 100% קו הולכה מלהסתכל (עמ &#39;) הפרנציסקאני-1 :: דפוס ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Outcross קו הגמר המשולב (הים) עם בעלי חי N2 wildtype 5 פעמים. אנחנו נתייחס לקו המשולב הסופי כpyIs500, ו- 4 EGL מולקולת GFP מתויג כ- GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. טיפוח ותחזוקה של בעלי חיים למבחנים טרנסלוקציה גרעיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את pyIs500 החיות ב 25 ° C על 10 צלחות NGM סנטימטר הסטנדרטי (ראה בהמשך למתכון) seeded עם OP50 E. החיידק אשריכיה קולי 13 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, לקחת 4-5 L4 pyIs500 חיות מצלחות מעובדות ב 25 ° C על חמישה 10 סנטימטרים נפרדים OP50 E. coli נזרע צלחות ולדגור על 25 מעלות צלזיוס (כלומר, 4-5 L4 חיות לצלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לשטוף מבוגרים עמopulations של pyIs500 חי מהצלחות NGM הגדולות באמצעות חיץ S-Basal (ראה בהמשך למתכון). השתמש pipettes זכוכית חד פעמי להעברת בעלי חיים, כפי שהם יידבקו לצד טיפי פיפטה פלסטיק. </li></ol> 3. מבחני טרנסלוקציה גרעיני ריח לטווח ארוך מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את pyIs500 החיות 3 פעמים ב- Basal S כדי להסיר חיידקים. אל סרכזת חיות בין כביסות, אלא לאפשר לבעלי החיים להתיישב על ידי הכח הכביד בצינור microcentrifuge נייח 1.5 מ&quot;ל. זה קריטי כדי להבטיח את כל החיידקים הוסרו, וכי פאטה NGM חופשי מזיהום, כשיירי חיידקים ישפיעו לרעה על תוצאותיה של בדיקת טרנסלוקציה. כמו כן, מצאנו כי מעוקר של 1.5 צינורות מיליליטר microcentrifuge מייצר רכוש &quot;דביק&quot; על הקירות הפנימיים של הצינור שגורם לבעלי חיים כדי להיצמד לצדדים, ואז להשתמש בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge הלא autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בעלי חיים ליישב בין כביסות, איפור לאהוא התאמת פתרון. הוסף 100 מ&quot;ל של חיץ S-Basal לצילינדר לימודיו 100 מ&quot;ל. הוסף להתאים ריח ל- S אסאל ולאטום את הגליל באמצעות רצועה של Parafilm. אם ביצוע התאמת benzaldehyde להוסיף 7.5 μl של benzaldehyde עד 100 מ&quot;ל של-S אסאל, להסתגלות butanone להוסיף 11 μl של 2-butaone עד 100 מ&quot;ל של-S אסאל. בעדינות להפוך (לא לנער) הגליל סיים המכיל S-בסיס וריח פי 30 כדי ליצור אמולסיה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את בעלי החיים כדי להתיישב ולהסיר את כל הנוזלים. צינור תווית 1 &quot;+ יש&quot; או &quot;להתאים&quot; וצינור &quot;יש&quot; או &quot;unadapt&quot; האחר. ואז להוסיף 1 מ&quot;ל של תערובת ההסתגלות לצינור microcentrifuge ההסתגלות (+ יש), ולהוסיף 1 מ&quot;ל של-Basal S לצינור microcentrifuge שליטת unadapted (-VE). נסה לשמור על מספר בעלי החיים בין 100 ל 200 בכל צינור. בעזרת תרגול מסוים, ניתן להעריך את המספר המשוער של בעלי חיים בגלולה על ידי עין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צינור כובע מגןלכל צינור (מונע מעפעפיים פתוחים popping) ולמקם את הצינורות במסובב ל80 דקות. מצאנו כי חשיפת ריח בין 60 דקות ו 80 דקות מניבה תוצאות דומות (שניהם התוצאה בתגובות הסתגלות לטווח ארוך). עם זאת, 80 דקות חשיפה מספקת תוצאות עקביות יותר בידות שלנו. לכן כל מבחני ההסתגלות ארוך הטווח שלנו הם טופלו באמצעות חשיפת ריח דקות 80 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 80 דקות, לשטוף את החיות 3 פעמים ב- S אסאל. אפשר חיות להתיישב על ידי כוח המשיכה בין כל שטיפה. </li></ol> 4. מבחני טרנסלוקציה גרעיניים קצר טווח ריח מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ריח הסתגלות לטווח קצר, השתמש באותו פרוטוקול של מבחנים לטווח ארוך-Induced ריח טרנסלוקציה (צעדים 3.1-3.4), לעומת זאת, במקום דוגר את pyIs500 חיות בהתאמת ריח ל80 דקות, השתמש חשיפת 30 דקות . כימות של מבחני טרנסלוקציה גרעיניים ריח מושרים מפורטים להלן (שלב 5) היא זהה לטווח ארוך וקצר terחשיפות מ. </li></ol> 5. בקיע אירוע טרנסלוקציה הגרעיני ריח המושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך רפידות המכילות 2% agarose יזיד הנתרן mM 5 (3 NaN) על ידי המסת ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose בDH 2 0. הנח טיפה אחת של agarose המותך המכילה 3 NaN בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מייד למקם את שקופית מיקרוסקופ עוד כוס בשקופית הראשונה לשטח טיפת agarose המותך. השאר למשך 30 שניות, ואז בעדינות להקניט מלבד מיקרוסקופ מחליק עוזב שקופית מיקרוסקופ אחד עם משטח שטוח של agarose ~ 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את התולעים להתיישב בצינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 ולהסיר את כל הנוזלים. ואז להוסיף את החיות החכמות שחרר את הכריות על agarose של כמה שקופיות מיקרוסקופ. זה חשוב כדי לשמור את מספר בעלי חיים לכל שקופית לבין 50 ל 100. בעלי חיים רבים מדי לכל שקופית יסבכו את הניקוד ולעתים קרובות ליצור זוהר פיזור לאחר עירור אור כחול. נוזל עודף רשאילהיות רשע מagarose המשטח באמצעות קטן קים-לנגב. הנח זכוכית 0.5 מ&quot;מ כיסוי החלקה על המשטח ולתת לעמוד ל2 דקות כדי לאפשר ל3 NaN, כדי לשתק את בעלי החיים. שים לב, בעלי חיים יכול להיות התאושש מהשקופיות לאחר ניקוד. בעלי החיים יתאוששו מNaN 3 ההרדמה לאחר שעות ~ 1 אם הועברו לצלחת NGM seeded לירידה של מאגר M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו הוא הכרחי כי כל ניסוי להמציא מפתח כדי לעקוב אחר איזו שקופית היא ניסיונית השקופית (+ יש) ואיזו שקופית הוא השליטה (-ve) שקופית, ולהעביר את השקופיות לאדם אחר שיהיה עיוור להבקיע GFP: 4-EGL דפוס לוקליזציה. זה יהיה לשלוט על כל הטיות נסיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון בין 50 ל 100 חיות לכל שקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם יעדי גדלה 10x, 40X ו63X ומסנני GFP / RFP. ראשית, אתר חיות בהגדלת 10X באמצעות תאורה בהירה שדה. שנית, אתר נוירון AWC ידי כיבוי brighתאורת t-תחום ובאמצעות RFP המסנן. את (p) ODR-1 :: כונני dsRed ביטוי בשטרי מטען ונוירונים AWC. הנוירונים AWC יש גופי תא ייחודיים סגלגלים בצורה בהשוואה לגופי תא AWB שהם קטנים ומעוגלים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגוף התא AWC כבר נמצא, לעבור לGFP המסנן ולהקליט הלוקליזציה של ה-GFP: EGL-4 כגרעיניים או cytoplasmic. שימוש בדלפק מאפשר הנסיינית להמשיך לחפש לעיני בעוד בקיע השקופית. הערה: 5.1-5.5 צעדים הם חוזרים לפחות 3 פעמים בימים נפרדים להפקת נתונים סטטיסטיים משמעותיים (איורים 1-2). </li></ol> 6. ניטור GFP-tagged EGL-4 במהלך השחזור מהסתגלות ריח לטווח הארוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב 3.5, לחלק את האוכלוסיות של בעלי חיים לpyIs500 aliquots המרובים וציון לGFP הגרעיני לעומת cytoplasmic :: EGL-4 בAWC בנקודת אפס זמן (כלומר, לאחר חשיפה דקה 80) ומטרנקודתי ultiple עוקבות בזמן (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר גם את השליטה (-VE) וניסיוניות חיות (+ יש) באמצעות pipettes זכוכית חד פעמי על צלחות NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חיות להתאושש לאורכים שונים של זמן והלוקליזציה לבחון מחדש של ה-GFP :: EGL-AWC 4in בכל נקודת זמן כמו בשלבים 5.1 עד 5.5. </li></ol> 7. חומרים צלחות NGM: עבור 1 ליטר להוסיף עד 1 ליטר DDH 2 0: 21 Bacto-אגר גרם, 3 גרם כלוריד הנתרן (NaCl); 2.5 גרם Bacto-Peptone. מדיה חיטוי. לאחר מעוקר, המגניב אגר עד שהטמפרטורה קוראה 54 ° C. הוסף את הפתרונים הבאים: מאגר 25 מ&quot;ל 1M אשלגן פוספט; 1 סולפט מ&quot;ל 1 ז מגנזיום (MgSO 4); 1 כלוריד מ&quot;ל 1 ז סידן (CaCl 2); כולסטרול 1 מ&quot;ל באתנול (5 מניות מ&quot;ג / מ&quot;ל). 1 ז Dibasic K 2 HPO 4 174.2 g / mol: עבור 500 מ&quot;ל: 400 מ&quot;ל בDDH 2 O, להמס 87.1 גרם Dibasiג K 2 HPO 4. התאם נפח 500 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ&quot;ל. 1 ז Monobasic KH 2 PO 4 136.1 g / mol: עבור 1 ליטר: 800 מ&quot;ל בDDH 2 O, לפזר 136.1 גרם Monobasic KH 2 PO 4. התאם נפח 1 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ&quot;ל. פוספט אשלגן 1 ז (3 K PO 4) 6.0 pH Buffer: עבור L 1: ביחידת סינון סטרילי 1 ליטר, 868 מ&quot;ל להוסיף M Monobasic KH 1 2 PO 4. אפשר לסנן הדרך יחידה, ואז מוסיף 132 מ&quot;ל של 1 M Dibasic K 2 HPO 4. אפשר יחידה כדי לסנן את כל הנוזלים. הסר יחידת סינון ולהתאים את רמת חומציות עד 6.0. לאחסן בטמפרטורת חדר. S-Basal: עבור L 1: להוסיף 50 1M 3 4 הצפת מיליליטר K PO, pH ~ 6.0; ו5M המ&quot;ל NaCl aq 20. מלא ל1 ליטר עםDDH 2 O. חיטוי פתרון. M9: עבור 1 ליטר: 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 מ&quot;ל 1 ז 4 MgSO, H 2 O. מלא ל1 ליטר עם DDH 2 0. לעקר ידי מעוקר.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515(1993).</li>
<li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li>
<li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016(2010).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).</li>
<li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li>
<li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314(1999).</li>
<li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575(2000).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451(1995).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson%27s+Disease+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835(2008).</li>
<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכניסה הגרעינית ריח המושרית של EGL-4 מולקולת ה-GFP-tagged המתואר כאן מספק readout מולקולרי חזק של הסתגלות חוש ריח בג elegans. מבחני טרנסלוקציה הגרעיניים ריח המושרים הם פשוטים ודורשים רק כמה ימים ארוכים של הכנה. PyIs500 החיה שבנינו עבור מבחנים אלה, מבטאת את סמן שמאיר את הנוירון AWC כמו גם מבטא את חלבון ה-GFP מתויג-EGL-4. לפיכך, אנו סבורים כי ניסוי עם מעט ניסיון בעבודה עם המעמד הזה של נוירון יכול מהר מאוד (אולי לאחר שבחן כמה עשרות בעלי חיים) מתחיל להרגיש בנוח זיהוי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> פישר כימי </td><td> S671-10 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> אשלגן זרח Dibasic </td><td> פישר כימי </td><td> S375-500 </td><td> חיץ S-Basal וצלחות NGM </td></tr><tr><td> אשלגן זרח Monobasic </td><td> פישר כימי </td><td> P285-500 </td><td> חיץ S-Basal וצלחות NGM </td></tr><tr><td> Kimwipes - קטן </td><td> קימברלי קלארק </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול 100% </td><td> זהב מגן כימיושות </td><td> 43196-115 </td><td> ריחות דילול עבור מבחני Chemotaxis </td></tr><tr><td> כלוריד סידן </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C8106-500G </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> יזיד הנתרן 99% </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> ICN10289180 </td><td> חומר מרדים </td></tr><tr><td> Agarose - ultrapure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> רפידות agarose </td></tr><tr><td> Benzaldehyde </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> B1334-100G </td><td> ריח AWC </td></tr><tr><td> Butanone, ACS כיתה </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 360473-500 מ&quot;ל </td><td> ריח AWC </td></tr><tr><td> צינורות microcentrifuge - 1.5 מ&quot;ל צבעוני </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> 5-3/4 פסטר Pipet פנויים זכוכית &quot; </td><td> הפישר סיינטיפיק </tד&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> שילוב UV </td></tr><tr><td> בקבוק ריק מסנן - 500 מ&quot;ל </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

במהלך גירוי מתמשך נוירונים החושיים ביותר יהיה להתאים את תגובתם על ידי הפחתת רגישותם לאות. תגובת ההסתגלות מסייעת תשומת לב צורה וגם מגנה על תאים מגירוי יתר. הסתגלות בתוך מעגל חוש הריח של ג elegans תואר לראשונה על ידי קולבר וBargmann 1,2. הנה, החוקרים הגדירו פרמטרים של הפרדיגמה הסתגלות חוש הריח, שהם משמשים לעיצוב מסך גנטי לבודד מוטנטים פגומים ביכולתם להסתגל לריחות נדיפים חשו על ידי התאים מסוג C (AWC) נוירונים אגף Amphid החושיים. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש 3 למשך 30 דקות הם יתאימו את היענותם לריח ואז יהיה להתעלם מריח ההתאמה בבדיקה התנהגותית chemotaxis ל~ 1 שעה. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש ל~ 1 שעה ואז הם יוכלו להתעלם מהריח בהתאמת acבדיקה התנהגותית hemotaxis ל~ 3 שעות. שני שלבים אלה של הסתגלות חוש ריח בג elegans תואר כהסתגלות קצרת טווח הרחה (מושרה לאחר חשיפת ריח דק 30), והסתגלות הרחה ארוכת טווח (הנגרם לאחר חשיפת ריח דק 60). מאוחר יותר לעבוד מאטואל et al., 4 חשפו חלבון קינאז G (pkg) נקרא EGL-4 שנדרש עבור שניהם הסתגלות הרחה קצרת טווח וארוך טווח בנוירונים AWC. EGL-4 החלבונים מכילים רצף לוקליזציה גרעיני שהוא הכרחי לתגובות ארוכות טווח הרחת הסתגלות אך dispensable לתגובות הסתגלות הרחה קצרת טווח ב4 AWC. על ידי תיוג EGL-4 בחלבון פלואורסצנטי ירוק, אפשר היה לדמיין את הלוקליזציה של EGL-4 בAWC במהלך חשיפה הממושכת ריח. שימוש הפונקציונלי מלא זה GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) מולקולה הצלחנו לפתח readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח ארוך ב5 AWC. שימוש מ &#39;זהreadout olecular הסתגלות הרחה היינו מסוגל לבצע שני מסכים גנטיים קדימה לאחור כדי לזהות בעלי חיים מוטנטים כי תערוכה פגומה דפוסי subcellular לוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4 ב6,7 AWC. כאן אנו מתארים: 1) הבנייה של ה-GFP :: EGL-4 חיות מבטאות, 2) הפרוטוקול לגידול של בעלי חיים למבחני טרנסלוקציה ריח מושרה גרעיניים לטווח ארוך, ו3) הניקוד של הטווח ארוך הריח המושרה אירוע גרעיני טרנסלוקציה והתאוששות (מחדש רגישות) מGFP הגרעיני :: מדינת EGL-4.

דוגמה לדפוס הלוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4in AWC לפני ואחרי חשיפה ממושכת ריח מוצגת באיור 2. לפני החשיפה ממושכת ריח, GFP :: EGL-4 הוא מקומי לcytosol של AWC (איור 2 ב &#39;), ולאחר 80 דקות ריח החשיפה GFP :: EGL-4 הם מקומי לגרעין של AWC (האיור 2D). ברמת ההתנהגותית, חיות עם cytosolic GFP :: EGL-4 בAWC נמשכות לנקודת מקור של ריח (האיור 2C גרפי נציג תוצאות ממבחני Chemotaxis של חי unadapted - לב מדד chemotaxis 3 ...

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt;. קינאז G, EGL-4, החלבון הוא הכרחי לתגובות הסתגלות יציבות בזוג נוירון החושי הראשוני נקרא AWC. במהלך-4 EGL translocates הממושך ריח מהחשיפה cytosol לגרעין של AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

במהלך גירוי מתמשך, רוב הנוירונים התחושתיים יתאימו את תגובתם על ידי הפחתת הרגישות לאות. תגובת ההסתגלות מסייעת...

המטרה הכללית של סרטון זה היא לפרט את הפיתוח והיישום של קריאה מולקולרית של הסתגלות ריחית ארוכת טווח בתולעי C. elegans המתארת את מצב ההסתגלות של בעל החיים. דבר זה מושג על ידי תיוג של protein kinase G הנקרא egg L four במולקולת חלבון פלואורסצנטי ירוק והבעה של חלבון היתוך זה בתאי amphi wing מסוג C או בנוירוני A WC. כשלב שני, בעלי חיים המבטאים את הגרסה של egg L four המתויגת ב-GFP בנוירוני A WC גודלים על מצעי nematode growth media המכילים את מקור המזון הבקטריאלי OP 50. לאחר ארבעה ימים, אוכלוסיית בעלי חיים נשטפת מלוחיות הגידול ונחשפת לריח המזוהה על ידי A WC למשך 80 דקות, וזאת כדי לעודד הסתגלות ריחית ארוכת טווח.התוצאות מראות לוקליזציה גרעינית של ALE4 מתויג ב-GFP ב-AWC של בעלי חיים שעברו הסתגלות, לעומת מיקום ציטופלזמי של ALE4 מתויג ב-GFP בבעלי חיים של קבוצת ביקורת שלא עברו הסתגלות. על ידי יצירת עותק תפקודי של ALE4 המחובר לחלבון פלואורסצנטי ירוק, אנו יכולים לעקוב אחר הלוקליזציה התת-תאית של ALE4 ב-AWC ולתאר את המצב ההתנהגגותי של בעלי החיים על סמך לוקליזציית ה-GFP. כלי מולקולרי זה מאפשר לנו לחקור במהירות את תפקידם של מוטציות או טיפולים שונים בעיצוב הפלט התאי לאחר גרייה נוירונלית ממושכת.פרוטוקול זה מתחיל ביצירת בעלי חיים המבטאים את המולקולה egg L four המסומנת ב-GFP, כפי שמתואר בהליך הכתוב הנלווה לסרטון זה. השושלת המשולבת הסופית מכונה IS 500 והמולקולה egg L four המסומנת ב-GFP מכונה GFP egg L four. גדלו את בעלי החיים מסוג IS 500 בטמפרטורה של 25 °C על פלטות NGM סטנדרטיות של 10 סנטימטרים, הזרועות בחיידקי E. coli מסוג OP 50. ביום הראשון, העבירו ארבעה עד חמישה בעלי חיים מסוג IS 500 בשלב לרוב cuarto (larval stage four) מפלטות שגודלו ב-25 °C אל פלטות של 10 סנטימטרים הזרועות ב-E. coli OP 50, זאת באמצעות תיל פלטינה קטן המכונה "pick" כדי לאסוף ולהעביר את בעלי החיים.חזור על פעולה זו עבור ארבעה מצעים נוספים. דגרי את המצעים בטמפרטורה של 25 °C ביום הרביעי. שטוף את אוכלוסיות הבוגרים של בעלי חיים מסוג IS 500 מהמצעים הגדולים של NGM על ידי הוספת basal buffer למצע וסיבוב עדין.פעולה זו מנתקת את בעלי החיים ממשטח הצלחת ומעבירה אותם אל תמיסת הבאפר. בעזרת פיפטות זכוכית חד-פעמיות, שאבו את בעלי החיים מהצלחת והעבירו אותם לשפופרת epinephrine בנפח 1.5 milliliter. התחילו את בדיקות התעתוק על ידי שטיפת 500 בעלי החיים ב-s basil להסרת חיידקים; אין לבצע סבוב במצנטריפוגה.בעלי חיים בין השטיפות. במקום זאת, אפשרו לבעלי החיים לשקוע באמצעות כוח הכבידה בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה נייחת בנפח 1.5 milliliter. קריטי להבטיח שכל החיידקים הוסרו ושפלטות NGM נקייה מזיהומים, שכן שאריות של חיידקים ישפיעו לרעה על תוצאות מבחן התעתוק (translocation assay).חזור על השטיפה עם S basil פעמיים. הכן את תמיסת ההסתגלות על ידי הוספת 100 milliliters של S basil buffer למשורה של 100 milliliters. אם מבצעים הסתגלות לאלדהיד, הוסף 7.5 microliters של אלדהיד ל-100 milliliters של ESP basil ואטום את המשורה באמצעות רצועת פאראפילם.הפוך בעדינות את המשורה המכילה את ה-basil וה-odor כ-30 פעמים. כדי ליצור אמולסיה אחידה, הוסף בעלי חיים לכל מבחנה תוך ניסיון לשמור על מספר בעלי חיים שבין 100 ל-200 בכל מבחנה. עם מעט תרגול, ניתן להעריך את מספר בעלי החיים המשוער בתוך הפלטה באופן חזותי לאחר שהם שקעו.לאחר שטיפת S basil, הסירו את כל הנוזל משפחור ה-epi orph. סמנו שפחור חדש אחד כחיובי ואת השפחור החדש השני כשלילי. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תערובת ההסתגלות לשפחור המיקרו-צנטריפוגה להסתגלות החיובית, והוסיפו 1 mL של S basil לשפחור המיקרו-צנטריפוגה של ביקורת השלילית שאינה מותאמת. הצמידו מגן מכסה לשפחור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL לכל שפחור, והניחו את השפחורים על רוטטור למשך 80 דקות.לאחר 80 דקות, שטפו את החיות שלוש פעמים ב-S basil, ואפשרו לחיות לשקוע בכבידה בין שטיפה לשטיפה. הכינו פדי 2%aros המכילים sodium azide בריכוז five millimolar על ידי המסת gel electrophoresis aros. במים מזוקקים, הניחו טיפה אחת של mol ו-aros המכילים sodium azide על סלייד זכוכית למיקרוסקופ, והניחו מיד סלייד זכוכית נוסף על הסלייד הראשון כדי להשטיח את טיפת ה-agros המומסת.המתינו 30 שניות ולאחר מכן הפרידו בעדינות את תיתורי זכוכית המיקרוסקופ, כך שתישאר על כל תיתור שכבת aros שטוחה בעובי של כמילימטר אחד. בשלב זה, חיוני שכל ניסוי יקבע שיטת סימון כדי לעקוב אחרי התיתורים המשמשים לניסוי החיובי ואלו המשמשים כביקורת שלילית. לאחר שהתולעים שקעו בעקבות השטיפה הסופית ב-as basil, הסירו את כל הנוזל, ולאחר מכן הוסיפו את החיות בטפטוף אל פדי ה-aros על מספר תיתורי מיקרוסקופ.חשוב לשמור על מספר בעלי חיים לכל סלייד בטווח שבין 50 ל-100. מספר רב מדי של בעלי חיים לסלייד יסבך את הדירוג ולעתים קרובות יצור זוהר מפוזר. לאחר עירור באור כחול, ניתן לספוג נוזל עודף מפד ה-aros באמצעות נייר ניגוב kim קטן.הניחו כיסוי זכוכית בעובי 0.5 millimeter על הפד והמתינו שתי דקות כדי לאפשר לסודיום אזיד להקיא את בעלי החיים. לאחר מכן, העבירו את השקופיות לאדם אחר שיבצע דירוג עיוור של תבנית הלוקליזציה של GFP egg L four. הדבר ישמש כשליטה למניעת הטיות בניסוי; דרגו בין 50 ל-100 בעלי חיים לכל שקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם עדשות הגדלה של 10x, 40x ו-63x ומסנני G-F-P-R-F-P.ראשית, אתרו את בעלי החיים תחת הגדלה של 10x באמצעות תאורת שדה בהיר (brightfield). שנית, אתרו את נוירון ה-A WC על ידי כיבוי תאורת השדה הבהיר ושימוש במסנן RFP. הפרומוטור odor.עותק אחד של DS red מניע ביטוי בנורונים של WB ושל A WC. לנורוני A WC יש גופי תא בעלי צורה אובלית מובחנת בהשוואה לגופי תא של WB, שהם קטנים יותר ובעלי צורה מעגלית. לאחר איתור גוף התא של A WC, עברו למסנן GFP ותעדו את מיקומו של GFP egg L four כגרעיני או ציטופלזמי.שימוש במונה מאפשר למנסה להמשיך להביט בעינית תוך כדי דירוג הפריסה. תהליך זה חוזר לפחות שלוש פעמים בימים נפרדים כדי להפיק נתונים בעלי מובהקות סטטיסטית. דוגמה לתבנית הלוקליזציה של GFP egg L four ב-A WC לפני ואחרי חשיפה ממושכת לריח מוצגת לפני החשיפה הממושכת לריח.GFP egg L four ממוקם בציטוסול של ה-A WC לאחר 80 דקות של חשיפה לריח. GFP egg four ממוקם בגרעין של ה-A WC ברמה ההתנהגותית. בעלי GFP egg four ציטוסולי ב-WC נמשכים למקור ריח נקודתי.גרף זה הפיק מתוצאות מייצגות של בדיקות כימוטקסיס של בעלי חיים שאינם מותאמים. שימו לב כי מדד ה-CHEMOTAXIS קרוב לאחד. בעלי חיים המבטאים GFP נוקלארי ב-A WC אינם נמשכים למקור נקודתי של הריח המותאם.גרף זה הופק מתוצאות מייצגות של בדיקות CHEMOTAXIS בבעלי חיים מאומצים. שימו לב כי מדד ה-CHEMOTAXIS קרוב לאפס. ברגע ש-egg L four חודר לגרעין של נוירוני A WC, הוא גורם לשינויים יציבים וארוכי טווח בפיזיולוגיה של A WC, אשר נשמרים גם כאשר egg L four אינו נמצא יותר בגרעין.לאחר 80 דקות של חשיפה לריח, בעלי החיים יתעלמו ממקור נקודתי של הריח המותאם, והסתגלות זו תישמר גם לאחר 120 דקות של התאוששות. לאחר 80 דקות של חשיפה לריח, GFP Egle four נצפה בגרעין של ה-A WC. כניסה זו לגרעין היא הכרחית ומספיקה כדי להשרות הסתגלות ארוכת טווח ב-A WC. לאחר 120 דקות של התאוששות, בעלי חיים אלו אינם מראים עוד GFP Eagle four גרעיני, אך עדיין יתעלמו ברמה ההתנהגותית ממקור נקודתי של ריח האלדהיד המותאם, לא כולל זמני תרבית.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כהלכה.

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

כאן אנו מתארים את שיטות הבדיקה C. elegans למידה אסוציאטיבי זיכרון אסוציאטיבי קצר לטווח ארוך. אלה מבחני האוכלוסייה להעסיק את היכולות תולעים chemotax כלפי odorants נדיפים, וליצור אסוציאציות חיוביות על זיווג עם מזון butanone chemoattractant. הגדלת מספר תקופות מיזוג גורם זיכרון לטווח ארוך.

סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

בעקבות חשיפה לגורמי לחץ סביבתיים ספציפיים, הנמטודה Caenorhabditis elegans עוברת פלסטיות פנוטיפית נרחבת כדי להיכנס לשלב נעורים 'דאואר' עמיד ללחץ.  אנו מציגים שיטות לאינדוקציה מבוקרת והדמיה של נוירופלסטיות במהלך דאואר.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

פיתחנו בעבר פרוטוקולים עבור Caenorhabditis elegans ליצירת זיכרונות אסוציאטיביים לטווח קצר וארוך על ידי אימון המוני ומרווח, בהתאמה. כאן מתוארים פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע.

למידה אסוציאטיבית מרתיעה ויצירת זיכרון על ידי זיווג שני כימיקלים ב- Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת למידה אסוציאטיבית על ידי ביצוע התניה קלאסית באורגניזם המודל C. elegans. הפרדיגמה מבוססת על זיווג ריכוז המלח בסביבה עם נוכחות או היעדר מזון, מה שמשנה את הכימוטקסיס שלהם לכיוון המלח או הרחק ממנו.

מדידת למידה אסוציאטיבית בכימוטקסיס של הנמטודה Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

מחסום משמעותי לחקר הפעילות התאית במהלך תהליכים קוגניטיביים כמו למידה וזיכרון הוא השימוש בחומרי הרדמה להכנת הדמיה in vivo . הרדמה פוגעת בזיכרון לטווח קצר ובקוגניציה במספר מודלים, כולל דרוזופילה. מחקר זה מציג שיטה ייחודית להכנת דרוזופילה בוגרת להדמיה in vivo ללא הרדמה.

ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת

למדו כיצד לבצע readout מולקולרי להסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב-C. elegans באמצעות GFP-tagged EGL-4. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של לוקליזציה תת-תאית בנוירונים AWC לחקר פלסטיות חושית.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב

גלה סרטונים נוספים