Name: כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו הכנת פרוסות רשתית דקות מסלמנדרה טיגריסית מימית לרישום תאים שלמים בו זמנית מקולטני אור ותאי אופק וביפולריים. שיטה זו מאפשרת חקר עיבוד סינפטי ברשתית עם חיבורים סינפטיים ללא פגע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מחקר למניעת עיוורון ומכונים הלאומי לבריאות מענק EY10542.

1. הכנת פרוסות רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא (עיצוב באיור 1). מקום שני אגלי שומן ואקום, במרווחים ~ 8-10 מ&quot;מ זו מזו, על פני חדר ההקלטה ליצירת ערוץ לsuperfusate ושבו כדי להטביע את פרוסות הרשתית. הוסף שני חרוז של שומן כמה מילימטרים רחוקים יותר מעבר לכל אחד משני אגלי שומן אלה לפעול כסכר וגלישת גבול. מניחים חתיכה קטנה של KimWipe משולשת בקצה של החדר, כדי להבטיח מגע עם נוזל אלקטרודה ההשוואתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פיסת קרום nitrocellulose (~ 5 x 10 מ&quot;מ; 0.8 נקבוביות מיקרומטר) שטוח על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית לשני חרוזים קטנים של שומן ואקום. יש להימנע מלמקם גריז ישירות מתחת למרכזו של קרום nitrocellulose, כמו זה יכול למנוע את הרשתית מהדבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מבצע הרקמות, לשבור את סכין גילוח קצה כפול ל -4 חתיכות ולצרף אחד לזרועות חיתוך. לחתוך פרוסה דקה של nitrocellulקרום OSE כדי להבטיח שחוד החנית של סכין הגילוח מניח שטוח נגד תא ההקלטה ולכן חותך צורה נקיה דרך קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כוס קטנה של תמיסת מלח דוחי (טבלת 1) על קרח בתחנה לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים סלמנדרה על ידי עריפת ראש. Hemisect ראש sagitally ושעם דרך חוט השדרה. מחצית במקומו של הראש על פיסת צמר גפן טבולה בתמיסת מלח דוחי על גבי בלוק הלינוליאום. החצי השני של הראש יכול להיות עטוף במגבת נייר לחה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר באותו היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העין. בעזרת מספריים Vannas קטנים, לחתוך את העור המחבר את העין למסלול הסובב. לאחר שחרור הקדמי של העין מהרקמה מסלולית שמסביב, מושך את העין קדימה והחלק את המספריים מתחת לעין כדי לחתוך את שרירי העין ואת עצב ראייה, לשחרר את העין ממסלולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין enucleated על מצע של צמר גפן עלבלוק. הלינוליאום מחק את מחצית הראש. Trim שומן מסלולית עודף מהחלק האחורי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן במרכזה של קרנית עם להב כירורגי חד. הסר את הקרנית על ידי הזזה מספריים Vannas עדינים לתוך החתך והארכת לחתוך רדיאלית החוצה לכיוון serrata האורה. חותכים circumferentially סביב serrata האורה על ידי ההחלפה של הבלוק לינולאום או הכותנה בין קיצוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיתוך כל הדרך סביב העין, להסיר את הקרנית ואת העדשה על ידי משייכתם מהצד של עיינית. הזז את עיינית התוצאה על משטח קשה של גוש הלינוליאום טבולה בתמיסת מלח האמפיביים. לחתוך אותו לשלישים עם סכין גילוח חד בתנועות ניסור עדינות, כדי להבטיח שיש לך לחתוך את כל הדרך דרך לובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד או שתי חתיכות של עיינית על קרום nitrocellulose עם פני שטח הרשתית פונות כלפי מטה. להטביע את החתיכות שנותרו עם מי מלח נוסף ומניח אותם במקרר ב~ 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גהntly לחץ על פיסת עיינית נגד קרום nitrocellulose עם מלקחיים עדינים. להטביע את קרום nitrocellulose וחתיכת עיינית עם כמה טיפות של מי מלח קר ודוחים כתם בקצוות עם KimWipe לעזור הרשתית לדבוק. שוב, להטביע את עיינית וקרום nitrocellulose עם כמה טיפות של תמיסה מי מלח קר דוחי ולקלף את האפיתל לובן העין / דמית העין / רשתית פיגמנט לבודד את הרשתית (שיכול להופיע ורוד בשל נוכחותם של rhodopsin מולבן). במידת צורך, לחתוך את עצב הראייה לשחרר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרשתית אינה דבקה בחוזקה, להתנקז המלוחים עם Kimwipe למשוך את הרשתית למטה יותר בחוזקה על קרום nitrocellulose. החלף את תמיסת מלח. חזור, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את התא עם מי מלח דוחי קר ולהעביר אותו לשלב של מבצעה הרקמה. פורסים את הרשתית וקרום nitrocellulose לרצועות דקות, עבודה מקצה אחד לקצה השני על ידי סיבוב מיקרומטר רניהבמרווחים של 125 מיקרומטר. לחץ על סכין הגילוח בעדינות אך בתקיפות דרך הרשתית וקרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פרוסות רשתית על ידי הזזת רצועות של קרום nitrocellulose לערוץ הראשי של חדר ההקלטה. הרם רצועה של קרום חופשי ולאחר מכן להחזיק אותו במקום בעת הזזת החדר מתחתיו, להיות בטוח כדי לשמור את הפרוסות מתחת למים. הטמע את הקצוות של קרום nitrocellulose ברצועות שומן ואקום, מסתובב להם 90 מעלות כדי להציג את שכבות הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ שטוחות קרום nitrocellulose כנגד משטח הזכוכית. גם אם יש לא רשתית על כל פיסה, רצועות מקום של קרום nitrocellulose במרווחי זמן קבוע (~ 1 מ&quot;מ זה מזה) לאורך כל אורכו של ערוץ זלוף כדי לעזור לשבור את מתח הפנים ולשפר את זרימת נוזל. </li></ol> 2. כל תא הקלטות לזווג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל את הפרוסות הועברו, להזיז את תא ההקלטה לשלב של זקוף, קבועהמיקרוסקופ הבמה ולצרף את ההובלה אלקטרודה ההשוואתית. להתמקד בפרוסות באמצעות מרחקים ארוכים עובדים, טבילה במים, 40-60x אובייקטיבי. מיקרוסקופ צריך להיות ממוקם על שולחן אוויר כדי לצנן את התנודות ומוקפות בכלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות חשמליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse את הפרוסות ברציפות בשיעור של מ&quot;ל / דקה 1 עם תמיסת מלח דוחי מבעבעים עם 100% O 2. חבר את היניקה, ולוודא כי יבוא והיצוא הם מאוזנים. יצוא יכול להיות מוסדר על ידי סיבוב הקצה המשופע של מחט השאיבה או על ידי העברת KimWipe בסוף התא קרובה יותר או רחוקה יותר ממחט יצוא. יכולה להיות כל הזמן ההכנה בטמפרטורת חדר או מקורר עם מכשיר פלטייה או פשוט על ידי קביעת שקית קרח על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הפרוסות תחת אור עמום או אינפרא אדום ולזהות זוג תאים - photoreceptor (מוט או קונוס) ותא אופקי או דו קוטבי קרוב - ליעד להקלטה כל התא. מוטות יכולות להיות אניdentified ידי גופי התא הגדולים שלהם וכמו מוט מגזרים חיצוניים בולטים (איור 2 א). קונוסים קטנים יותר ממוטות ויש מגזרים חיצוניים מחודדים קטנים. תא דו קוטבי וsomas תא האופקי הם בשורה החיצונית ביותר של גופי תא בשכבת הגרעין הפנימי (INL; דמויות 2B ו 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פרוסות, השתמש בחולץ פיפטה לייצר micropipettes מזכוכית ורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.2 מ&quot;מ, קוטר 0.95 מ&quot;מ פנימי עם חוט זכוכית). הקצה של כל micropipette צריך להיות ~ 1-2 מיקרון בקוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט מילוי לא מתכתית (לדוגמה אחד מיוצרת ממזרק 1 סמ&quot;ק או MicroFil), למלא pipettes עם הפתרון תאי (טבלת 1) ולצרף למחזיק האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרומם את מטרת מיקרוסקופ במקצת. מקם את פיפטה photoreceptor מתחת למטרה ולאחר מכן להוריד אותו כך שהקצה ממוקם בדיוק מעל את הפרוסות. חזור עם tהוא טפטפת שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם כל קיזוז ברמה הנוכחית הבסיסית על המגבר. בדקו את התנגדות פיפטה עם דופק depolarizing mV 5-10. בדרך כלל אנו משתמשים בטפטפות שהטווח 10-15 MΩ, התוצאה של להתחדד הארוך של הפיר וosmolarity הנמוך של פתרונות פיפטה דו החיים. עם פתרונות יונקים osmolarity גבוהים יותר, אותם pipettes מפגין ערכי התנגדות של ~ 8-12 MΩ. אמנם יש לנו בשימוש בקטרים ​​טיפ גדולים יותר עם ערכי התנגדות של 3-4 MΩ בפתרונות דו חיים, את היתרונות הניתנים על ידי התנגדות גישה נמוכה מתקזזים עם קשיים רבים באיטום על גבי קרום תא ומוזנח מהיר יותר של זרמי סידן ושליח שני אחר תגובות רגישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך יישום קל חיובית לחץ, עמדת פיפטה פוסט סינפטי כך שהוא קשר גוף התא האופקי או דו קוטבי. לאחר מכן מקם את פיפטה presynaptic כך שהוא קשר גוף התא של photoreceptor מוט או קונוס. הקלטות appeAR להיות יציב יותר, כאשר טיפים פיפטה לפנות המגזר הפנימי ולא הסומא, במיוחד בקונוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך מעקב ההתנגדות לשחרר את הלחץ החיובי על פיפטה פוסט סינפטי. לפעמים, על שחרורו של לחץ חיובי מספיק כדי ליצור חותם gigaohm. אם לא, תחול שאיבה עדינה עם מזרק 1 מ&quot;ל או דרך פה. לאחר התנגדות הטיפ גדלה&gt; 100 MΩ, להחיל פוטנציאל החזקת -60 mV. לאחר קבלת חותם gigaohm, null את כל עוברי קיבול פיפטה ולחזור על תהליך האיטום לפיפטה photoreceptor, החלת פוטנציאל החזקת mV -70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרע התיקון על ידי שימוש בפה שלך או מזרק ליישם יניקה לכל תא בתורו. מוטות, חרוטים, ותאים דו קוטבי יהיו בדרך כלל קרע עם שאיבה עדינה. קבלת תצורה כל תא עם תא אופקי עשויה לדרוש יניקה גדולה יותר (כלומר עם מזרק סמ&quot;ק 3) בשילוב עם פולסים מהירים מתח חזקים נמסרו עם F &quot;זאפ&quot;eature של מגבר תיקון המהדק. הקרע של הקרום והקמתה של תצורה כל התא יהיה ברור על ידי הופעתו של ארעיים קיבול כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הזהות של תא פוסט סינפטי פיזיולוגית על ידי יישום הבזק אור ומספק שורה של צעדי מתח מ-120 ל40 mV במרווחים של 20 mV (איורים 3 ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך אם זוג התאים מחובר synaptically, לספק, שלילת קוטביות קצרה (25-100 אלפיות השני) 60 mV צעד לphotoreceptor (ל -10 mV, בסמוך לשיא של L-סוג סידן מתח מגודרת הנוכחי) ולחפש לזרמי פוסט סינפטיים בנוירון הצו השני (איור 5). צעד depolarizing חזק צריך לעורר נוכחי מהר, חולף פנימה פוסט סינפטי בתא דו קוטבי האופקי או OFF פוסט סינפטי הנגרם על ידי פרץ של שחרור משלפוחית ​​החרוט (איור 5). </li></ol>

<ol><li>Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B2n+y+Cajal%2C+S+%22The+Structure+of+the+Retina%22">The Structure of the Retina</a>. , Charles C Thomas. Springfield, IL USA. (1972).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+and+the+retina%3A+a+100-year+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li>
<li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li>
<li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li>
<li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1%3A+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li>
<li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li>
<li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345(2012).</li>
<li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina%3A+general+principles+and+species-specific+variations%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li>
<li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li>
<li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li>
<li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells%3A+current+vs.+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li>
<li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li>
<li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li>
<li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li>
<li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכנת פרוסה הרשתית הוכיחה מאוד שימושית לניתוח המעגלים ומנגנונים המועסקים על ידי הרשתית לעבד מידע חזותי. היכולת להשיג את כל הקלטות סלולריים בו זמנית מנוירונים לפני ואחרי סינפטי כבר מועילה במיוחד בתחום זה. שלמות הקלטות סלולריים מותאמים הרבה יותר קלה להשיג מאשר עם פרוסות בהכנות רשתית שטוח הר בגלל שכבות הרשתית השונות נחשפות. יתר על כן, משום שתאי העצב ברשתית הגדולים שלהם, יש לי סלמנדרות היסטוריה ארוכה כהכנה רשתית ולכן מספקות מערכת מודל טוב במיוחד מאופיינת. בעזרת תרגול, ניתן להכין פרוסות בריאים של רשתית הסלמנדרה באופן קבוע. כמה צעדים מרכזיים יכולים לעשות את ההבדל בין הצלחה לכישלון. 1) ודא שסכין הגילוח הוא רכוב על מבצעה הרקמה, כך שהוא מניח שטוח על משטח הזכוכית ופרוסות נקי אם כי גם הרקמה וunderlyiקרום nitrocellulose ng. אם בצע חתך נקי דרך קרום nitrocellulose, כדאי שתשמע נקישה חלושה כמו סכין הגילוח מכה את פני השטח של שקופית הזכוכית. 2) ודא שהרשתית דבקה קרום nitrocellulose. אחרת, הרשתית יכולה לצוף מן הקרום במהלך כל שלב של ההליכים. 3) אל תחשפו את הפרוסות חתוכות לאוויר, כמו זה יגרום ניזק רבים של התאים השטחיים. 4) יש לוודא את הפרוסות וקרום nitrocellulose לשכב נגד שקופיות הזכוכית, כך ששכבות הרשתית הן לכאורה תחת מיקרוסקופ לנתח. 5) לאזן את שיעורי יבוא ויצוא superfusate על מנת להימנע מגדותיו לתא ההקלטה. זה מונע שינויים פתאומיים ברמות פתרון, אשר יכול לגרום לתנועות חדות רקמה. 6) בחר זוג בריא של תאים קרובים אחד לשני. תאים עם ציטופלסמה החלקה בריאים יותר מאשר תאים עם ציטופלסמה מגורענת. תאים עמוקים יותר בפרוסה יש סיכוי גבוה יותר כדי לשמור על קון הסינפטי ללא פגעtacts. 7) ודא שהקצה פיפטה לא שבור או התחכך רקמות אחרות או פסולת בדרך למטה לתאים. 8) בדקו את התנגדות פיפטה כדי לוודא שהוא לא סתום בפסולת או בועה, שניהם יכולים לעשות את זה קשה להשיג הקלטה כל תא באיכות. במקום הצמדת הרשתית לנייר סינון nitrocellulose, כמה חוקרים להטביע רשתיות בבלוק של אגר ולהשתמש vibratome לחתוך פרוסות ברשתית. למרות שלא ניסו גישה זו, קים ואח&#39;. -11 לדון יתרונות של שתי הגישות. בניסיון שלהם, הגישה מבוססת אגר מספקת תשואה של פרוסות שטוחות עקבית יותר עם שכבות רשתית שמסומנות היטב אך גישה המבוססת על נייר המסנן מניבה קולטנית אור בריא יותר. מוטות קונוסים אחראיות לtransducing אור לשינויים בפוטנציאל הממברנה. עם הקלטות לזווג, פוטנציאל הממברנה של מוטות או קונוסים יכול להיות manipulated ישירות וכן את היכולת ליצור תגובות אור, ואילו מועיל לזיהוי סוגי תאים, לא יכול להיות חיוני. לפיכך, אנו לעתים קרובות להכין פרוסות באור לבן. עם זאת, גם כאשר הוכן תחת תאורה בהירה, תאי עצב ברשתית סלמנדרה יכול ליצור תגובות אור גדולות כפי שמודגם על ידי התגובות באיור. 3. זה נובע בחלקו מאגר גדול יחסית של chromophore בהיקף הקטע החיצוני הגדול, אלא גם עשוי לשקף את היכולת של תאים להתחדש מולר 11-cis-רשתית לקונוסים 12. כדי לקבל באופן מלא תגובות אור הכהה מותאמים, אפשר להכין את הפרוסות תחת תאורת אינפרא אדום. עבור ניתוחים תחת אור אינפרא אדום, אנו מייחסים GenIII התמונה intensifiers (NAV3 Nitemate, יטון תעשיות, בטמפה, אריזונה) לoculars של מיקרוסקופ לנתח ולהאיר את הרקמה עם פנס LED אינפרא אדום. לחיתוך והליכים אחרים שאינם נערכו תחת מיקרוסקופ לנתח, אנו מעסיקים הר&quot;י ראש רכובמגבר GE. עבור מיקום של את pipettes התיקון, אנו לדמיין פרוסות באמצעות מצלמת CCD אינפרא אדום רגישה (למשל WATEC 502H, WATEC Inc, מידלטאון, ניו יורק) רכוב על מיקרוסקופ הזקוף, קבוע הבמה. עם אמצעי הזהירות הבאים, ניתן לקבל תשובות מוט מפגינות רגישות פוטון יחידה 6, 13. מגבלה אחת של עבודה בפרוסות רשתית היא שתהליכים תאיים ארוכים של תאי עצב ברשתית שדה גדולים עלולים לאבד רבים מהדנדריטים שלהם במהלך הליך החיתוך. הכנות פרוסה רשתית ולכן שימושיות יותר ללימוד הפיסיולוגיה של תאים שבו הקשרים סינפטיים כוללים תהליכים קרובים לגוף התא. רשתיות דו חיים ויונקים חולקים רבות מאותם סוגי תאים ולנצל מנגנונים פיסיולוגיים דומים 14-16. בעוד רשתית סלמנדרה היא מודל טוב להיבטים רבים של רשתית של יונקים, הבדל חשוב אחד נראה הנוכחות של מסלול מוט ייעודי ביונקים שinvoקשר lves של תאים מיוחדים על גבי המוט דו קוטביים איי תאי amacrine 14. מגבלה נוספת של רשתית הסלמנדרה היא המספר הקטן של כלים גנטיים שפותחו במיוחד עבור מין זה. עם זאת, נוגדנים וחומרים כימיים שshRNA אזורי היעד נשמרים היטב במינים אחרים יכולים לשמש בהצלחה בסלמנדרה, כפי שניתן רבים מעכבי מולקולה קטנים וריאגנטים פפטיד. בנוסף, עם כמה שינויים בטכניקה, אפשר להכין פרוסות רשתית ממינים אחרים שבו חלק מהכלים אלה הם זמין יותר. מעבר לשירות שלה להקלטה כל התא לזווג, הכנת פרוסה רשתית הסלמנדרה היא גם נוחה למגוון של גישות אחרות. כאמור לעיל, ניתן להשתמש בפרוסות רשתית ללמוד תגובות אור בשילוב עם פרוטוקולי מהדק מתח שונים 17. יכולים גם להיות טעונים נוירונים ברשתית עם צבעי ניאון רגישים לCa 2 +, Cl -, או Na+ הציג באמצעות פיפטה את התיקון או על ידי מרחץ יישום 15,18-20. יכול להיות הציג פפטיד ניאון שנקשר לסרט הסינפטי 21 באמצעות פיפטה את התיקון ומשמש להדמית סרט או 10, כאשר מצומד להעמסה, לחריפות ולפגוע באופן סלקטיבי 22 סרט. יש לנו גם בשימוש פרוסות ברשתית בשילוב עם נקודות קוונטיות כדי לפקח על התנועות של ערוצי סידן בודדים במוט וקונוס מסופים הסינפטיים 23. לפיכך, הפרוסה האנכית הרשתית היא תכשיר ניסיוני תכליתי ללימוד מנגנונים סינפטיים בסיסיות ואת פונקציות העיבוד הייחודיות שבוצעו בסינפסה הראשונה במסלול האיתות החזותי.

<table><tbody><tr><td>פורס רקמות</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח קצה כפול</td><td>טד פלה, בע"</td>מ <td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות ניטרוצלולוזה</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>סוג AAWP 0.8 מ"מ נקבוביות</td></tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית פיפטות</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1.2 מ"מ OD 0.95 מ"מ מזהה</td></tr><tr><td>Ag / AgCl גלולה</td><td>וורנר</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>34 ga. מחט מילוי, באורך 67 מ"מ</td></tr></tbody></table>

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

אחת המשימות המרכזיות במדעי מוח רשתית הוא להבין את המעגל החשמלי של תאי עצב ברשתית וכיצד קשרים אלה אחראים לעיצוב את האותות המועברים למוח. פוטונים מזוהים ברשתית על ידי מוט וקונוס קולטני אור, הממיר את האנרגיה הזאת לאות חשמלי, שמסר אותה לתאי עצב אחרים ברשתית, שם הוא מעובד ומועברים ליעדים מרכזיים במוח דרך עצב הראייה. תובנות מוקדמות חשובות לתוך מעגלי רשתית ועיבוד חזותי באו מהמחקרים היסטולוגית של 1,2 Cajal, ומאוחר יותר, מהקלטות אלקטרו של פעילות spiking של תאי הגנגליון ברשתית - תאי הפלט של הרשתית 3,4. הבנה מפורטת של עיבוד חזותי ברשתית דורשת הבנה של האיתות בכל שלב במסלול מphotoreceptor לתא הגנגליון ברשתית. עם זאת, הרבה סוגי תאים ברשתית הם ספחתמטען חבלה עמוקה ברקמה ולכן נגיש יחסית להקלטת אלקטרו. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי עבודה עם פרוסות אנכיות, שבו תאים המתגוררים בתוך כל אחת משכבות הרשתית הם נראים בבירור ונגישים עבור הקלטת אלקטרו. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע סעיפים אנכיים של רשתית מזחל נמר סלמנדרות (Ambystoma tigrinum). אמנם הכנה זו פותחה במקור עבור הקלטות עם microelectrodes החדים 5,6, אנו מתארים שיטה להקלטות מהדק מתח כל תא כפולים מקולטניות אור ותאים אופקיים ודו קוטביים שני מסדר שבו אנו לתפעל פוטנציאל הממברנה של photoreceptor בעת הקלטה בו זמנית לאחר תגובות הסינפטי בתאים אופקיים או דו קוטביים. את קולטני האור של סלמנדרת הנמר הוא הרבה יותר גדול מאלה של מיני יונקים, מה שהופך את זה הכנה אידיאלית שבו יתחייב לאהגישה הניסויית המאתגר מבחינה טכנית שלו. ניסויים אלה מתוארים עם עין לכיוון לחקור את המאפיינים של איתות סרט סינפטי - סינפטי מבנה מיוחד שנמצא ברק קומץ של תאי עצב, כולל מוט וקונוס קולטני אור, שהוא גם מתאים לשמירה על שיעור גבוה של טוניק שחרור הנוירוטרנסמיטר 7 , 8 - ואיך זה תורם למאפיינים הייחודיים של איתות סינפסה הרשתית הראשונה הזה.

עקבות נציג של תגובות אור מתאי עצב ברשתית פרוסות אנכיות של סלמנדרה מוצגות באיור 3. קונוס, התא אופקי, וOFF התא דו קוטבי כל להציג כלפי חוץ נוכחי, בתגובה להופעת אור. בולט פנימה הנוכחי בעקבות הבזק האור בהקלטות התא האופקיות ודו קוטביות נגרמת על ידי השחרור המוגבר של גלוטמט מקולטני אור כפי שהם depolarize באור קיזוז. בתא דו קוטבי מגיב עם זרם פנימה בתחילת האור כתוצאה ממפל הכניסה היפוך metabotropic גלוטמט רצפטור איתות והפעלה של TRPM1 ערוצים 9. ניתן להבדיל בין אחד לשני תאים אופקיים ותאים דו קוטביים במערכות היחסים שלהם IV (איור 4). תאים אופקיים יש התנגדות מבוא ליניארי או פנימי לתיקון הרביעי ונמוכה (&lt;500 MΩ; איור 4 א) בדרך כלל, בעוד שהתאים דו קוטבי התנגדות כניסה גבוהה(0.5-2 GΩ) ו- תיקון כלפי חוץ אני - V (איור 4) איור 5 מציג תוצאות נציג מהקלטות של זוג תא חרוט אופקי (איור 5 א) וזוג תא דו קוטבי חרוט OFF (איור 5).. בכל אחד, depolarizing קונוס ל-10 mV מפוטנציאל החזקת mV -70 עורר סיד מתח מגודרת נוכחי בחרוט וEPSC פנימה מהר בתא האופקי או דו קוטבי. גירוי חזק זה מספיק כדי לרוקן את בריכת בקלות-releasable של ~ 20 שלפוחית ​​מסרט הסינפטי, וכתוצאה מכך EPSC של 47 ~ רשות / סרט 10. EPSC התא האופקי באיור 5 א היה 232 הרשות הפלסטינית, מה שמרמז שהוא קיבל 5 מגעי סרט מקונוס presynaptic. הערכה דומה מהרשות הפלסטינית EPSC 178 בתא דו קוטבי מחוץ (איור 5) מצביעה על כך שהוא קיבל 4 קשרי סרט מקונוס presynaptic. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><sטרונג&gt; דוחים מלוחים </td><td> פיפטה presynaptic </td><td> פיפטה postsynaptic </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 מ&quot;מ </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 5 מ&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CS-גלוטמט * </td><td></td><td> 40 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> CS-גלוקונאט ** </td><td></td><td> 50 מ&quot;מ </td><td> 90 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> כלוריד Tetraethylammonium </td><td></td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 מ&quot;מ </td><td> 9 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> PH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarity **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * CS-גלוטמט נעשה על ידי נטרול חומצת 40 מ&quot;מ L-גלוטמית עם CsOH 40 מ&quot;מ בפתרון פיפטה. ** מניית ז 1 של CS-גלוקונאט נעשית על ידי נטרול פתרון של CsOH עם 45-50% חומצת D-gluconic. *** ה-pH צריך להיות מותאם עם NaOH לפתרון וCsOH תאיים עבור פתרונות פיפטה. **** שמירת osmolarity מפתרונות פיפטה בדיוק מתחת לזה של הפתרון תאי מונע נפיחות תא ומשפר את תוחלת חיים של ההקלטה. שולחן1. רכיבים ופרמטרים לפתרונות תאיים וחוץ תאיים הסטנדרטיים המשמשים בפרוטוקול זה. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> איור 1. עיצוב תא הקלטה. (AC) למעלה, בצד, ונוף של חתך של תא ההקלטה מראה ממדים. הקאמרית הוא מכונה מחתיכה עבה 2 מ&quot;מ של אקריליק. (ד &#39;) קאמרי מורכב. Superfusate נכנס לתא דרך אורך 10 ס&quot;מ של צינורות טפלון (צינור זרימה; סוג 24LW). Superfusate יוסר על ידי יישום יניקה קלה לצינור מתכת מד 20 המשופע בצד השני של החדר. בסמוך לצינור פלט זה היא אלקטרודה השוואתי גלולה Ag / AgCl. להוביל מאלקטרודה השוואתית זו קשורה להתייחסות של קלט headstage. משולש קטן של KimWipeממוקם מעל אלקטרודה ההשוואתית כדי לשמור אותו במגע עם הפתרון ולווסת את זרימת פתרון לצינור יצוא. הבסיס של החדר נוצר על ידי הצבת שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לתוך הקצוות השקועים של החדר. השקופית שנערכה במקום עם חרוז של שומן ואקום. רצועות של קרום nitrocellulose עם פרוסות רשתית משובצות באגלי שומן ואקום שיוצרים ערוץ לפתרון לזרימה. לפני קבלת פרוסות, חתיכת 5 מ&quot;מ x 10 מתוך קרום nitrocellulose מודבקת בחדר עם שני חרוזים קטנים של שומן ואקום. חתיכת עיינית ממוקמת צד vitreal על קרום nitrocellulose זה והרימה משם פעם אחת את שומרת הרשתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> איור 2. זוגות סלולריים מלאים בצבע ישהכנת פרוסה rtical.) תמונות של מוט ותא אופקי synaptically המצמיד שהיו מלאים בניגודי צבעי ניאון הציגו באמצעות פיפטה את התיקון בזמן הקלטה כל התא בו זמנית. לוציפר צהוב (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) נכלל בפתרון פיפטה המוט (צהוב) וsulfarhodamine ב &#39;(1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) נכלל בפתרון פיפטה התא האופקי (סגול). תמונות ניאון נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב (פרקין אלמר UltraView LCI) מצויד במצלמת CCD מקוררת (אורקה ER) ועלה לבמת מיקרוסקופ הקבוע (ניקון E600 FN עם 60x, מטרת טבילה במי NA 1.0). תמונות אלה מעולף על תמונות שדה בהירות של פרוסות הרשתית המתאימות באמצעות Adobe Photoshop. ב &#39;) תמונות של חרוט וsynaptically מצמידים OFF תא דו קוטבי. מסוף האקסון התא דו קוטבי ramifies בsublamina (S1) החיצונית ביותר של השכבה הפנימית plexiform סמוך לגבול עם שכבת הגרעין הפנימית. <strong&gt; C) תמונות של חרוט ותא אופקי synaptically מצמידים. שימו לב שמסופי קונוס הם הרבה יותר גדולים ממסוף האקסון של המוט. למרות שניתן לזהות תאים אופקיים על ידי צורה המלבנית של גופי התא שלהם, גופי תא של-ON ולא ניתן להבחין בין תאים דו קוטביים מסוג OFF בINL קלות לפני ההקלטה. עם זאת, אפשר היעד נעקר חרוט מונע את התאים דו קוטביים שבו יש גופי תא בONL וניתן להבחין בין קונוסים בהעדר מגזרים פנימיים וחיצוניים. סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> איור 3. אור עורר זרמים שנרשמו תחת מהדק מתח מארבעה תאי עצב ברשתית שונים בתגובה ל500 אלפיות שני בהיר הבזק של אור לבן. קונוס (א &#39;), תא אופקי <stronG&gt; (ב &#39;), ואת התא דו קוטבי (C) כל הגיב להדליק עם נוכחי כלפי חוץ. (ד&#39;) על התא דו קוטבי הגיב לאותו גירוי אור עם זרם פנימה. רעש תחילת המחקר הוצג על ידי התא דו קוטבי מ( C) משקף שחרור מתמשך של השלפוחית ​​סינפטית בחושך שפוחת כאשר קולטני אור hyperpolarize באור. תגובות מארבעה תאים אלה התקבלו בהקלטות נפרדות באמצעות פרוסות שהוכנו תחת אור לבן. עוצמת גירוי האור הלבן השתמש בדוגמאות אלה מיוצרות תגובות בתאים אופקיים ודו קוטביים שווי ערך ל 580 ננומטר שטף פוטון של 1 x 10 5 פוטונים / שני / 2 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> איור 4. (IV) יחסים נוכחי מתח של שעותתאים דו קוטבי ואת פקי. () פנל עליון, זרמים הממברנה עוררו על ידי סדרה של 150 צעדי מתח msec מ-120 ל +40 mV מיושם במרווחים של 20 mV (פנל תחתון) לתא אופקי. תאים אופקיים בדרך כלל יש התנגדות כניסה נמוכה ויחסי IV ליניארי או פנימי לתיקון. (ב) יחסי IV של תא דו קוטבי בתגובה לשורה של צעדי מתח. יש תאים דו קוטבי עמידות גבוהה יותר וקלט IV כלפי חוץ תיקון, עקב ההפעלה של זרמי אשלגן מתח מגודרת. <img alt="איור 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות של הקלטת נתונים מותאמים. (א) הקלטה של זרם סיד מתח מגודרת קונוס (חרוט אני Ca </sUB&gt;) בתגובה לצעד 100 אלפיות שני ל-10 mV מפוטנציאל החזקת -70 mV (קון V מ &#39;). דליפה ארעיים וקיבול נגרעו באמצעות P / 8 דליפת חיסור פרוטוקול. מהר מעורר פוסט סינפטי הנוכחי (EPSC; בג&quot;צ PSC) נרשם בו זמנית מתא אופקי, מראה כי שני תאים אלה הם מצמידים synaptically (ב &#39;) EPSC נרשם בתא דו קוטבי בתגובה לאותו הגירוי באחר. קונוס.

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) ולהסביר כיצד אנו משתמשים בפרוסות אלה ללמוד עיבוד הסינפטי ברשתית על ידי קבלת הקלטות מהדק מתח כל תא כפולים מקולטניים אור ותאים אופקיים ודו קוטביים שני מסדר.

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות רקמה דקות מרשתית סלמנדרת נמר מימית, ולהשתמש בהן להקלטות מהדק מתח תא שלם בו זמנית מקולטני אור ותאים אופקיים ודו קוטביים מסדר שני. זה מושג על ידי ניתוח עין סלמנדרה ובידוד הרשתית על פיסת קרום ניטרוצלולוזה. השלב השני הוא לחתוך פרוסות רשתית דקות ולמקם אותן בתא ההקלטה.לאחר מכן, החדר ממוקם על במה קבועה זקופה מיקרוסקופ ופיפטות תיקון ממוקמות מעל פרוסות הרשתית. השלב האחרון הוא להשיג הקלטות תאים שלמים מתא פרה-סינפטי, קולטן אור ותא אופקי או דו קוטבי פוסט-סינפטי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהקלטות תאים שלמים מזווגות כדי לתמרן את השחרור הסינפטי ולחקור את האינטראקציות בין תאים ברשתית.תכשיר פרוסות הרשתית פותח במקור במעבדותיהם של פרנק ורבלין וסם וו.בניגוד לתכשירים חד-תאיים, תכשירי פרוסות שמרו על מגע פנימי שלם, ובניגוד לתכשירי רשתית שלמה, חיתוך הרשתית חושף שכבות רשתית שונות, ומאפשר גישה נוחה לכל סוגי התאים השונים. בפרוסת הרשתית. ניתן להשתמש בתכשירים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות, כולל הקלטה סימולטנית למספר תאים ולניסויי הדמיה.תכשיר זה הוכיח את עצמו כבעל ערך רב לחקר אינטראקציות סינפטיות בין נוירונים ברשתית. בסרטון זה אנו מתארים הכנת פרוסות באמצעות רשתית סלמנדרה נמר, ומדגישים כמה מהפרטים הקטנים שיכולים לעשות את ההבדל בין הצלחה לכישלון. התחל הליך זה על ידי הרכבת החדר.הנח שני חרוזים של שומן ואקום במרווחים של שמונה עד 10 מילימטרים זה מזה על פני תא ההקלטה כדי ליצור תעלה לסופר פאזה ולהטמיע את פרוסות הרטינול בפעימה שנייה של שומן, כמה מילימטרים מעבר לכל אחד משני חרוזי השומן הללו כדי לשמש כהיטל להגבלת הזליגה. לאחר מכן הנח חתיכה משולשת קטנה של מגבון קים בקצה החדר כדי להבטיח מגע נוזלים עם אלקטרודת הייחוס. לאחר מכן, לחץ על חתיכת קרום ניטרוצלולוזה שטוחה כנגד מיקרוסקופ הזכוכית.החלק על שני חרוזים קטנים של שומן ואקום. להכנת פורס הרקמות. שוברים סכין גילוח פיפיות לארבעה חלקים.ואז חבר אחד מהם לזרוע החיתוך. ודא שקצה החיתוך של סכין הגילוח מונח שטוח על תא ההקלטה על ידי חיתוך פרוסה דקה של נייר סינון ניטרוצלולוזה. לאחר מכן, לאחר המתת חסד של סלמנדרה על ידי עריפת ראש, גרעין את העין באמצעות מספריים ונציה קטנה מתחת למיקרוסקופ, חתך את העור המחבר את העין למסלול שמסביב.לאחר מכן משוך את העין קדימה והחלק את המספריים מתחתיה כדי לחתוך את שרירי העיניים ועצב הראייה. לאחר מכן, הניחו את העין הגרעינית על מצע כותנה על גוש לינוליאום. כעת בצע חתך קטן במרכז הקרנית בעזרת להב כירורגי חד.הסר את הקרנית על ידי החלקת המספריים העדינים של ונציה לתוך החתך והארכת החתך באופן רדיאלי החוצה לכיוון ההילה Serrata. לאחר מכן חותכים בצורה היקפית סביב ההילה serrata על ידי סיבוב גוש הלינוליאום או הכותנה בין החתכים. לאחר חיתוך כל הדרך סביב העין, הסר את הקרנית והעדשה על ידי משיכתן מהצד של העין.העבירו את גביעונית העיניים הנותרת על משטח קשיח של גוש הלינוליאום שהורטב בתמיסת מלח דו-חיים. חותכים אותו לשליש בעזרת סכין גילוח חד בתנועת ניסור עדינה כדי להבטיח שהוא חותך את כל הדרך דרך הסקלרה. לאחר מכן הנח חתיכה אחת או שתיים של IUP על קרום הניטרוצלולוזה כשמשטח הרשתית פונה כלפי מטה.טבלו את החלקים הנותרים במי מלח נוספים. לאחר מכן, הכניסו אותם למקרר למקרה שייחתכו פרוסות נוספות מאוחר יותר. כעת, לחץ בעדינות את חתיכת ה-IUP על קרום הניטרוצלולוזה בעזרת זוג מלקחיים עדינים.טבלו את קרום הניטרוצלולוזה ואת חתיכת ה-IUP בכמה טיפות של מי מלח דו-חיים קרים. לאחר מכן מסננים את תמיסת המלח על ידי נגיעה בחתיכת מגבון קים בשולי קרום הניטרוצלולוזה ו-iup. לאחר מכן, טבלו את ה-IUP בקרום ניטרוצלולוזה עם כמה טיפות של תמיסת מלח דו-חיים קרה.שוב, לאחר מכן מקלפים את אפיתל פיגמנט הרשתית של סקלרה כורואיד כדי לבודד את הרשתית. אם הרשתית לא נדבקה בחוזקה, מסננים את מי המלח בעזרת מגבון קים. על מנת למשוך את הרשתית בצורה חזקה יותר אל קרום הניטרוצלולוזה, החלף את מי המלח וחזור על ההליך במידת הצורך.לאחר מכן, מלאו את החדר במי מלח דו-חיים קרים. העבר אותו לשלב פורס הרקמות. לאחר מכן פורסים את הרשתית ואת קרום הניטרוצלולוזה לרצועות דקות של 125 מיקרון על ידי לחיצה על סכין הגילוח בעדינות אך בחוזקה דרכן.לאחר חיתוך הרשתית כולה לפרוסות, העבירו את פרוסות הרשתית בזו אחר זו לערוץ הראשי של תא ההקלטה. כדי להעביר פרוסה, החזק רצועת קרום במקומה תוך החלקת החדר מתחתיה. הקפד לשמור על הפרוסה שקועה כשהיא מעל החלק המרכזי של החדר.הטמיעו את שולי קרום הניטרוצלולוזה ברצועות שומן הוואקום וסובבו אותו 90 מעלות. כדי להציג את שכבות הרשתית, לחץ את קרום הניטרוצלולוזה שטוח על משטח הזכוכית, גם אם אין רשתית על כל חתיכה. הנח רצועות של קרום ניטרוצלולוזה במרווחים קבועים של כמילימטר כדי לסייע בפירוק מתח הפנים ובכך לשפר את זרימת הנוזלים.המשיכו להעביר את הפרוסות בזו אחר זו עד שהפרוסות הונחו לכל אורך תעלת הזילוף. לאחר העברת כל הפרוסות, העבר את תא ההקלטה לשלב של מיקרוסקופ שלב קבוע זקוף. חבר את כבל אלקטרודת הייחוס לחוט הארקה בראש המגברtage.התמקדו בפרוסות באמצעות טבילה במים למרחק עבודה ארוך פי 40 עד 60 מטרה. הסופר הבא. ממזגים את הפרוסות בקצב של מילימטר לדקה עם תמיסת מלח דו-חיים מבעבעת בחמצן.חבר את קו היניקה לקו הפלט של החדר. לאחר מכן כוונן את הזרימה כדי לאזן את הזרימה על ידי סיבוב הקצה המשופע של מחט היניקה או על ידי הזזת מגבון הקים בקצה החדר קרוב יותר או רחוק יותר מהפתח בקצה מחט הזרימה. בדוק את הפרוסות באור עמום או אינפרא אדום.לאחר מכן, זהה זוג תאים, קולטן אור ותא אופקי או דו קוטבי סמוך לסיטונאות. הקלטת פיליפ פיפטה שהוכנה לפני הניסויים בתמיסה התוך-תאית, הרכיב אותה על מחזיק האלקטרודה. לאחר מכן, הרם מעט את מטרת המיקרוסקופ.מקם את פיפטת קולטני האור מתחת למטרה. לאחר מכן הורד אותו כך שהקצה ימוקם ממש מעל הפרוסה והתאם את המיקוד בו זמנית. כדי להימנע מללכת רחוק מדי.חזור על הליך זה עם הפיפטה השנייה. לאחר מכן, בדוק את התנגדות הפיפטה עם דופק דה-פולריזציה של 5 עד 10 מילי-וולט. התאימו הסטה כלשהי ברמת זרם קו הבסיס במגבר.לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי קל, ובינתיים, מקם את הפיפטה הפוסט-סינפטית כך שתיצור קשר עם גוף התא האופקי או הדו-קוטבי. לאחר מכן מקם את הפיפטה הפרה-סינפטית כך שתיצור קשר עם גוף התא של מוט או קולטן אור חרוט. תוך כדי ניטור שחרור ההתנגדות, הלחץ החיובי על הפיפטה הפוסט-סינפטית, לפעמים שחרור הלחץ החיובי מספיק כדי ליצור חותם ג'יגה אוהם.לאחר שהתנגדות הקצה גדלה ליותר מ-100 מגה אוהם, הפעל פוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט. לאחר מכן, כאשר מתקבל חותם ג'יגה אום, בטל את קיבול הפיפטה החולף. באמצעות מעגלי פיצוי הקיבול של מגבר מהדק התיקון, חזור על הליך התקרה עם פיפטת קולטני האור, תוך הפעלת פוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט ובטל את קיבול הפיפטה.חולף, ואז קרע את המדבקה על ידי הפעלת יניקה על כל תא. קרע של המדבקה ניכר על ידי הופעת קיבול תא שלם חולף. כעת, אשר את זהות התא הפוסט-סינפטי מבחינה פיזיולוגית על ידי הפעלת הבזק אור והעברת סדרה של צעדי מתח ממינוס 120 לפלוס 40 מילי-וולט במרווחים של 20 מילי-וולט.כדי להעריך אם התאים מחוברים סינפטית, ספק 60 מילי-וולט של 25 עד 100 אלפיות השנייה. צעד דה-פולריזציה לקולטן האור וחפש זרמים פוסט-סינפטיים. בתא העצב מסדר שני, הנה העקבות המייצגים של תגובות אור מהנוירונים בפרוסות אנכיות של רשתית הסלמנדרה.התא האופקי החרוט והתא הדו-קוטבי החיצוני מציגים כולם זרם חיצוני בתגובה להופעת האור. הזרם הפנימי הבולט בעקבות הבזק האור בהקלטות התאים האופקיים והדו-קוטביים כאן נגרם על ידי שחרור מוגבר של גלוטמט מקולטני האור כשהם מתפרקים בהיסט האור. התא הדו-קוטבי מגיב בזרם פנימה בתחילת האור, הנובע מסימן ההופך מפל איתות של קולטן גלוטמט מטבוטרופי והפעלת ערוצי טריפם אחד.ניתן להבחין בין תאים אופקיים ותאים דו קוטביים זה מזה על ידי יחסי המתח הנוכחיים שלהם. לתאים אופקיים יש בדרך כלל יחסי מתח זרם ליניאריים או מיישרים פנימה עם התנגדות כניסה של פחות מ-500 מגה-אוהם, לתאים דו-קוטביים יש יחס מתח זרם מיישר כלפי חוץ והתנגדות כניסה גבוהה יותר בין 0.5 לשני ג'יגה אוהם. איור זה מציג את התוצאות המייצגות מההקלטות של זוג תאים אופקיים חרוט וזוג תאים דו קוטביים של חרוט.בכל מקרה, דה-פולריזציה של החרוט למינוס 10 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט עוררה זרם סידן מגודר מתח בחרוט ופוסט-סינפטי מהיר פנימה. זרם בתא האופקי או הדו-קוטבי פרוסת הרשתית. תכשירים שימשו במאות מחקרים על האנטומיה והפיזיולוגיה של הרשתית.הם מועילים במיוחד לבחינת תגובות של תאים מרובים בו זמנית מכיוון שהם מאפשרים הקלטה והדמיה ממספר תאים בו זמנית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את הרשתית, לחתוך פרוסות רשתית דקות, למקם אותן בתא ההקלטה ולהשיג הקלטות סיטונאיות מזוגות של עצמיים המחוברים סינפטית.

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למדו הכנת פרוסות רשתית דקות מסלמנדרה טיגריסית מימית לרישום תאים שלמים בו זמנית מקולטני אור ותאי אופק וביפולריים. שיטה זו מאפשרת חקר עיבוד סינפטי ברשתית עם חיבורים סינפטיים ללא פגע.

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

גלה סרטונים נוספים