יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד תעלות היונים המגודרות של ליגנד בתאי עצב מפרוסות מוח מוכנות שמקורן בעכברים בוגרים. זה מושג על ידי חילוץ מוח שלם מעכבר בוגר שעבר טרנס קארדי עם נוזל מוחי מלאכותי מיוחד. השלב השני הוא הכנת פרוסות מוח מאזור המוח המעניין בכיוון הרצוי.

לאחר מכן, פרוסות מוח בודדות המונחות בתא הקלטה מתחת למיקרוסקופ ונוירונים בודדים בתוך הפרוסה מזוהים להקלטה. השלב האחרון הוא הקלטת מהדק תיקון תא שלם של נוירון ואחריו יישום מקומי של תרופות להפעלת תעלות היונים המגודרות ליגנד באמצעות מיקרו פיפטה שנייה מזכוכית. בסופו של דבר, שיטה זו של חקר תעלות יונים מגודרות ליגנד משמשת להצגת התכונות הביופיזיקליות של קולטנים מקומיים על נוירונים חיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון יישום אמבטיה או מתן תרופות ביוטיוב, הוא שהעברת תרופות לנוירון המוקלט מהירה מאוד ומקומית. ניתן להעביר כמויות קטנות של תרופה ולחקור מספר נוירונים מפרוסה אחת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קולטני האצטילכולין הניקוטיניים, כגון קביעת קולטני הניקוטין המקומיים המעורבים בתא הביופיזי, התגובות הביולוגיות וההתנהגותיות לניקוטין.

בהליך זה, לאחר הקרבת עכבר בוגר והשגת המוח, חתוך את המוח בכיוון הרצוי כדי לכלול את אזור העניין על לוחית מתכת מקוררת קרח. לאחר מכן, הדביקו את גוש המוח עם דבק סופר על משטח הבמה היבש של פורס רוטט. לאחר מכן טבלו את גוש המוח בתמיסת התאוששות NMDG של ארבע מעלות צלזיוס והמשיכו לבעבע את התמיסה בקרבוגן.

לאחר מכן חותכים את הפרוסות בעובי 250 מיקרון כל אחת מאזור המוח המעניין. לאחר מכן, משוך מיקרו פיפטה תיקון סטנדרטית עם התנגדות של ארבעה עד שישה מגה אוהם באמצעות המושך החום הבוער הניתן לתכנות. מלאו את המיקרו פיפטה בתמיסת הקלטה תוך-תאית מתאימה.

לאחר מכן העבירו פרוסה לתא ההקלטה על הבמה של מיקרוסקופ זקוף, היכוך ברציפות את הפרוסה עם הקלטה סטנדרטית מוגזת של 32 מעלות צלזיוס A CSF במהירות של 1.5 עד 2.0 מיליליטר לדקה. תחת המיקרוסקופ, אתר ומרכז את אזור העניין במוח באמצעות יעד אוויר פי 10. לאחר מכן, דמיין את הנוירונים הבודדים באמצעות אובייקט טבילה במים אינפרא אדום קרוב פי 40 המחובר לאופטיקה הניגודית של הפרעות דיפרנציאליות IR, ומכשיר מצמד טעון אינפרא אדום במהירות גבוהה או מצלמת וידאו CCD תחת תצפית IR DIC נוירונים בריאים מציגים קרום פלזמה אפור בהיר חלק לאחר הדמיית תאים.

בצע הקלטת תא שלם בטכניקות קונבנציונליות. כעת משוך עוד מיקרופיפט מהדק תיקון סטנדרטי כמו קודם כדי לייצר שני קצות אחיות זהים מאותה חתיכת זכוכית עם התנגדות אופטימלית של כחמישה מגה אוהם. מלאו מחדש את אחת הפיפטות המיקרו בתמיסה של תרופה מדוללת בהקלטה סטנדרטית מוגזת CSF כוון את הקצה כלפי מטה והזיז את המיקרופיפט המלא בתרופה כדי להסיר בועות אוויר כלואות במיקרו פיפטה.

לאחר מכן, הרכיב את המיקרו פיפטה המלאה בתרופה למחזיק פיפטה המחובר למניפולטור המיקרום. יש לחבר את מחזיק הפיפטה עם צינורות למערכת פליטת לחץ מתאימה. פלוט ידנית לחץ שלוש עד ארבע פעמים למיקרו פיפטה על מנת לבנות לחץ מספיק מאחורי עמוד הנוזל.

לאחר מכן הורד את פיפטת התרופה לתוך הפרוסה באמצעות מניפולטור מיקרום באמצעות I-R-D-I-C. תצפית. מקם את המיקרו פיפטה של התרופה על פני פרוסת הרקמה. בצע פליטת לחץ אחת ופקח על קרבת הקצה לתנועת פסולת הקשורה לפליטה ולקצה המיקרו פיפטה.

לכל סימן לכך שהקצה סתום או חסום, אם הקצה סתום, משוך את הפיפטה והחלף אותה בחדשה. התקרב לתא המוקלט באלכסון מהחלק העליון של הפרוסה. כאשר הוא נמצא במצב הסופי, קצה הפיפטה המלאה בתרופה נמצא באותו מישור מוקד כמו התא המוקלט וקצה האלקטרודה המוקלטת, והוא נמצא במרחק של כ-10 עד 40 מיקרון מהתא המוקלט.

אם קצה הפיפטה המלא בתרופה נמצא מעל התא המוקלט, הכוח מפליטת הלחץ עלול לשבש את איטום הג'יגה של התא, ואז להקליט את האצטילכולין ו/או הניקוטין שעוררו זרמים תאיים תוך החזקת הנוירונים במצב מהדק מתח. למרות שניתן להפעיל דחיית לחץ באופן ידני בעת שימוש בשפריצר פיקו 3 לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור יותר, רצוי להפעיל את דחיית הלחץ באמצעות מערכת הרכישה ופולס TTL דיגיטלי. כדי לשפר את הניסוי, ניתן להרכיב את מחזיק הפיפטה המלא בתרופות על מתרגם חשמלי פיזו חד מימדי המסוגל לקבל כניסת מתח אנלוגית, אשר מותקן לאחר מכן על המיקרו מניפולטור ברמת דיוק גבוהה.

מתרגם חשמלי פיזו שימושי מכיוון שניתן לשלוט ביתר קלות על תנועת הפיפטה המלאה בסם לתוך ומחוץ לפרוסה, כולל התזמון ומהירות הכניסה של יציאת הניסוי מניסוי לניסוי. לאחר מכן, כוונן את המתח לערכו המקסימלי באמצעות הפוטנציומטר הנשלט ידנית על המגבר הנשלט על ידי מתח חשמלי. השתמש במניפולטור המיקרו כדי למקם את הפיפטה המלאה בתרופה בפרוסה.

החזר את הפיפטה על ידי הפחתה ידנית של המתח לאפס במגבר הנשלט על המתח החשמלי של פאזו באמצעות אות פלט אנלוגי ממערכת רכישת ההקלטה. העבר את הפיפטה המלאה בתרופה לתוך הפרוסה לפני שמתרחש דופק TTL פליטת לחץ. לאחר התרחשות הדופק, משוך את הפיפטה.

איור זה מציג את התגובה הייצוגית של נוירון דופמין ל-100 אצטילכולין מיקרו-מולרי המיושם באופן מקומי, ואיור זה מציג את התגובה הייצוגית של נוירון דופמין אחר ל-100 ניקוטין מיקרו-מולרי המיושם באופן מקומי. להלן פוטנציאל הפעולה הספונטני של נוירון דופמין בפרוסת מוח של עכבר אלפא שש L תשע ראשוני S המוחזקת במצב מהדק נוכחי. היישום של מיקרומולר אחד של ניקוטין באמצעות דחיית לחץ של 250 אלפיות השנייה גרם לשינויים בפעולה, בקצב הירי הפוטנציאלי ובפוטנציאל הממברנה במנוחה.

באמצעות חיפוש הסף בתוכנת מהדק P, נגזר קצב הירי המיידי כדי לסווג את הנוירונים לפי סוגי תגובת האצטילכולין נוירוני קולוס עליונים בודדים. באלפא שש L תשעה ראשוניים פרוסת מוח של עכבר היו מהודקים במתח ואחריהם יישום מקומי של ניקוטין מיקרו-מולרי אחד באמצעות פליטת לחץ נוירונים מסוג 1 הפגינו IPCs מוגברים. לאחר יישום ניקוטין, נוירונים מסוג 2 הפגינו זרמים גדולים פנימה ועלייה ב-EPC בתגובה ליישום ניקוטין.

המתרגם החשמלי של פיזו מציע עקביות ומגן מפני דליפת תרופות. נוירון דופמין VTA בפרוסת מוח של עכבר אלפא שש L תשע ראשוני S נרשם במצב מחיאת כפיים במתח. במהלך מריחת ניקוטין מיקרו-מולרי אחד, הפיפטה המלאה בניקוטין תמרנה למצב הסופי לפני פליטת הלחץ ונסוגה לאחר הפליטה באמצעות מתרגם חשמלי פאזו.

תגובה שנייה נרשמה שתי דקות לאחר הראשונה כדי להוכיח שלא התרחשה דה-סנסיטיזציה של N-A-C-H-R. הניסויים חזרו על עצמם עם מריחה של 10 ניקוטין מיקרו-מולרי. שוב, לא נצפתה דה-רגישות בתגובה השנייה בהשוואה לראשונה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות בלבד אם היא נעשית כראוי. במקרים מסוימים, ניתן לחקור 10 עד 15 נוירונים מפרוסת מוח אחת תוך יום אחד בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למקם במדויק את הפיפטה המלאה בתרופה כדי לשמור על איזון בין הפעלה מלאה של קולטני ניקוטין על פני השטח לבין שלמות חותם הג'יגה.