Name: יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: חקור פונקציית קולטן אצטילכולין ניקוטינית בנוירונים מפרוסות מוח עכבר בוגר באמצעות יישום מקומי של תרופות וטכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר וממוקד של תכונות ביופיזיקליות של קולטנים נייטיביים בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המענק DA030396. תודה לחברים במעבדת Drenan לדיון וביקורת של כתב היד מסייע. תודה מיוחדת למי ראן קים לסיוע טכני וג&#39;ונתן תומס טינג לייעוץ לגבי פרוסות מוח עכבר בוגרות.

1. הכנה של פתרונות להכנת Slice מוח ואלקטרופיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות להכנת פרוסות מוח תוארו בעבר 3, 4. הכן N-methyl-D glucamine (NMDG)-מבוסס פתרון התאוששות וחיתוך של הרכב הבא (במ&quot;מ): 93 N-methyl D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 nah 2 PO 4, 30 3 NaHCO, 20 HEPES, 25 גלוקוז, 5 Na + ascorbate, 2 Thiourea, 3 Na + פירובט, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם NMDG. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם 10 N HCl. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס MgSO 4 • 7H 2 O וCaCl 2 • 2H 2 O במי Millipore לעשות 2 פתרוני מניות M של כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול את הרכיבים אחרים בהסדר המפורט ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלאבקבוק מים עם הנפח Millipore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-pH ולהתאים עם 10 N HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם NMDG במידת צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HEPES מחזיק נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) של הרכב הבא (במ&quot;מ): 92 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah 2 PO 4, 30 3 NaHCO, 20, 25 HEPES גלוקוז, 5 Na + ascorbate, 2, 3 Thiourea Na + פירובט, 2 4 MgSO • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול את המרכיבים לפי הסדר הרשום ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלא בקבוק במי נפחית Millipore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-pH ולהתאים עם NaOH או HCl במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם סוכרוז במידת צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הסטנדרטי aCSF הקלטה של הרכב הבא (במ&quot;מ): 124 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 גלוקוז, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH. </li></ol> 2. הכנה של פרוסות מוח החריפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך והתאוששות פרוסת מוח נעשים כמתוארים 3, 4 בעבר. שתי מנות קריסטל בועות מלאות בNMDG פתרון התאוששות עם חמצן 95% / 5% 2 גז CO (carbogen), צלחת אחת על קרח, השני על 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנת גביש בועה אחד מלא עם HEPES מחזיק aCSF עם carbogen בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר בוגר (גילי 2 עד 12 חודשים) עם Na + פנטוברביטל (200 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ip). להמשיך בהליך כאשר בעלי החיים אין לה מענה לבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לחתוך דגימת רקמת זנב למועד מאוחר יותר genotyping של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל החזה, לחשוף את הלב, ומהדק את אב העורקים היורד. פצע את העלייה הימנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transcardially ינקב את החיה עם 5-10 מ&quot;ל של 0-4 ° C NMDG פתרון התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף חיה, הסר את המוח ולמקם אותו בפתרון 4 ° C-NMDG התאוששות עבור 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על לוחית מתכת קרח צוננת, חתוך את המוח בכיוון הרצוי (עטרה, parasagittal, אופקי, וכו &#39;) כך שאכלול את השטח של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק בלוק המוח בדבק מגע למשטח השלב היבש של מבצעה רוטט (DSK-Zero 1; Dosaka), להטביע את הבלוק במוח 4 מעלות צלזיוס פתרון NMDG התאוששות, והרף בועת הפתרון עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך פרוסות של האזור במוח של עניין. עובי פרוסה הוא 200-400 מיקרומטר, בהתאם לאזור הספציפי במוח של עניין, גיל חיה, והניסוי שבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר חיתוך, פרוסות רצויות אינקובטורים בcarbogenated, 33 ° C-NMDG התאוששות solutiבבדיוק 12 דקות, ולאחר מכן להעביר ל, HEPES טמפרטורת החדר carbogenated מחזיק פתרון לתקופה ראשונית של 60 דקות. לאחר הדגרת 60 דקות זה, פרוסות יכולות לשמש להקלטה. פרוסות נשמרות בHEPES מחזיק פתרון כל היום, עד שהם משמשים להקלטה. </li></ol> 3. הקלטת קלאמפ תיקון מנוירונים בפרוסות מוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipette תיקון סטנדרטי עם תכנות Flaming-בראון חולץ (סאטר P-97 או חולץ אנכי מקביל). Pipettes שהם אופטימליים להיווצרות חותם גיגה אוהם בדרך כלל יש התנגדות של 4-6 MΩ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פרוסה אחת לתא ההקלטה (RC-27L; מכשירי Warner) על הבמה של מיקרוסקופ זקוף (ניקון FN-1). רציפות superfuse (1.5-2.0 מ&quot;ל / דקה) עם פרוסת carbogenated, ההקלטה aCSF הסטנדרטי מחוממת ומתוחזק על 32 ° C. לחלופין, פרוסות יכולות להישמר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר ומרכז האזור במוח של ריבית באמצעותמטרת אוויר 10X (ניקון התכנית פלואוריד 10X; NA 0.3; WD: 16 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו נוירונים בודדים באמצעות אובייקטיבי 40X קרוב אינפרא אדום (IR) מי טבילה (ניקון APO 40XW; NA: 0.80; WD: 3.5 מ&quot;מ) מחוברים לניגוד IR-הפרש התערבות (DIC) אופטיקה ומהירות גבוהה ליד אינפרא אדום טעון מכשיר יחד (CCD) מצלמת וידאו (Hamamatsu C-7500). תחת תצפית IR-DIC, נוירונים בריאים מפגינים קרום פלזמה חלקה, בצבע אפור בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא micropipette עם פתרון הקלטה תאי מתאים. עבור רוב היישומים, אנו משתמשים בפתרון הבא (במ&quot;מ): 135 גלוקונאט האשלגן, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, ו -0.1 GTP (חומציות מותאמת ל7.25 עם טריס בסיס, אוסמולריות מותאם ל290 mOsm עם סוכרוז). להקים הקלטה כל תא מתאי עצב באופן חזותי. </li></ol> 4. יישום מקומי של תרופות לנוירונים בפרוסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipette מהדק תיקון סטנדרטי כפי שתואר לעיל. שימושחולץ פיפטה כגון סאטר P-97 שמייצר שני טיפים זהים &quot;אחותי&quot; מאותה חתיכת הזכוכית הוא יתרון כאשר פתרונות תרופתיים רבים יש לעשות שימוש באותו התא. עצת גדלים שיש להם התנגדות של ~ 5 MΩ אם הם היו מלאים בפתרון התאי שתואר לעיל הם אופטימליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המילוי החוזר micropipette עם תמיסה של תרופה בדילול aCSF ההקלטה carbogenated, הסטנדרטי. כוון את הקצה כלפי מטה, ומעיפי micropipette תרופה המלא כדי להסיר כל בועות אוויר שנלכדו בעמודה של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר micropipette תרופה המלאה בבעל פיפטה מחובר עם צינורות למערכת מתאימה לחץ פליטה, כגון Picospritzer III (כללי Valve ושות). בעל פיפטה צריך להיות מותקן על גבי micromanipulator עם אותה הרזולוציה של מניפולטורים נפוצים להקלטת מהדק תיקון (לדוגמה, סאטר MP-285). בנוסף, מניפולטור צריך לאפשר תנועה אלכסונית לתוך ומחוץ לפרוסה. גברually להוציא לחץ 3 עד 4 פעמים בmicropipette כדי לבנות את הלחץ מתאים מאחורי עמוד הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פקדי micromanipulator, להנמיך פיפטה התרופה לפרוסה תוך לדמיין את הקצה מתחת אופטיקה IR-DIC. אופן אידיאלי, צריך לזהות ויזואלית והמרכז נוירון שיירשם מ, ואחרי המיצוב של פיפטה הסמים ליד התא לפני הפחתת micropipette ההקלטה לפרוסה. מיצוב פיפטה התרופה יכולה לגרום לתנועה של רקמות באזור התא המוקלט שעלולות לשבש את ההקלטה אם פיפטה התרופה עברה לתפקיד לאחר הקמת חותם gigaohm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות וידאו IR, למקם micropipette הסמים במשטח העליון של פרוסת הרקמה. Execute פליטה 1 לחץ וצג 1) הסביבה של הקצה לתנועה של פסולת קשורה לפליטה, ו 2) בקצה micropipette עבור כל סימנים שהעצה היא סתומה או חסומים. אם הקצה חסום / סתום, לחזור בי pipettדואר ולהחליפו באחד חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב לתא המוקלט אלכסון מהחלק העליון של הפרוסה כך שכאשר במצב סופי, קצה פיפטה תרופה המלאה הוא 1) באותו המישור מוקד (או מעט מתחתיו) כתא מוקלט וקצה החוט הרושם , ו 2) 10-40 מיקרומטר מהתא המוקלט. אם קצה פיפטה תרופה מלאה הוא מעל לתא המוקלט, הכח מפליטת הלחץ עלול לשבש את חותם gigaohm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התגובה התאית הרצויה תוך כדי החזקה הסלולרית במצב מהדק מתח או במצב הנוכחי מהדק. אנחנו באופן שגרתי להקליט אצטילכולין ו / או ניקוטין שהושר זרמים סלולריים תוך החזקת נוירונים במצב מהדק מתח. למרות שיכולה להיות מופעלת על פליטת לחץ ידני בעת שימוש Picospritzer שלישי, לתוצאות יותר לשעתק מומלץ להפעיל לחץ הפליטה באמצעות מערכת הרכישה (אקסון Digidata 1440 וpClamp 10.3) עם דיגיטלי TTL דופק. </li></ol> 5. שליטהmicropipette תרופות המלאה עם מתורגמן פיזואלקטריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אפשר, הר בעל פיפטה תרופה המלאה למתרגם-ממד אחד פיזואלקטריים (למשל Piezojena רשות-100 או Burleigh PZM-150), כי הוא מסוגל לקבל קלט אנלוגי מתח (שוב, ממערכת הרכישה), אשר לאחר מכן רכוב על micromanipulator הדיוק גבוה (סאטר MP-285). מתורגמן פיזואלקטריים שימושי כי התנועה של פיפטה תרופה המלאה לתוך ומחוץ לפרוסה, כולל תזמון והמהירות של כניסה / יציאה, ניתן לשלוט בקלות רבה יותר ולשכפל מניסוי לניסוי. כאשר לומדים nAChRs, השפעות להקהות רגישויות של דליפה מניקוטין פיפטה תרופה המלאה, צריכים פעם הם מתרחשים, הם מזעריים כאשר פיפטה מועברת רק בסמוך לתא עם מתרגם פיזואלקטריים לרגע של פליטת לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפוטנציומטר ידני המבוקר על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים, חייג מתחלערכו המקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micromanipulator, עמדת פיפטה תרופה המלאה בפרוסה בי פיפטה תהיה להוציא את תכולתו על התא המוקלט, ולחזור בו באופן ידני על ידי הפחתת פיפטה המתח לאפס על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באות פלט אנלוגית מרכישת מערכת ההקלטה, להזיז את פיפטה תרופה המלאה לפרוסה על פני תקופה של 250 אלפיות שניים מתחילים 300 אלפיות שניים לפני שלחץ פליטת TTL הדופק מתרחש. לחזור בי פיפטה על פני תקופה של 250 אלפיות שני, החל 50 אלפית שני לאחר TTL הדופק מסתיים. </li></ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
</ol>

השיטה שהוצגה במאמר זה היא רחב שימושית לחקר תפקוד ערוץ היון יגנד מגודר בהכנות פרוסות מוח. עם זאת, יש מספר גורמים שישפיעו באופן משמעותי את האיכות והשחזור של נתונים ניסיוניים הנובעים מניצול שיטה זו. לדוגמה, זרמים מעוררים רגישים מאוד לקוטר של קצה פיפטה תרופה המלאה. טיפים קטנים יגרמו קושי בלהוציא את פתרון הסמים, וטיפים גדולים עם התנגדות נמוכה יהיו יותר סיכוי לשבש את חותם gigaohm בין התא המוקלט והחוט הרושם. מגבלה של השיטה הוצגה אחת אחרת היא שתאים בתוך 10 מיקרומטר של התא נרשם עלולים להיו...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם המגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-מתיל D-glucamine</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nah<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbate</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thiourea</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; פירובט</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; פנטוברביטל</td&gt;<td&gt; פרמצבטיקה Vortech</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקונאט האשלגן</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 רטט פורס</td&gt;<td&gt; טד פלה, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / בראון micropipette חולץ</td&gt;<td&gt; סאטר</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; קאמרי RC-27 הקלטה</td&gt;<td&gt; וורנר</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בקר דוד זלוף TC-344B</td&gt;<td&gt; וורנר</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdדוד פתרון&gt; SH-27B</td&gt;<td&gt; וורנר</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ניקון FN-1</td&gt;<td&gt; ניקון</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 מצלמת וידאו CCD</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; כללי Valve ושות</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 micromanipulator</td&gt;<td&gt; סאטר</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; רשות-100 מתורגמן פיזואלקטריים</td&gt;<td&gt; Piezosystem Jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piezo מגבר</td&gt;<td&gt; Piezosystem Jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; התקנים המולקולרי קורפ</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; התקנים המולקולרי קורפ</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

שימוש בטבק מוביל לבעיות בריאותיות רבות, כולל סרטן, מחלות לב, אמפיזמה, ושבץ. התמכרות לעישון סיגריות היא הפרעה נפוצה נוירופסיכיאטריות שנובעת מפעולות biophysical והסלולריות של ניקוטין על קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברחבי מערכת העצבים המרכזית. ההבנה תת nAChR השונה שקיימת באזורי המוח רלוונטיים להתמכרות לניקוטין היא בעדיפות עליונה. ניסויים המשתמשים בשיטות electrophysiology כגון מהדק תיקון כל תאים או הקלטות מהדק מתח 2 ואלקטרודות שימושיים לאפיון תרופתי של nAChRs של עניין. תאים המבטא nAChRs, כגון תאי יונקי רקמות תרבות או ביציות Xenopus laevis, מבודד מבחינה פיזית ולכן הם למדו בקלות להשתמש בכלים של פרמקולוגיה המודרנית. התקדמות הרבה כבר נעשתה שימוש בטכניקות אלה, במיוחד כאשר הקולטן היעד כבר היה ידועביטוי אקטופי nd הושג בקלות. אולם לעתים קרובות, יש צורך ללמוד nAChRs בסביבה הטבעית שלהם: בתאי עצב בתוך פרוסות מוח חריף נקטפו מעכברים או חולדות מעבדה. לדוגמה, עכברים להביע יחידות משנה &quot;רגישות יתר&quot; nAChR כגון α4 עכברי L9&#39;A 1 ועכברי α6&#39;S L9 2, מאפשר זיהוי חד משמעי של נוירונים המבוססים על ביטוים התפקודי של מקטע nAChR ספציפי. למרות שהקלטות מהדקות תיקון כל תא מתאי עצב בפרוסות מוח נעשות באופן שגרתי על ידי electrophysiologist המיומן, הוא מאתגר מקומי כדי להחיל תרופות כגון אצטילכולין או ניקוטין לתא נרשם בתוך פרוסת מוח. הדילול של תרופות לתוך superfusate (יישום אמבטיה) הוא לא מהירות הפיך, ומערכות U-צינור אינן מותאמות בקלות לעבודה עם פרוסות מוח. במאמר זה, אנו מתארים שיטה ליישום במהירות תרופות nAChR-מפעילות לנוירונים שנרשמו במבוגרים מ &#39;ouse פרוסות מוח. קלטות סטנדרטיות כל תאים עשויות מנוירונים בפרוסות, וmicropipette שני, מלאי סמים של הריבית תמרן לעמדה ליד התא המוקלט. הזרקה של אוויר דחוס או חנקן אינרטי לתוך פיפטה תרופה המלאה גורמת לכמות קטנה של פתרון תרופה להיפלט פיפטה אל התא המוקלט. באמצעות שיטה זו, זרמי nAChR בתיווך יכולים להיפתר ברמת דיוק של האלפית שני. זמני יישום תרופה בקלות יכולים להיות מגוונים, ופיפטה תרופה המלאה ניתן חזרה בו והחליפה עם פיפטה חדשה, המאפשרת לעקומות ריכוז בתגובה לתיוצרנה לנוירון בודד. למרות שתאר בהקשר של nAChR נוירוביולוגיה, טכניקה זו צריכה להיות שימושית ללימוד סוגים רבים של ערוצי יגנד מגודרי יון או קולטנים בתאי עצב מפרוסות מוח.

בניסויים שלנו, אנחנו באופן שגרתי להקליט מדופמין (DA)-ייצור תאי עצב באזור גחון tegmental (VTA) וsubstantia nigra החלקי compacta (SNC). במצב מתח מהדק, יישום לחץ של אצטילכולין או ניקוטין לתאים אלה בדרך כלל תוצאה נוכחית מהירה, פנימה קטיון שמגיע לשיא תוך 100-200 אלפיות (איור 1 א, ב). דעיכתו של הזרם מוכתבת במידה רבה על ידי הפצת הסמים מהאתר של פעולה, והאם אנזימים בפרוסה נמצאים לעכל את התרופה לצורה פעילה. לדוגמה, אח הוא במהירות על ידי הידרוליזה acetylcholinesterases הנמצא...

במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד תעלות היונים המגודרות של ליגנד בתאי עצב מפרוסות מוח מוכנות שמקורן בעכברים בוגרים. זה מושג על ידי חילוץ מוח שלם מעכבר בוגר שעבר טרנס קארדי עם נוזל מוחי מלאכותי מיוחד. השלב השני הוא הכנת פרוסות מוח מאזור המוח המעניין בכיוון הרצוי.לאחר מכן, פרוסות מוח בודדות המונחות בתא הקלטה מתחת למיקרוסקופ ונוירונים בודדים בתוך הפרוסה מזוהים להקלטה. השלב האחרון הוא הקלטת מהדק תיקון תא שלם של נוירון ואחריו יישום מקומי של תרופות להפעלת תעלות היונים המגודרות ליגנד באמצעות מיקרו פיפטה שנייה מזכוכית. בסופו של דבר, שיטה זו של חקר תעלות יונים מגודרות ליגנד משמשת להצגת התכונות הביופיזיקליות של קולטנים מקומיים על נוירונים חיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון יישום אמבטיה או מתן תרופות ביוטיוב, הוא שהעברת תרופות לנוירון המוקלט מהירה מאוד ומקומית. ניתן להעביר כמויות קטנות של תרופה ולחקור מספר נוירונים מפרוסה אחת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קולטני האצטילכולין הניקוטיניים, כגון קביעת קולטני הניקוטין המקומיים המעורבים בתא הביופיזי, התגובות הביולוגיות וההתנהגותיות לניקוטין.בהליך זה, לאחר הקרבת עכבר בוגר והשגת המוח, חתוך את המוח בכיוון הרצוי כדי לכלול את אזור העניין על לוחית מתכת מקוררת קרח. לאחר מכן, הדביקו את גוש המוח עם דבק סופר על משטח הבמה היבש של פורס רוטט. לאחר מכן טבלו את גוש המוח בתמיסת התאוששות NMDG של ארבע מעלות צלזיוס והמשיכו לבעבע את התמיסה בקרבוגן.לאחר מכן חותכים את הפרוסות בעובי 250 מיקרון כל אחת מאזור המוח המעניין. לאחר מכן, משוך מיקרו פיפטה תיקון סטנדרטית עם התנגדות של ארבעה עד שישה מגה אוהם באמצעות המושך החום הבוער הניתן לתכנות. מלאו את המיקרו פיפטה בתמיסת הקלטה תוך-תאית מתאימה.לאחר מכן העבירו פרוסה לתא ההקלטה על הבמה של מיקרוסקופ זקוף, היכוך ברציפות את הפרוסה עם הקלטה סטנדרטית מוגזת של 32 מעלות צלזיוס A CSF במהירות של 1.5 עד 2.0 מיליליטר לדקה. תחת המיקרוסקופ, אתר ומרכז את אזור העניין במוח באמצעות יעד אוויר פי 10. לאחר מכן, דמיין את הנוירונים הבודדים באמצעות אובייקט טבילה במים אינפרא אדום קרוב פי 40 המחובר לאופטיקה הניגודית של הפרעות דיפרנציאליות IR, ומכשיר מצמד טעון אינפרא אדום במהירות גבוהה או מצלמת וידאו CCD תחת תצפית IR DIC נוירונים בריאים מציגים קרום פלזמה אפור בהיר חלק לאחר הדמיית תאים.בצע הקלטת תא שלם בטכניקות קונבנציונליות. כעת משוך עוד מיקרופיפט מהדק תיקון סטנדרטי כמו קודם כדי לייצר שני קצות אחיות זהים מאותה חתיכת זכוכית עם התנגדות אופטימלית של כחמישה מגה אוהם. מלאו מחדש את אחת הפיפטות המיקרו בתמיסה של תרופה מדוללת בהקלטה סטנדרטית מוגזת CSF כוון את הקצה כלפי מטה והזיז את המיקרופיפט המלא בתרופה כדי להסיר בועות אוויר כלואות במיקרו פיפטה.לאחר מכן, הרכיב את המיקרו פיפטה המלאה בתרופה למחזיק פיפטה המחובר למניפולטור המיקרום. יש לחבר את מחזיק הפיפטה עם צינורות למערכת פליטת לחץ מתאימה. פלוט ידנית לחץ שלוש עד ארבע פעמים למיקרו פיפטה על מנת לבנות לחץ מספיק מאחורי עמוד הנוזל.לאחר מכן הורד את פיפטת התרופה לתוך הפרוסה באמצעות מניפולטור מיקרום באמצעות I-R-D-I-C. תצפית. מקם את המיקרו פיפטה של התרופה על פני פרוסת הרקמה. בצע פליטת לחץ אחת ופקח על קרבת הקצה לתנועת פסולת הקשורה לפליטה ולקצה המיקרו פיפטה.לכל סימן לכך שהקצה סתום או חסום, אם הקצה סתום, משוך את הפיפטה והחלף אותה בחדשה. התקרב לתא המוקלט באלכסון מהחלק העליון של הפרוסה. כאשר הוא נמצא במצב הסופי, קצה הפיפטה המלאה בתרופה נמצא באותו מישור מוקד כמו התא המוקלט וקצה האלקטרודה המוקלטת, והוא נמצא במרחק של כ-10 עד 40 מיקרון מהתא המוקלט.אם קצה הפיפטה המלא בתרופה נמצא מעל התא המוקלט, הכוח מפליטת הלחץ עלול לשבש את איטום הג'יגה של התא, ואז להקליט את האצטילכולין ו/או הניקוטין שעוררו זרמים תאיים תוך החזקת הנוירונים במצב מהדק מתח. למרות שניתן להפעיל דחיית לחץ באופן ידני בעת שימוש בשפריצר פיקו 3 לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור יותר, רצוי להפעיל את דחיית הלחץ באמצעות מערכת הרכישה ופולס TTL דיגיטלי. כדי לשפר את הניסוי, ניתן להרכיב את מחזיק הפיפטה המלא בתרופות על מתרגם חשמלי פיזו חד מימדי המסוגל לקבל כניסת מתח אנלוגית, אשר מותקן לאחר מכן על המיקרו מניפולטור ברמת דיוק גבוהה.מתרגם חשמלי פיזו שימושי מכיוון שניתן לשלוט ביתר קלות על תנועת הפיפטה המלאה בסם לתוך ומחוץ לפרוסה, כולל התזמון ומהירות הכניסה של יציאת הניסוי מניסוי לניסוי. לאחר מכן, כוונן את המתח לערכו המקסימלי באמצעות הפוטנציומטר הנשלט ידנית על המגבר הנשלט על ידי מתח חשמלי. השתמש במניפולטור המיקרו כדי למקם את הפיפטה המלאה בתרופה בפרוסה.החזר את הפיפטה על ידי הפחתה ידנית של המתח לאפס במגבר הנשלט על המתח החשמלי של פאזו באמצעות אות פלט אנלוגי ממערכת רכישת ההקלטה. העבר את הפיפטה המלאה בתרופה לתוך הפרוסה לפני שמתרחש דופק TTL פליטת לחץ. לאחר התרחשות הדופק, משוך את הפיפטה.איור זה מציג את התגובה הייצוגית של נוירון דופמין ל-100 אצטילכולין מיקרו-מולרי המיושם באופן מקומי, ואיור זה מציג את התגובה הייצוגית של נוירון דופמין אחר ל-100 ניקוטין מיקרו-מולרי המיושם באופן מקומי. להלן פוטנציאל הפעולה הספונטני של נוירון דופמין בפרוסת מוח של עכבר אלפא שש L תשע ראשוני S המוחזקת במצב מהדק נוכחי. היישום של מיקרומולר אחד של ניקוטין באמצעות דחיית לחץ של 250 אלפיות השנייה גרם לשינויים בפעולה, בקצב הירי הפוטנציאלי ובפוטנציאל הממברנה במנוחה.באמצעות חיפוש הסף בתוכנת מהדק P, נגזר קצב הירי המיידי כדי לסווג את הנוירונים לפי סוגי תגובת האצטילכולין נוירוני קולוס עליונים בודדים. באלפא שש L תשעה ראשוניים פרוסת מוח של עכבר היו מהודקים במתח ואחריהם יישום מקומי של ניקוטין מיקרו-מולרי אחד באמצעות פליטת לחץ נוירונים מסוג 1 הפגינו IPCs מוגברים. לאחר יישום ניקוטין, נוירונים מסוג 2 הפגינו זרמים גדולים פנימה ועלייה ב-EPC בתגובה ליישום ניקוטין.המתרגם החשמלי של פיזו מציע עקביות ומגן מפני דליפת תרופות. נוירון דופמין VTA בפרוסת מוח של עכבר אלפא שש L תשע ראשוני S נרשם במצב מחיאת כפיים במתח. במהלך מריחת ניקוטין מיקרו-מולרי אחד, הפיפטה המלאה בניקוטין תמרנה למצב הסופי לפני פליטת הלחץ ונסוגה לאחר הפליטה באמצעות מתרגם חשמלי פאזו.תגובה שנייה נרשמה שתי דקות לאחר הראשונה כדי להוכיח שלא התרחשה דה-סנסיטיזציה של N-A-C-H-R. הניסויים חזרו על עצמם עם מריחה של 10 ניקוטין מיקרו-מולרי. שוב, לא נצפתה דה-רגישות בתגובה השנייה בהשוואה לראשונה.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות בלבד אם היא נעשית כראוי. במקרים מסוימים, ניתן לחקור 10 עד 15 נוירונים מפרוסת מוח אחת תוך יום אחד בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למקם במדויק את הפיפטה המלאה בתרופה כדי לשמור על איזון בין הפעלה מלאה של קולטני ניקוטין על פני השטח לבין שלמות חותם הג'יגה.

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו שיטה חדשנית של לכימות ניאציניות קולטני אצטילכולין שינויים בתוך אזורים subcellular של תת ספציפיים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התמכרות לניקוטין באמצעות שילוב של גישות כולל תיוג חלבון פלואורסצנטי של הקולטן באמצעות עקום בגישה רפאים confocal הדמיה.

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

פיתחנו תכשיר כימרי גנטי של מעגל היפוקמפוס גחוני - אקומבנס במבחנה המאפשר הדמיה חיה ישירה לנתח מנגנונים פרה-סינפטיים של קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (nAChRs) בתיווך העברה סינפטית. הכנה זו מספקת גם גישה אינפורמטיבית לחקר המנגנונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים של פלסטיות סינפטית.

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

סוללה ממוחשבת מאומתים של בדיקות שתלמידים neurophysiological משמש כדי ללמוד pharmacodynamic השפעות על מערכת העצבים המרכזית של תרופות פיתח בפיתוח בשלב מוקדם. כדי להדגים את הסוללה מבחן, מתוארים את ההשפעות חריפה של mecamylamine ואת ההיפוך של תופעות אלה על ידי שתי תרופות אגוניסט.

סוללה בחינה ממוחשבת ללמוד Pharmacodynamic השפעות על מערכת העצבים המרכזית של שימוש בסמים בפיתוח התרופה בשלב מוקדם

אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפול באותו מישור אנטומיים.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

מאמר זה מציג שיטה ללימוד קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs) העכבר פרוסות המוח על-ידי uncaging ניקוטין. כאשר משולב עם הקלטה מלחציים תיקון בו זמנית של סריקת מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2, ניקוטין uncaging מחבר קולטן nicotinic פונקציה עם מורפולוגיה הסלולר, מתן הבנה עמוקה יותר של שימוש הנוירו-ביולוגיה.

חקירת פונקציה קולטן אצטילכולין Nicotinic פרוסות המוח העכבר באמצעות לייזר פלאש פוטוליזה של ניקוטין Photoactivatable

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה לזיהוי של שחרור מונואמין אנדוגני באמצעות פרוסות מוח חריפות. ההתקנה משתמשת בלוח 48 באר המכיל מחזיק רקמות לשחרור מונואמין. מונואמין ששוחרר מנותח על ידי HPLC יחד עם זיהוי אלקטרוכימי. בנוסף, טכניקה זו מספקת שיטת סינון לגילוי סמים.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

פרוטוקול זה מתאר ביטוי וכימות של תת-יחידות קולטני אצטילכולין נוירונליים באמצעות קו התאים Neuro-2a ביונקים. תגיות פלואורסצנטיות רגישות ל-pH ומיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרים הערכה מדויקת של מיקום הקולטנים בממברנת הפלזמה לעומת אלו המובעים במחלקות תוך-תאי ניטרליות pH, ומסייעים לחקר תנועת nAChR ומודולציה פרמקולוגית.

מיקום של ממברנת הפלזמה וקולטני אצטילכולין ניקוטיניים תוך-תאיים באמצעות הדמיה כמותית בתאי יונקים

חקור פונקציית קולטן אצטילכולין ניקוטינית בנוירונים מפרוסות מוח עכבר בוגר באמצעות יישום מקומי של תרופות וטכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר וממוקד של תכונות ביופיזיקליות של קולטנים נייטיביים בתאים חיים.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

גלה סרטונים נוספים