Name: נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו לייצר תשתיות תרבית תאים ביומימטיות להנדסת רקמות לב מקרוסקופיות באמצעות ליתוגרפיית כוחות קפילריים. שיטה זו מאפשרת תבניות ננו מדויקות ליישור תאי שריר הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D. H. Kim מודה למחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת וושינגטון על קרן הסטארט-אפ החדשה של הפקולטה. D. H. Kim נתמך גם על ידי פרס Perkins Coie לגילוי, פרס שותפות המחקר התרגומי של קרן Wallace H. Coulter, קרן גילוי מדעי החיים של מדינת וושינגטון, ומענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי (13SDG14560076). J. Macadangdang ו- A. Jiao מודים לתמיכה מה-NIH Bioengineering מלגת מענק אימון לב וכלי דם. תמיכה נוספת לעבודה זו מגיעה ממענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01HL111197 ל-M. Regnier.

כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת חדר (~ 23 ° C) אלא אם צוינו אחרת. 1. ייצור של הסיליקון מאסטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות סיליקון נקיות עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסה סיליקון בספין coater במהירויות סיבוב של 2,000-4,000 סל&quot;ד כדי לייצר סרט עבה 0.3-0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבנית סרט photoresist עם המידות הנכונות באמצעות מערכת photolithography </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מלא לטבול את פרוסות סיליקון מצופה photoresist דוגמת בנפח מתאים של פתרון photoresist המתפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את פרוסות סיליקון מצופה photoresist פיתחו עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצירת מערכים של רכסים בקנה מידה תת מיקרון עם צד קירות ליד אנכיים, לחרוט יון תגובה עמוק הסיליקון החשוף באמצעות מערכת תחריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את photoresist שנותר על ידי הנחת פרוסות סיליקון במערכת אשר פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את סיליקון wafers עם חותך יהלום שקצה לאדוני סיליקון בגודל המתאים לדפוס העתק שלאחר מכן. </li></ol> 2. ייצור של עובש רשות החשמל מהסיליקון מאסטר הערה: נפח שיש להוסיף לאדון סיליקון לnanofabrication ישתנה בהתאם לאזור של המאסטר nanopatterned להיות משוכפל כמו גם הצמיגות של acrylate פוליאוריטן הפתרון (רשות החשמל). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח נקי סיליקון הורים עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בצד דפוס אדון סיליקון בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדון סיליקון עם 2 ס&quot;מ X 2 סנטימטר משטח דפוס, פיפטה 40 μl של רשות החשמל על פני השטח התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גיליון של 4 סנטימטר סרט X 4 סנטימטר שקוף פוליאסטר (PET) על רשות החשמל חילק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ כלפי מטה על גיליון PET ולהפיץ את הרשות לשירותים הציבורית מתחת לסדין על פני התבנית באמצעות רולר או משטח קצוות שטוח (כגון כרטיס), כך שכלדפוס הוא מכוסה על ידי prepolymer רשות החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מאסטר סיליקון, prepolymer, וPET כ 10 סנטימטר מתחת אור UV 20 ואט (115 V) (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות. כדי להיות יעיל, אורך גל אור UV יכול להיות בכל מקום בין 310-400 ננומטר. עוצמת האור היא 10-15 mW / 2 סנטימטר על פני השטח של המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריפוי, להסיר סרט PET לאט עם מלקחיים. רשות לשירותים ציבוריים צריכה לצרף לסרט PET עם שלילי של nanopattern אדון סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא nanopatterns רשות החשמל / PET תחת UV לפחות 12 שעה לפני השימוש. חשיפה היא לא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות אדוני סיליקון, למקם סרט נוסף של PET על גבי האדון ללא תוספת של רשות החשמל ולחשוף לאור UV (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות ולהסיר סרט PET. זו תסיר את כל מונומרים unreacted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את אדון סיליקון עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז. </li></ol> 3 א. פולימר פוליאוריתן Nanopatterning </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25 שקופיות זכוכית עגולות בקוטר מ&quot;מ על ידי הנחת בחדר טיפול באוזון ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות זכוכית שטופלה באוזון על גבי בלוק PDMS קטן לטיפול קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שכבה דקה של אמרגן הידבקות משטח עם מכחול לשקופיות זכוכית. שקופיות זכוכית אוויר יבשות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף הזכוכית על פיסת נייר במדפסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק לוותר 10 μl של פוליאוריטן (PU) מראש פולימר (נועה 76) למרכז שקופית זכוכית. ודא שאין בועות נמצאות אחרי כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובש רשות החשמל פלייס, דפוס עם הפנים כלפי מטה, לשקופית הזכוכית. לפזר את יחידת השיטור באופן אחיד על פני השטח של שקופית הזכוכית על ידי גלגול הרים גליל גומי לאורך עובש רשות החשמל. נייר מדפסת יספוג הצפת פולימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנורת UV ואט. זמן פלמור של יחידת השיטור תלוי בכוחו של מקור קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימה ממקור אור UV ולקלף בזהירות את תבנית רשות החשמל משקופיות זכוכית PU מצופה. פלמור של פו נחשב גomplete כאשר קליפות רשות החשמל העובש נקי מן המדגם ושקופיות זכוכית PU יש מראה ססגוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש. </li></ol> ב 3. Nanopatterning midi (lactide-Co-Glycolide) Hydrogel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עובש PDMS שטוח ידי ערבוב נמרץ בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן ריפוי אלסטומר סיליקון ביחס 10:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעורב PDMS מבשר פתרון לתוך צלחת פטרי, כך שמבשר PDMS מגיע 5 מ&quot;מ עד הקצה של המנה (כלומר, כך שPDMS הוא 5 מ&quot;מ עובי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי ומבשר PDMS בייבוש במשך שעה 1 לדגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר צלחת פטרי ומבשר PDMS לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס למשך לפחות 2 שעות כדי לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר PDMS נרפא, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את PDMS שטוח לתוך 3 סנטימטר חלקי ריבוע בגודל 3 סנטימטר. אלה יהיו תבניות PDMS השטוח השתמשו מאוחר יותר בתהליך הדפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות זכוכית עגולה בקוטר 25 מ&quot;מ נקי על ידי placing באלכוהול איזופרופיל ל30 דקות בsonicator מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשים ניקו זכוכית תחת O 2 / N 2 גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק לוותר על פתרון PLGA 100 μl (15% w / v PLGA בכלורופורם) על גבי שקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובש PDMS שטוח על גבי PLGA לוותר לספוג את הממס ולקבל משטח PLGA שטוח. החל לחץ קל (~ 10 kPa) על ידי הצבת משקל 200 גרם בחלק העליון של PDMS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לקלף עובש PDMS שטוח ומניח את מכסה הזכוכית על צלחת שחומם מראש (120 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות כדי להסיר ממס שיורי ולהגדיל את ההידבקות בין PLGA וכיסוי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית בNP רשות החשמל על גבי PLGA השטוח ולהפעיל לחץ קבוע (~ 100 kPa) וחום (120 ° C) על ידי הצבת במשקל 1 קילוגרם על גבי עובש רשות החשמל בעת על צלחת החימום במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשקל מהשקופית לכסות PLGA ולאפשר לקרקע להתקרר לטמפרטורת חדר. אין להסיר עובש רשות החשמל עד לקרקע הייתהמקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמצע התקרר מספיק, לקלף בזהירות את תבנית NP רשות החשמל, חושף את תשתית NP PLGA. תשתית NP PLGA צריכה מראה ססגוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש. </li></ol> 4. זריעת תאים ותרבות הערה: פרוטוקול זה מתאר את התרבות של myocytes ילוד חדרית העכברוש (NRVMs) ושריר לב H7 האנושי גזע עוברי שמקורם בתא (hESC-CMS), אבל מקורות של תאים אחרים עשויים להיות בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את coverslips ANFS (PU או PLGA) לצלחת קלקר 35 מ&quot;מ רקמת תרבות. פיפטה 20 μl של Norland האופטי דבק (NOA83H) לתחתית הצלחת ומניח בעדינות את coverslip ANFS על גבי נועה. לאפשר דבק להתפזר ולכסות את תחתית coverslip כולו. לרפא את נועה על ידי חשיפה למנת UV עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ANFS על ידי שטיפה עם 2 מיליליטר של 70% אתנול פתרון מימיים במשך 5 דקות, פעמיים. הסר דוארthanol ידי שאיפה. לאפשר ANFS לחלוטין אוויר יבש ל~ 1 שעות מתחת למנורת עיקור UV (λ = 200-290 ננומטר) בארון הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידבקות הסלולר היא משופרת על ידי ציפוי ANFS בפיברונקטין הלילה. לדלל פיברונקטין במים די ל5 מיקרוגרם / מיליליטר. פיפטה 2 מיליליטר של תמיסת פיברונקטין לתוך צלחת. הנח חממה ב 37 ° C ו-CO 2 לילה 5% (לפחות 6 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג NRVMs, hESC-CMS, או תאי לב אחרים של עניין על פי פרוטוקולים קודמים 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם תא צנטריפוגה ב 1,000 סל&quot;ד במשך 3 דקות עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בתקשורת והתרבות המתאימה לריכוז של 4.6 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות פיפטה 200 μl של השעיה תא על ANFS מעוקר. ודא השעיה תא נשארת על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאי חממה ב 37 ° C ו 5%CO 2 למשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לANFS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להסיר את המדיה ולשטוף עם 2 מיליליטר של DPBS פעמיים כדי להסיר תאים עודפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים. תרבות התאים למפגש. החלף תקשורת בכל יום אחר. </li></ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Engineered+Human+Myocardium+With+Mechanical+Loading+and+Vascular+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture.</a> Circulation Research. 109, 47-59 (2011).</li>
<li>Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Cultures+With+Controlled+Macroscopic+Anisotropy%3A+A+Model+for+Functional+Electrophysiological+Studies+of+Cardiac+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle.</a> Circulation Research. 91, (2002).</li>
<li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).</li>
<li>Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+Engineering+the+Cell+Surface+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring and Engineering the Cell Surface Interface.</a> Science. 310, (2005).</li>
<li>Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+engineering+of+biomimetic+surfaces%3A+cues+from+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix.</a> Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).</li>
<li>Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+research+and+clinical+applications+of+PLGA-based+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).</li>
<li>Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Combined+Effect+of+Substrate+Rigidity+and+Topographic+Guidance+on+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology.</a> IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Nanopatterns+as+Enabling+Tools+for+Analysis+and+Control+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells.</a> Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).</li>
<li>Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+Platforms+for+Cell+Mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterned+cardiac+cell+patches+promote+stem+cell+niche+formation+and+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration.</a> Integr Biol. 4, 1019 (2012).</li>
<li>Kim, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanostructures+of+polyethylene+glycol+for+applications+to+protein+adsorption+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion.</a> Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).</li>
<li>Hwang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Assays+of+Endothelial+Cells+on+Nanopatterned+Surfaces+within+a+Microfluidic+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel.</a> Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+Future+of+Cardiovascular+Disease+in+the+United+States%3A+A+Policy+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, 933-944 (2011).</li>
<li>Legrice, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+the+heart%3A+ventricular+myocyte+arrangement+and+connective+tissue+architecture+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).</li>
<li>Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+MR+tractography+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Diffusion MR tractography of the heart.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Fluxes+Involved+in+Control+of+Cardiac+Myocyte+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction.</a> Circulation Research. 87, 275-281 (2000).</li>
<li>Mohrman, D. E., Heller, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohrman%2C+DE+%22Cardiovascular+Physiology%22">Cardiovascular Physiology</a>. , McGraw Hill Medical. (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cardiomyocytes+Derived+From+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Circulation Research. 104, (2009).</li>
<li>Qian, J. -Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytosolic+Ca2%2B+dynamics+in+cultured+Guinea+pig+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+to+identify+potential+cardiotoxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants.</a> Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).</li>
<li>You, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistically+Enhanced+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+by+Culture+on+Nanostructured+Surfaces+with+Induction+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media.</a> Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopography-guided+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).</li>
<li>Mannix, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomagnetic+actuation+of+receptor-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).</li>
<li>Karuri, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+length+scale+topography+enhances+cell-substratum+adhesion+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells.</a> J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).</li>
<li>Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cell+adhesion+by+nanoscale+RGD+organization+and+mechanical+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus.</a> J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).</li>
<li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+human+mesenchymal+cell+differentiation+using+nanoscale+symmetry+and+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder.</a> Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosize+and+Vitality%3A+TiO+2Nanotube+Diameter+Directs+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate.</a> Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).</li>
<li>Tung, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in tissue culture.</a> Journal of Electrocardiology. 39, (2006).</li>
<li>Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+the+cardiomyocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer.</a> Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).</li>
<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

רקמות לב תפקודית בוגרות חסרות לשניהם in vivo ו במבחנת יישומים של הנדסת רקמות לב. שיטות nanofabrication CFL שתוארו כאן הן טכניקות חזקות להשגת יישור סלולארי והשפעה על תפקוד רקמות מקרוסקופית עקב יכולת ההרחבה של המערכת. יכולים בקלות להיות בדוגמת שטחים גדולים ומשמשים לתרבית תאים. יישור סלולארי מקרוסקופית הוא חיוני בהנדסת רקמת לב על מנת ליצור biomimetic, רקמה תפקודית כפי שהוא משפיע על תכונות שניהם מכאניות וחשמליות של שריר הלב 38. <p class="jove_content" ...

מחלות לב וכלי דם היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם ולהציג את נטל כלכלי וחברתי כבדות משקל על 1,17 מערכת הבריאות העולמי מתוח כבר. יש הנדסת רקמות לב שתי מטרות נפרדות: (1) כדי להתחדש שריר הלב פגוע לאחר מחלה או קרדיומיופתיה איסכמית או (2) ליצור מודל נאמנות גבוה של הלב במבחנת הקרנת סמים או דוגמנות מחלה. הלב הוא איבר מורכב שחייבים לעבוד כדי לספק דם לגוף כל הזמן. מבני מינרית בצפיפות של שריר לב ורקמות התומכות מסודרים בדפוסי סליל לאורך קיר לב 18,19. הלב הוא גם בשילוב Electromechanically 20 באופן מתואם מאוד כדי להוציא דם בצורה יעילה לגוף 21. כמה מכשולים עיקריים יישארו לטפל, עם זאת, לפני העיצוב המורכב של הטבע יכול להיות סכם באופן מהימן במבחנה.ראשית, למרות ששיטות בידול cardiomyocyte חזקות תמשיך להיות מפותחות 22, hPSC-CMS עדיין תערוכת פנוטיפים ולא בשלה. מאפייני אלקטרו והמורפולוגיה להתאים באופן הדוק ביותר רמות עובריות 23. שנית, כאשר כל הזמן בתנאי תרבות מסורתיים, שניהם נגזרים תאי הגזע ושריר לב עיקרי לא יצליחו להרכיב למבני ילידים, כמו רקמות. במקום זאת, התאים הופכים לכיוון אקראי ואינו מציגים את המראה בצורת המוט התאגדו של שריר הלב מבוגר 24. הסביבה תאית מטריקס (ECM) שבה תאי אינטראקציה משחקת תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים רבים 11,13,25. ECM מורכב מרמזים מורכבים, מוגדרים היטב מולקולריים וטופוגרפיים המשפיעים על המבנה ותפקוד של תאים 6,26 באופן משמעותי. בתוך הלב, יישור סלולארי עוקב מקרוב סיבי ECM קנה מידה ננומטרי הבסיסית 2. ההשפעה של nanotopograph אלהרמזי iCal בתא ותפקוד רקמות, עם זאת, הוא רחוק מלהיות מובן לחלוטין. מחקרים ראשוניים של אינטראקציה תא ביולוגי בקנה מידה ננומטרי לציין את החשיבות הפוטנציאלית ואת ההשפעה של רמזים טופוגרפיים תת מיקרון לתא איתות 27, הידבקות 28-30, 31 בצמיחה, ובידול 32,33. עם זאת, בשל הקושי בפיתוח מצעי nanofabricated לשעתק וניתן להרחבה, מחקרים כאלה לא יכולים לשחזר את ההשפעות סלולריות רב היקף של המתחם בסביבת ECM vivo. בפרוטוקול זה, טכניקת nanofabrication פשוטה וחסכונית כדי לייצר פיגומי תרבית תאים מחקה יישור ECM לב סיבי ילידים מתואר, המאפשרת מגוון רחב של חקירות רומן של אינטראקציות cardiomyocyte-ביולוגי. הבנה כיצד שריר לב באינטראקציה עם סביבת ECM ננו עלולה לאפשר את היכולת לשלוט בהתנהגות סלולרית באופן הדוק יותר לחקות תפקוד רקמת ילידtion. יתר על כן, monolayers התא הוא מערכת ניסיונית פשוטה בהשוואה למבני 3D, אך עדיין מפגין התנהגות רב תאית מורכבת לחקירות מעמיקות והקרנה פונקציונלית 2,34-36. לבסוף, יכולים לשמש פיגומים כאלה כדי לשפר את תפקוד שתל סלולארי כאשר מושתלים לתוך הלב למטרות משובי 37.

<table><tbody><tr><td>פיברונקטין</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>מנוע הידבקות משטח (פריימר זכוכית)</td> <td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>רולר גומי רך</td><td>Speedball</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוסות סיליקון</td><td>NOVA חומרים אלקטרוניים</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>מפתח Photoresist</td>מערכת ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים <td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תחריט</td><td>מערכות טכנולוגיית פני השטח</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>מערכת פלזמה אשר</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ריפוי אוזון</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O- 08</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ריפוי היתוך</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>ספין מעיל</td><td>לורל טכנולוגיה</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET סרט</td><td>SKC ושות', בע"מ</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"מ שקופיות זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 גרם משקולות</td><td>T9FB503120</td><td></td> <td>גלובלי</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חמה</td><td>קורנינג</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>ברנסון</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

מחלות לב וכלי דם נשארת הגורם המוביל למוות בכל העולם 1. הנדסת רקמות לב טומנת בחובו הבטחה רבה כדי לספק תגליות רפואיות פורצות עם המטרות של פיתוח רקמות פונקציונליות להתחדשות לב, כמו גם מבחני מיון במבחנה. עם זאת, את היכולת ליצור מודלים באיכות גבוהה של רקמת לב הוכיחה קשה. של הלב מטריצה ​​תאית (ECM) היא מבנה מורכב בהיקף של שני האותות ביוכימיים ויומכנית החל מיקרו לקנה המידה ננומטרי 2. לאחרונה מקומי תנאי העמסה מכאנית ואינטראקציות התא-ECM הוכרו כמרכיב חיוני בהנדסת רקמות לב 3-5. חלק גדול מECM הלב מורכב של סיבי קולגן מיושרים עם קטרים ​​בקנה מידה ננו שמשפיע על מבנה רקמה וצימוד אלקטרו 2 באופן משמעותי. למרבה הצער, כמה שיטות havהיה דואר מסוגל לחקות את הארגון של סיבי ECM עד לקנה המידה ננומטרי. הפיתוחים אחרונים בטכניקות nanofabrication, לעומת זאת, מאפשרים לעיצוב וייצור של פיגומי מדרגי המחקים את in vivo רמזי קשיחות מבניים ומצע של ECM בלב 6-9. כאן אנו מציגים את הפיתוח של שני לשחזור, חסכוני, ותהליכי nanopatterning להרחבה עבור היישור התפקודי של תאי לב באמצעות פולי ביולוגית הפולימר (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 ופוליאוריטן (PU) פולימר מבוסס. מצע nanofabricated anisotropically אלה (ANFS) לחקות את ECM הבסיסי של רקמות מאורגנות היטב, מיושרות והוא יכול לשמש כדי לחקור את תפקידה של nanotopography על מורפולוגיה תא ותפקודו 10-14. באמצעות אב סיליקון nanopatterned (NP) כתבנית, עובש acrylate פוליאוריטן (רשות החשמל) הוא מפוברק. עובש רשות החשמל זה משמש לאחר מכן לרשותttern הידרוג&#39;ל PU או PLGA באמצעות סיוע UV או ליתוגרפיה בתיווך ממס כוח הנימים (CFL), בהתאמה 15,16. בקצרה, PU או PLGA מראש פולימר הוא טיפה לוותר על coverslip זכוכית ועובש רשות החשמל מונח על גבי. לCFL בסיוע UV, PU מכן נחשף לקרינת UV (λ = 250-400 ננומטר) לריפוי. לCFL בתיווך ממס, PLGA מוטבע באמצעות חום (120 מעלות צלזיוס) ולחץ (100 kPa). לאחר הריפוי, עובש רשות החשמל הוא קילף, והשאיר מאחורי ANFS לתרבית תאים. תאים ראשוניים, כגון myocytes ילוד חדרית העכברוש, כמו גם שריר לב שמקורם בתאים אנושי pluripotent גזע, יכולים להישמר בANFS 2.

איור 1 הוא סקירה סכמטי של תהליך הייצור לשתי שיטות הייצור. בשל התאבכות של אור הנגרם על ידי הטופוגרפיה ננומטרי, nanopatterning צריך לגרום ססגוני משטח לANFS. איור 2 מתאר ססגוני משטח זה על coverslip דוגמת היטב 25 מ&quot;מ NP-PU (איור 2 א) עם רכס 800 ננומטר וגרוב רוחב (איור 2). המראה הססגוני של ANFS ישתנה מעט בהתאם לרוחב הרכס וגרוב. לאחר זריעת התאים ע...

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי. השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר תשתיות תרבית תאים ביו-מימטיות להנדסה של המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור תבנית מאסטר מסיליקון בעלת הארכיטקטורה טופוגרפית הרצויה באמצעות תגובת חריטה של יונים ריאקטיביים (deep reactive ion etching). השלב השני הוא העברת התבנית הטופוגרפית הרצויה מהמאסטר מסיליקון לתבנית PUA באמצעות ליטוגרפיה של כוחות קפילריים בסיוע UV.בשלב הבא, תבנית ה-PUA משמשת כסכמה לייצור תשתיות לתרבית תאים מחומרים פולימריים שונים, בהתאם ליישום הרצוי, באמצעות ליתוגרפיית כוחות קפילריים בעזרת UV או בתהליך מתווך בממס. השלב הסופי הוא זריעה של קרדיומיוציטים ראשוניים או כאלה המופקים מתאי גזע על תשתיות תרבית התאים בעלות התבנית הננומטרית לצורך ניתוח המשך. לבסוף, מיקרוסקופיה בשדה בהיר ואימונופלואורסצנציה משמשות להצגת שינויים במורפולוגיית התאים ובסידור החלבון המכווץ בתוך הקרדיומיוציטים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing), הוא שליתוגרפיה בכוח קפילרי מייצרת תשתיות לתרבית תאים עם תבניות ננומטריות שיכולות להשרות יישור מבני של שכבות חד-שכבתיות של רקמת לב ללא הסתמכות על שגשוג או נדידה של תאים. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשיג תובנות לגבי הקשר בין המבנה לתפקוד של רקמות לב, ניתן להחילה גם על מערכות אחרות, כגון מכנוביולוגיה של סרטן. כדי לחקור את השפעת טופוגרפיית המטריקס על נדידת תאים, התחילו את ההליך בניקוי של פני השטח של תבנית הסיליקון (silicon master) באמצעות 100% ethanol או xylene וייבוש תחת גז חנקן.בשלב הבא, הניחו את תבנית המאסטר מסיליקון כאשר צד התבנית פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרי; עבור תבנית מאסטר מסיליקון עם תבנית פנים בגודל 2 cm על 2 cm, טפטפו עליה 40 µL של PUA. לאחר מכן, הניחו יריעה של פילם פוליאסטר שקוף בגודל 4 cm על 4 cm מעל ה-PUA ששופך, לחצו על יריעת ה-PET ופזרו את ה-PUA מתחת ליריעה על פני התבנית באמצעות גלגל או משטח שטוח, כך שכל התבנית תהיה מכוסה בפרה-פולימר של ה-PUA. לאחר מכן, הניחו את תבנית המאסטר מסיליקון, הפרה-פולימר ויריעת ה-PET במרחק של כ-10 cm מתחת למנורת UV בהספק של 20 W למשך 50 שניות.לאחר הפולימריזציה, הסר את סרט ה-PET באיטיות באמצעות פינצטה. ה-PUA אמור להיצמד לסרט ה-PET עם תבנית שלילית של ננו-הדפסת ה-Silicon Master. לאחר מכן, בצע פולימריזציה של ננו-תבניות ה-P-U-A-P-E-T תחת UV למשך 12 שעות לפחות לפני השימוש.כדי לנקות את תבניות הסיליקון (Silicon Masters), הנח שכבת PET נוספת על גבי התבנית ללא הוספת PUA. חשף אותה לאור UV למשך 50 שניות והסר את שכבת ה-PET. לאחר מכן, שטוף את תבנית הסיליקון ב-100% ethanol או ב-xylene וייבש תחת גז חנקן.בנוהל זה, יש לטפל בשקופיות זכוכית עגולות בעלות קוטר של 18 מילימטר על ידי הנחתן בתא אוזון למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנח את השקופיות על גבי בלוקים של PDMS כדי לקבע אותן זמנית למטרת טיפול קל. לאחר מכן, מרח שכבה של פריימר לזכוכית על פני השטח של שקופית הזכוכית.יש להניח לפרימר להתייבש באוויר במשך 30 דקות. כעת הניחו את השקופיות על דף נייר מדפסת. טפטפו 10 µL של פוליאוריטן פרה-פולימר למרכז כל שקופית ווודאו שלא נוצרו בועות.לאחר מכן, הניחו את תבנית ה-PUA כשהצד של התבנית פונה כלפי מטה על גבי השקופית; פזרו את הפרה-פולימר של ה-PU באופן אחיד על פני השטח של השקופית באמצעות גלגלת גומי שתעבור על גבי תבנית ה-PUA. נייר המדפסת יספוג את עודפי הפולימר. לאחר מכן, בצעו פוטו-פולימריזציה ב-UV למשך 60 שניות תחת מנורת UV בהספק של 20 watt. לאחר מכן, הוציאו את הדגימה ממקור אור ה-UV וקלפו בזהירות את תבנית ה-PUA מהשקופית המצופה ב-PU; הפולימריזציה של ה-PU נחשבת כעת לשלמה.כאשר תבנית ה-PUA נקלפת בצורה נקייה מהדגימה ולזכוכית ה-PU יש מראה אירידסנטי (צבעוני), ניתן להניח את הדגימות במייבש (desiccator) לאחסון למשך עד חודש. כעת, הצמיד כיסוי זכוכית (cover slip) של NFS לצלחת פוליסטירן לתרבית רקמות של 35 מילימטר; טפטף באמצעות פיפטה 20 µL של NOA לתחתית הצלחת. הנח בעדינות את כיסוי הזכוכית של ה-NPPU מעל ה-NOA ואפשר לדבק להתפשט ולכסות את כל תחתית כיסוי הזכוכית; לאחר מכן, בצע פולימריזציה ל-NOA על ידי חשיפת הצלחת ל-UV למשך 10 דקות.בשלב הבא, עקרו את ה-NP SUBSTRATA על ידי שטיפה פעמיים עם שני מיליליטר של תמיסת אתנול מימית 70% בכל פעם, למשך חמש דקות. הסירו את האתנול באמצעות שאיבה. הניחו ל-A NFS להתייבש לחלוטין באוויר במשך כשעה תחת מנורת עיקור UV בארון הבטיחות הביולוגי.כדי לשפר את ההיצמדות התאית, יש לצפות את ה-A NFS בפיברונקטין למשך לילה, תחילה על ידי דילול הפיברונקטין במים מזוקקים לריכוז של five micrograms per milliliter. לאחר מכן, העבירו בפיפט שני milliliters של תמיסת פיברונקטין לתוך צלחת. לאחר מכן, מקמו את ה-A NFS באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך לילה.השג NR VMs, HESC CMS או תאי לב אחרים בעלי עניין, וסובב את דגימת התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך שלוש דקות כדי לשקע את התאים. הסר בזהירות את העילאי באמצעות שאיבה והקפד לא להפריע למשקע. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים במצע גידול לריכוז של 4.6 times 10 to the six תאים למיליליטר.העברו בזהירות באמצעות פיפט 200 microliters של תגסוס תאים על ה-A NFS הסטרילי וודאו שתגסוס התאים נשאר על לבידה המכסה. לאחר מכן, הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיקשר ל-A NFS. לאחר מכן, הוסיפו למנה שתי milliliters של מצע גידול חמים נוסף והחזירו את התאים לאינקובטור שוב תחת אותם תנאים.לאחר 24 שעות, הסירו את המצע ושטפו פעמיים עם שני מיליליטר של DPBS כדי להסיר תאים עודפים. לאחר מכן, הוסיפו למנה שני מיליליטר של מצע תרבית חם. הניחו את התאים באינקובטור תחת אותם תנאים והמשיכו בגידול.יש להחליף את המצע עד להגעה למצב של התמזגות התאים (confluence), בכל יום שני. איור זה מציג תמונות מייצגות במיקרוסקופ שדה בהיר של NR VMs לאחר שבעת ימי תרבית ושל HESC cms. לאחר 48 שעות של תרבית, NR VMs ו-HESC CMS על פני השטחים מסוג NP מראים אניזוטרופיה מבנית ויישור ברורים, בעוד שתאי שריר לב (cardiomyocytes) על פני שטחים ללא דפוס (UN) מכוונים באופן אקראי.ניתוח אימונוהיסטוכימי מדגיש את השפעת הטופוגרפיה הננומטרית על יישור השלד התאי, סיבי מיקרו-אקטין ואקטין סרקומרי אלפא; בתאים שגודלו על A NFS הם הופכים למיושרים לאורך רכסי הננו, אך נותרים מפוזרים באופן אקראי בתאים על מצעים ללא תבנית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעקר את המצעים לפני השבת התאים, שכן זיהום עלול להוות בעיה משמעותית לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בביולוגיה קרדיווסקולרית לחקור הבשלה לבבית ותאי שריר לב (cardiomyocytes) המופקים מתאי גזע.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ייצור תשתית לתרבית תאים ביו-מימטית באמצעות ליתוגרפיה של כוחות קפילריים עבור יישומים של הנדסת רקמות לב.

capillary-force-lithography-for-cardiac-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

אנו מציגים שיטה לתצהיר מיקרופלואידית של ג'יניפין ופיברונקטין דפוסיים על מצעי PDMS, המאפשרת כדאיות מורחבת של רקמות צפופות תאי שריר חלק בכלי הדם. שיטת ייצור רקמות זו משולבת עם טכנולוגיית סרט דק שרירי כלי דם קודמת למדידת התכווצות כלי הדם לאורך מסלולי זמן רלוונטיים למחלה.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

במסמך זה אנו מציגים שיטה מהירה, נתיישב ועלות נמוכה בדיית בתבניות polydimethylsiloxane מותאם אישית יכול לשמש לייצור המבוסס על הידרוג רקמות מהונדסים עם לסימולציה. בנוסף, אנו מתארים תוצאות הערכות מכני, היסטולוגית שנערכו על רקמות הלב מהונדסים המיוצר בעזרת טכניקה זו.

מותאם אישית מהונדסים תרביות רקמה בתבניות של מאסטרים נחרטו לייזר

פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.

פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

רקמות לב תלת-ממדיות שהונדסו ביולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע התגלו כמודלים מבטיחים לחקר שריר הלב האנושי הבריא והחולה במבחנה תוך שחזור היבטים מרכזיים של נישת הלב הטבעית. כתב יד זה מתאר פרוטוקול לייצור וניתוח רקמות לב מהונדסות בעלות תוכן גבוה שנוצרו מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם.

תכנון ביוריאקטור לשיפור איסוף הנתונים והפקת מודלים של רקמות לב מהונדסות

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למדו לייצר תשתיות תרבית תאים ביומימטיות להנדסת רקמות לב מקרוסקופיות באמצעות ליתוגרפיית כוחות קפילריים. שיטה זו מאפשרת תבניות ננו מדויקות ליישור תאי שריר הלב.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

גלה סרטונים נוספים