נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב
June 10th, 2014
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי. השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר שכבות תרבית תאים ביומימטיות כדי להנדס את המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות. זה מושג על ידי ייצור תחילה של מאסטר סיליקון עם הארכיטקטורה הטופוגרפית הרצויה על ידי תחריט יונים תגובתי עמוק. השלב השני הוא העברת התבנית הטופוגרפית הרצויה ממאסטר הסיליקון לתבנית PUA באמצעות ליתוגרפיה נימית בסיוע UV.
לאחר מכן, תבנית ה-PUA משמשת כתבנית לייצור שכבות תרבית תאים מחומרים פולימריים שונים בהתאם ליישום הרצוי באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי בסיוע UV או בתיווך ממס. השלב האחרון הוא צלחת קרדיומיוציטים ראשוניים או שמקורם בתאי גזע על גבי שכבות תרבית התאים של דפוס הננו לניתוח שלאחר מכן. בסופו של דבר, מיקרוסקופ שדה בהיר ואימונופלואורסצנטי משמשים להצגת שינויים במורפולוגיה של התא ובסידור החלבון החוזי בתוך הקרדיומיוציטים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדפסת מיקרו מגע, הוא שליתוגרפיה של כוח נימי מייצרת שכבות תרבית תאים בתבנית ננו שיכולות לגרום ליישור מבני של חד-שכבות של רקמת הלב מבלי להסתמך על התפשטות תאים או נדידה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי יחסי תפקוד המבנה של רקמות הלב, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מכניוביולוגיה של סרטן. כדי לחקור את ההשפעה של טופוגרפיית מטריצה על נדידת התאים Be, התחל הליך זה על ידי ניקוי משטח האב של הסיליקון עם 100% אתנול או קסילן וייבוש תחת גז חנקן חמצן.
לאחר מכן, הנח את הצד של תבנית מאסטר הסיליקון כלפי מעלה בצלחת פטרי עבור מאסטר סיליקון עם פיפטה בתבנית פני השטח של שני סנטימטרים על שני סנטימטרים אליה 40 מיקרוליטר PUA. לאחר מכן הנח יריעה של ארבעה סנטימטרים על ארבעה סנטימטרים של סרט פוליאסטר שקוף מעל מכבש ה-PUA המחולק כלפי מטה על יריעת ה-PET ופזר את ה-PUA מתחת לסדין על פני התבנית באמצעות רולר או משטח קצה שטוח כך שהתבנית כולה מכוסה על ידי פולימר ה-PUA המקדים. לאחר מכן הנח את הפולימר הראשי של הסיליקון וה-PET כ-10 סנטימטרים מתחת לאור UV של 20 וואט למשך 50 שניות.
לאחר הריפוי, הסר את סרט ה-PET לאט בעזרת מלקחיים. PUA צריך להתחבר לסרט ה-PET עם נגטיב של דפוס הננו Silicon Master. לאחר מכן רפא את דפוסי הננו P-U-A-P-E-T תחת UV לפחות 12 שעות לפני השימוש.
כדי לנקות את הסיליקון מאסטרס הנח סרט נוסף של PET על גבי המאסטר ללא תוספת של PUA. חשוף אותו לאור ה-UV למשך 50 שניות והסר את סרט ה-PET. לאחר מכן שטפו את מאסטר הסיליקון עם 100% אתנול או קסילן וייבשו תחת גז חנקן חמצן.
בהליך זה, טפל בשקופיות זכוכית עגולות בקוטר 18 מילימטר על ידי הנחתן בתא אוזון למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנח את השקופיות על בלוקים של PDMS כדי לאבטח אותם באופן זמני לטיפול קל. לאחר מכן, מרחו שכבה של פריימר זכוכית על פני מגלשת הזכוכית.
הניחו לפריימר להתייבש באוויר למשך 30 דקות. כעת הניחו את שקופיות הזכוכית על פיסת נייר מדפסת. זרוק 10 מיקרוליטר של פולימר פוליאוריטן מראש למרכז כל שקופית זכוכית וודא שלא נוצרות בועות.
לאחר מכן הנח את תבנית תבנית ה- PUA עם הפנים כלפי מטה על מגלשת הזכוכית, פזר את פולימר ה- PU באופן אחיד על פני מגלשת הזכוכית על ידי גלגול גליל גליל גומי לאורך תבנית ה- PUA. נייר המדפסת יספוג את הצפת הפולימר לאחר מכן ירפא אותם UV למשך 60 שניות תחת מנורת UV של 20 וואט. לאחר מכן, הסר את הדגימה ממקור אור ה-UV וקילף בזהירות את תבנית ה-PUA מפילמור שקופיות הזכוכית המצופה PU של ה-PU נחשב שלם.
כאשר תבנית ה-PUA מתקלפת בצורה נקייה מהדגימה ולמגלשת זכוכית ה-PU יש מראה ססגוני, הנח את הדגימות בחומר ייבוש לאחסון למשך חודש. כעת חבר תלושי כיסוי NFS לתרבית רקמות 35 מילימטר פיפטת כלים מפוליסטירן 20 מיקרוליטר NOA לתחתית הצלחת. הנח בעדינות את החלקת כיסוי ה- NPPU על גבי ה- NOA ואפשר לדבק להתפשט ולכסות את כל תחתית החלקת הכיסוי לאחר מכן לרפא את NOA על ידי חשיפת הכלי ל- UV למשך 10 דקות.
לאחר מכן, יש לעקר את ה-NP SUBSTRATA על ידי שטיפתו פעמיים עם שני מיליליטר של תמיסת אתנול מימית של 70% כל אחד למשך חמש דקות. הסר את האתנול על ידי שאיפה. אפשר ל-A NFS להתייבש לחלוטין באוויר למשך כשעה מתחת למנורת עיקור UV בארון הבטיחות הביולוגי.
כדי לשפר את ההידבקות התאית, יש לצפות את ה-A NFS בפיברונקטין למשך הלילה על ידי דילול הפיברונקטין במים לחמישה מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, פיפטה שני מיליליטר תמיסת פיברונקטין לכלי. לאחר מכן הניחו את ה-A NFS בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.
השג NR VMs, HESC CMS או תאי לב אחרים מעניינים, צנטריפוגה את דגימת התא ב-1000 סל"ד למשך שלוש דקות כדי לגלול את התאים. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה והקפד לא להפריע לגלולה. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במצע התרבות לריכוז של 4.6 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר.
פיפטה בזהירות 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים על ה-NFS המעוקר וודא שמתלה התא נשאר על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, מקמו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד ל-A NFS. לאחר מכן הוסיפו לתבשיל שני מיליליטר של אמצעי תרבית חמים נוספים והניחו את התאים בחממה שוב באותם תנאים.
לאחר 24 שעות, הסר את המדיה ושטוף עם שני מיליליטר DPBS פעמיים כדי להסיר תאים עודפים. לאחר מכן, הוסיפו למנה שני מיליליטר של אמצעי תרבות חמים. מניחים את התאים בחממה באותם תנאים ותרבות.
התאים למפגש מחליפים את המדיה כל יומיים. איור זה מציג את תמונות השדה הבהיר המייצגות של NR VMs לאחר שבעה ימים של תרבית ו-HESC cms. לאחר 48 שעות של תרבית, NR VMs ו-HESC CMS על משטחי NP מראים אניזוטרופיה ויישור מבניים ברורים, בעוד שקרדיומיוציטים על משטחי דפוס האו"ם מכוונים באופן אקראי.
ניתוח אימונוהיסטוכימי מדגיש את ההשפעה של הננו-טופוגרפיה על יישור השלד התא, מיקרו חוטי אקטין ואלפא סרקומרי אקטין בתאים שגודלו על A NFS מתיישרים לאורך רכסי הננו, אך נשארים מפוזרים באופן אקראי בתאים על תת-שכבות לא מעוצבות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקר את התשתית שלך לפני ישיבה בתא מכיוון שזיהום יכול להוות בעיה גדולה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביולוגיה קרדיווסקולרית לחקור את התבגרות הלב ואת הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר שכבות תרבית תאים ביומימטיות באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי ליישומי הנדסת רקמות לב.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מדגים את הייצור של מצעים לתרביות תאים לבביות ביומטיות באמצעות ליתוגרפיה בכוח נימי. השיטות המתוארות מספקות גישה סקלבילית וחסכונית להנדסת רקמות לבביות מקרוסקופיות ליישום שונים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- הנדסת רקמות לבביות
- טכניקות תרבית תאים
- חומרים פולימריים
רקע
- מצעים ביומטיים חיוניים לחקר תאי לב.
- ליתוגרפיה בכוח נימי מאפשרת תבנית מדויקת.
- הנדסת רקמות לבביות יכולה לשפר מחקרים in vitro וב-vivo.
- שימוש בחומרים פולימריים שונים יכול להתאים יישומים.
מטרת המחקר
- לייצר מצעים לתרבית תאים ביומטיים.
- להנדס את המבנה והתפקוד של רקמות לבביות.
- להקל על ניתוח התנהגות קרדיומיוציטים.
שיטות בשימוש
- ייצור תבנית אב סיליקון באמצעות תחריט יונים רקטיבי עמוק.
- העברת תבניות טופוגרפיות לתבנית PUA באמצעות ליתוגרפיה בכוח נימי בסיוע UV.
- ייצור מצעים לתרבית תאים מחומרים פולימריים שונים.
- תרביות קרדיומיוציטים לניתוח באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של תבניות טופוגרפיות למצעי תרבית תאים.
- תצפית בשינויים במורפולוגיה של התאים.
- ניתוח של סידור חלבונים חוזיים בקרדיומיוציטים.
- הוכחת יעילות המצעים הביומטיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה ליצירת מצעים ביומטיים.
- ליתוגרפיה בכוח נימי היא טכניקה מגוונת להנדסת רקמות.
- מחקרים נוספים יכולים לשפר את ההבנה של התנהגות תאי הלב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
