נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב
10 ביוני 2014
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי. השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר שכבות תרבית תאים ביומימטיות כדי להנדס את המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות. זה מושג על ידי ייצור תחילה של מאסטר סיליקון עם הארכיטקטורה הטופוגרפית הרצויה על ידי תחריט יונים תגובתי עמוק. השלב השני הוא העברת התבנית הטופוגרפית הרצויה ממאסטר הסיליקון לתבנית PUA באמצעות ליתוגרפיה נימית בסיוע UV.
לאחר מכן, תבנית ה-PUA משמשת כתבנית לייצור שכבות תרבית תאים מחומרים פולימריים שונים בהתאם ליישום הרצוי באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי בסיוע UV או בתיווך ממס. השלב האחרון הוא צלחת קרדיומיוציטים ראשוניים או שמקורם בתאי גזע על גבי שכבות תרבית התאים של דפוס הננו לניתוח שלאחר מכן. בסופו של דבר, מיקרוסקופ שדה בהיר ואימונופלואורסצנטי משמשים להצגת שינויים במורפולוגיה של התא ובסידור החלבון החוזי בתוך הקרדיומיוציטים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדפסת מיקרו מגע, הוא שליתוגרפיה של כוח נימי מייצרת שכבות תרבית תאים בתבנית ננו שיכולות לגרום ליישור מבני של חד-שכבות של רקמת הלב מבלי להסתמך על התפשטות תאים או נדידה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי יחסי תפקוד המבנה של רקמות הלב, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מכניוביולוגיה של סרטן. כדי לחקור את ההשפעה של טופוגרפיית מטריצה על נדידת התאים Be, התחל הליך זה על ידי ניקוי משטח האב של הסיליקון עם 100% אתנול או קסילן וייבוש תחת גז חנקן חמצן.
לאחר מכן, הנח את הצד של תבנית מאסטר הסיליקון כלפי מעלה בצלחת פטרי עבור מאסטר סיליקון עם פיפטה בתבנית פני השטח של שני סנטימטרים על שני סנטימטרים אליה 40 מיקרוליטר PUA. לאחר מכן הנח יריעה של ארבעה סנטימטרים על ארבעה סנטימטרים של סרט פוליאסטר שקוף מעל מכבש ה-PUA המחולק כלפי מטה על יריעת ה-PET ופזר את ה-PUA מתחת לסדין על פני התבנית באמצעות רולר או משטח קצה שטוח כך שהתבנית כולה מכוסה על ידי פולימר ה-PUA המקדים. לאחר מכן הנח את הפולימר הראשי של הסיליקון וה-PET כ-10 סנטימטרים מתחת לאור UV של 20 וואט למשך 50 שניות.
לאחר הריפוי, הסר את סרט ה-PET לאט בעזרת מלקחיים. PUA צריך להתחבר לסרט ה-PET עם נגטיב של דפוס הננו Silicon Master. לאחר מכן רפא את דפוסי הננו P-U-A-P-E-T תחת UV לפחות 12 שעות לפני השימוש.
כדי לנקות את הסיליקון מאסטרס הנח סרט נוסף של PET על גבי המאסטר ללא תוספת של PUA. חשוף אותו לאור ה-UV למשך 50 שניות והסר את סרט ה-PET. לאחר מכן שטפו את מאסטר הסיליקון עם 100% אתנול או קסילן וייבשו תחת גז חנקן חמצן.
בהליך זה, טפל בשקופיות זכוכית עגולות בקוטר 18 מילימטר על ידי הנחתן בתא אוזון למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנח את השקופיות על בלוקים של PDMS כדי לאבטח אותם באופן זמני לטיפול קל. לאחר מכן, מרחו שכבה של פריימר זכוכית על פני מגלשת הזכוכית.
הניחו לפריימר להתייבש באוויר למשך 30 דקות. כעת הניחו את שקופיות הזכוכית על פיסת נייר מדפסת. זרוק 10 מיקרוליטר של פולימר פוליאוריטן מראש למרכז כל שקופית זכוכית וודא שלא נוצרות בועות.
לאחר מכן הנח את תבנית תבנית ה- PUA עם הפנים כלפי מטה על מגלשת הזכוכית, פזר את פולימר ה- PU באופן אחיד על פני מגלשת הזכוכית על ידי גלגול גליל גליל גומי לאורך תבנית ה- PUA. נייר המדפסת יספוג את הצפת הפולימר לאחר מכן ירפא אותם UV למשך 60 שניות תחת מנורת UV של 20 וואט. לאחר מכן, הסר את הדגימה ממקור אור ה-UV וקילף בזהירות את תבנית ה-PUA מפילמור שקופיות הזכוכית המצופה PU של ה-PU נחשב שלם.
כאשר תבנית ה-PUA מתקלפת בצורה נקייה מהדגימה ולמגלשת זכוכית ה-PU יש מראה ססגוני, הנח את הדגימות בחומר ייבוש לאחסון למשך חודש. כעת חבר תלושי כיסוי NFS לתרבית רקמות 35 מילימטר פיפטת כלים מפוליסטירן 20 מיקרוליטר NOA לתחתית הצלחת. הנח בעדינות את החלקת כיסוי ה- NPPU על גבי ה- NOA ואפשר לדבק להתפשט ולכסות את כל תחתית החלקת הכיסוי לאחר מכן לרפא את NOA על ידי חשיפת הכלי ל- UV למשך 10 דקות.
לאחר מכן, יש לעקר את ה-NP SUBSTRATA על ידי שטיפתו פעמיים עם שני מיליליטר של תמיסת אתנול מימית של 70% כל אחד למשך חמש דקות. הסר את האתנול על ידי שאיפה. אפשר ל-A NFS להתייבש לחלוטין באוויר למשך כשעה מתחת למנורת עיקור UV בארון הבטיחות הביולוגי.
כדי לשפר את ההידבקות התאית, יש לצפות את ה-A NFS בפיברונקטין למשך הלילה על ידי דילול הפיברונקטין במים לחמישה מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, פיפטה שני מיליליטר תמיסת פיברונקטין לכלי. לאחר מכן הניחו את ה-A NFS בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.
השג NR VMs, HESC CMS או תאי לב אחרים מעניינים, צנטריפוגה את דגימת התא ב-1000 סל"ד למשך שלוש דקות כדי לגלול את התאים. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה והקפד לא להפריע לגלולה. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במצע התרבות לריכוז של 4.6 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר.
פיפטה בזהירות 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים על ה-NFS המעוקר וודא שמתלה התא נשאר על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, מקמו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד ל-A NFS. לאחר מכן הוסיפו לתבשיל שני מיליליטר של אמצעי תרבית חמים נוספים והניחו את התאים בחממה שוב באותם תנאים.
לאחר 24 שעות, הסר את המדיה ושטוף עם שני מיליליטר DPBS פעמיים כדי להסיר תאים עודפים. לאחר מכן, הוסיפו למנה שני מיליליטר של אמצעי תרבות חמים. מניחים את התאים בחממה באותם תנאים ותרבות.
התאים למפגש מחליפים את המדיה כל יומיים. איור זה מציג את תמונות השדה הבהיר המייצגות של NR VMs לאחר שבעה ימים של תרבית ו-HESC cms. לאחר 48 שעות של תרבית, NR VMs ו-HESC CMS על משטחי NP מראים אניזוטרופיה ויישור מבניים ברורים, בעוד שקרדיומיוציטים על משטחי דפוס האו"ם מכוונים באופן אקראי.
ניתוח אימונוהיסטוכימי מדגיש את ההשפעה של הננו-טופוגרפיה על יישור השלד התא, מיקרו חוטי אקטין ואלפא סרקומרי אקטין בתאים שגודלו על A NFS מתיישרים לאורך רכסי הננו, אך נשארים מפוזרים באופן אקראי בתאים על תת-שכבות לא מעוצבות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקר את התשתית שלך לפני ישיבה בתא מכיוון שזיהום יכול להוות בעיה גדולה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביולוגיה קרדיווסקולרית לחקור את התבגרות הלב ואת הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר שכבות תרבית תאים ביומימטיות באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי ליישומי הנדסת רקמות לב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את ייצורם של מצעים לתרבית תאי לב ביו-מימטיים באמצעות ליתוגרפיה של כוחות קפילריים. השיטות המתוארות מספקות גישה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת רקמות לב מאקרוסקופיות עבור יישומים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסת רקמות לב
- טכניקות תרבית תאים
- חומרים פולימריים
רקע
- מצעים ביומימטיים חיוניים לחקר תאי לב.
- ליתוגרפיית כוח קפילרי מאפשרת תבנית מדויקת.
- הנדסה של רקמות לב יכולה לשפר מחקרים in vitro ו-in vivo.
- שימוש בחומרים פולימריים שונים מאפשר התאמה של היישומים.
מטרת המחקר
- ליצירת תשתיות תרבית תאים ביו-מימטיות.
- להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב.
- להקל על ניתוח התנהגות של קרדיומיוציטים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור תבנית מאסטר מסיליקון באמצעות תיסס רדיקלי עמוק של יונים (deep reactive ion etching).
- העברת תבניות טופוגרפיות לתבנית PUA באמצעות ליתוגרפיית כוחות קפילריים בסיוע UV.
- ייצור מצעים לתרבית תאים מחומרים פולימריים שונים.
- זריעה של קרדיומיוציטים לצורך ניתוח באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של תבניות טופוגרפיות לתשתיות לתרבית תאים.
- תצפית על שינויים במורפולוגיה של התאים.
- ניתוח של סידור חלבוני התכווצות בתאי שריר לב (cardiomyocytes).
- הדגמה של יעילות התשתיות הביומימטיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה ליצירת תשתיות ביו-מימטיות.
- ליתוגרפיה של כוחות קפילריים היא טכניקה רב-גונית להנדסת רקמות.
- מחקרים נוספים יכולים להעמיק את ההבנה של התנהגות תאי לב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ליתוגרפיה בכוח קפילרי מאפשרת ייצור בר-הרחבה של תשתיות ביו-מימטיות המשחזרות רמזים ננו-מטריים של המטריצה החוץ-תאית, שהם קריטיים להבשלת רקמת לב. גישה זו תומכת במידול חזוי של קשרי מבנה-תפקוד בתאי שריר הלב (cardiomyocytes), ובכך מפחיתה את ההסתמכות על סריקה אמפירית בשלבי הגילוי המוקדמים. באמצעות אספקת פלטפורמות הניתנות לשחזור ומעודדות יישור, השיטה מגבירה את רמת הביטחון בתיקוף המטרה ואת ההמשכיות התרגומית בצינורות המו"פ של מחקרים קרדיו-וסקולריים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות ננו-טופוגרפיה על יישור תאי שריר הלב (cardiomyocytes) ועל ארגון חלבוני התכווצות.
- ערך תפעולי: מספק מצעים בעלות נמוכה וניתנים להרחבה להערכה בקיבולת גבוהה (high-throughput) של תגובות תאיות המתווכות על ידי המטריצה.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד משתנים טופוגרפיים במסלולי הבשלה של הלב.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדי מורפולוגיה ושלד תאי כמותיים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ואימונופלואורסצנציה.
- ערך תפעולי: מספק משטחים בעלי דפוסי ננו (nanopatterned) הניתנים לשחזור ותואמים לתאי שריר לב (cardiomyocytes) ראשוניים ומכאלו שהופקו מתאי גזע.
- מוכנות הבדיקה: מאפשר הערכה סטנדרטית של השפעות תרכובות על צימוד אלקטרו-מכני ברמת הרקמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין חיקוי של ה-ECM בקנה מידה ננומטרי לבין פנוטיפים תפקודיים של רקמה הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- תועלת פרה-קלינית: מאפשרת הערכה מותאמת סיכונים של מועמדים לטיפולים רגנרטיביים באמצעות שכבות מונו-לייר של קרדיומיוציטים מסודרים.
- תובנה מכניסטית: מבהירה קשרי מבנה-תפקוד ללא השפעות מבלבלות של שגשוג או נדידה של תאים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי הגילוי על ידי מתן אפשרות להערכה מונחית-השערות של השפעות טופוגרפיות של המטריצה לפני שלבי אופטימיזציית המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מודולציה פנוטיפית מושרית על ידי ננו-טופוגרפיה מבוקרת.
- סריקה: מספק תשתיות סטנדרטיות המשרות יישור (alignment) לצורך סריקה עקבית של תרכובות במערכי בדיקה לבביים.
- אנליטיקה: מספק מדדים כמותיים מבוססי דימות להערכת יישור של השלד התאי וארגון סרקומרי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עיצוב תשתית בקנה מידה ננומטרי לבין נקודות סיום של הבשלת רקמה הרלוונטיות לשלב הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לתיקוף מטרות קרדיו-וסקולריות במגוון מודליות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהנדסת רקמות לב על ידי הפרדה בין רמזים טופוגרפיים לאותות ביוכימיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות בין סדרות באמצעות תהליכי ליתוגרפיה של כוחות קפילריים מבוססי UV ובתווך של ממס.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת מודלים חוץ-גופיים (in vitro) חיזויים ורלוונטיים לבני אדם.
- השפעה על פורטפוליו הפיתוח: מאפשר קידום מרוتبת סיכונים של מועמדים לרגנרציה של הלב בהתבסס על מדדי רקמה פונקציונליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בננו-פבריקציה, כימיה של פולימרים וטכניקות של תרבית תאים.
- תלוי בציוד פיו curing ב-UV, כלי עיצוב מדויקים ותשתית סטרילית לתרבית רקמות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי סטריליזציה וציפוי בפיברונקטין בין הצוותים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לסוגי תאים שאינם תאי לב או למודלים של מחלות.
- מוגבל בשל הצורך בתבניות מאסטר ותבניות יציקה מיוחדות, אם כי ניתן להרחבה באמצעות שכפול.
