Name: Assaying ניזק לדנא בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו לכמת נזק לדנ"א בנוירונים מהיפוקמפוס באמצעות שיטת השביט. שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר ורגיש של שבירות שרשרת DNA בודדת וכפולה במחקר נוירודגנרטיבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג&#39;ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קציר לתוך צינורות 15 מ&quot;ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ&quot;ל, ולנטרל את טריפסין עם מדיה מתאימה המכילה סרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת ותאי resuspend ב PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemacytometer או נגד התא המועדף עליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תאים צריכות להיות מוכנות מייד לפני תחילת הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הדגימות צריכות להיות מטופל באור הכהה או צהוב כדי למנוע ניזק לדנ&quot;א מאור אולטרה סגול. </li></ol> 2. Assay שביט 1. הכנת מצגת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי 1% agarose (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, בורה חומצה, EDTA, שהחפתה) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות לagarose המותך ולנגב צד לנקות עם kimwipe. אפשר agarose לאוויר יבש לסרט שקוף. ניתן לעשות זאת מראש ושקופיות ניתן לאחסן. </li></ol> 2. Assay שביט הניטראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון צינת תמוגה (2.5 מ &#39;NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.2.2. ממס% ההיתוך agarose נקודה נמוך 1 (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. Agarose צריך להיות מקורר ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להימנע מזירוז מלאכותי של זנב שביט. באופן אידיאלי, agarose צריך להיות מקורר למשך חצי שעה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.2.3. לדלל את השעית התא כך שיש 100.000 תאים למ&quot;ל. מערבב את השעית התא עם נקודת ההיתוך agarose הנמוך (על 37 מעלות צלזיוס) בשעהיחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק שטוח במקרר למשך 30 דקות עד שהעיגול מופיע בפריפריה של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prechill פתרון תמוגה ושקופיות להטביע בפתרון זה למשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C (או במקרר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק מעל או לשאוב את פתרון תמוגה ולהוסיף חיץ אלקטרופורזה ניטראלית 1X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA, 1X TBE). השאר שקופיות במאגר זה במשך חצי שעה במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הצפת prechilled 1X ניטראלית אלקטרופורזה (TBE) בחדר אלקטרופורזה, שקופיות מקום בשקופית מגש אלקטרופורזה. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק אלקטרופורזה הניטראלית 1X חיץ עד 0.2 סנטימטרים מעל שקופיות. חיץ עודף ביןfere עם אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר) בחושך. </li></ol> 3. Assay השביט אלקליין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון צינת תמוגה (2.5 מ &#39;NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי 1% נמוך היתוך agarose נקודה (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. אז מגניב ב° אמבט מים 37 ג ללפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבו את התאים במיליליטר 1 x 105 / עם נקודת התכה הנמוכה agarose המותך (על 37 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום החליקes השטוח במקרר למשך 30 דקות עד למעגל מופיע בפריפריה של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לטבול בתמיסת תמוגה prechilled ועוזב ב4 מעלות צלזיוס למשך שעות 1 עד הלילה בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מפתרון תמוגה, לנקז את השקופיות ולשטוף פעם אחת עם חיץ נטרול קר למשך 5 דקות כדי להסיר חומרי ניקוי ומלחים שיורית לפני צעד אלקלי התרה-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מקום בתא אלקטרופורזה ג&#39;ל מלא במאגר prechilled טרי אלקטרופורזה (300 המ&quot;מ NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt; 13) לא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל שקופיות. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות לשבת במאגר הבסיסי למשך 30 דקות בחושך כדי לאפשר להתרה של ה-DNA והביטוי לניזק אלקלי אחראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר). </li></ol> 4. תיקון וStaתאי ining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מאגר אלקטרופורזה עודפת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול במים מזוקקים מחליק מראש מקוררים למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לטבול באתנול 70% מראש מקורר למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות יבשות בן הלילה. אל תחשוף את שקופיות לאור בהיר. דוגמאות יכולות להיות מאוחסנות במשך חודשים בטמפרטורת חדר לפני הבקיע בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות על ידי הטבילה בSybr ירוק (1X המדולל ב PBS) למשך 20 דקות במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות ולאפשר להם להתייבש לגמרי בחושך. Agarose יהפוך שקוף כשיבש לחלוטין. </li></ol> 4. יבוא תמונות וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר הירוק המסנן (Zeiss AxioVision) ולנתח באמצעות תוכנת Assay שביט (מכשירי Perceptive). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;ראש השביט&quot; (גרעין) והתוכנה מחשבת את הפרמטרים כוללים רגע ממוצע הזנב וכמות ה-DNA בגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח לפחות 200 תאים לכל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא נתונים ל-Microsoft Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מתכוון לרגע זנב לכל קבוצת טיפול ונתוני עלילה על פי צורך. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה לניתוח assay שביט על תאים עצביים מוצגת באיור 2 ואיור 3. במקרה זה, הקרנה של התאים העצביים גורמת ניזק לדנ&quot;א. כאשר התאים נחשפים לשדה החשמלי, ה-DNA נודד בשיעורים שונים בשל הבדלים בגודל שנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת Assay שביט. יותר הניזק לדנ&quot;א, רחוק יותר את ה-DNA נודד אל מחוץ לגרעין. זה מקטין את עוצמת הניאון בגרעין שהרימה לאחר מכן על ידי התוכנה ותוצאות ברגע זנב גבוה. טבלה 1 מציגה טבלת נציג מהניתוח והאיור 4 assay שביט תערוכות יציגותגרף באשר היא מסוגלת להשוות ניזק לדנ&quot;א בתאים עצביים בעקבות קרינה, כפי שנמדד על ידי assay השביט. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. תרשים זרימה של assay השביט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. תמונות מייצגות של תאים עצביים () ללא ו( ב &#39;) עם זנב שביט. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ניתוח assay שביט באמצעות תוכנת Assay שביט. () תמונות מסך יציג של תמונה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Carl Zeiss ונותחה באמצעות שביטתוכנת assay. (ב) לחיצה על הגרעין או &quot;ראש השביט&quot; (מוקף בעיגול ירוק) יוצרת מפת ניאון וגרף (מוקף בעיגול צהוב) וטבלה (ג&#39;) נתונים (מוקף בעיגול אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. גרף נציג מתקבל על ידי זומם רגע הזנב הממוצע שהושג על ידי ניתוח הניזק לדנ&quot;א בתאים עצביים מוקרנים ובלתי מוקרנים באמצעות assay שביט ניטראלי. כצפוי, קרינת 3Gy (רנטגן) גורמת ניזק לדנ&quot;א כמתואר על ידי רגע זנב הממוצע הגבוה יותר בתאים העצביים המוקרנים. שמוצג הוא רגע ממוצע הזנב (+ / - שגיאה סטנדרטית), ** P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="טבלה 1"/> טבלת 1. </חזק&gt; שולחן נציג מתקבל על ידי ניתוח assay שביט על תאים עצביים מוקרנים ולא מוקרנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה בניזק לדנ&quot;א בתוך אוכלוסייה. השעית קיימא תא בודד היא קריטית עבור assay זה מאז נוכחות דומיננטית של תאים נמקית או אפופטוטיים תוסיף לשגיאה. צעדי תמוגה ואלקטרופורזה מסלק תאים אפופטוטיים, שברים קטנים של DNA (קטן מ 50k...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל </td><td> סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 מיליליטר צינור </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> סיגמא </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> רדיד אלומיניום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> כוס </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת Assay שביט </td><td> מערכת השביט Assay IV תמונת ניתוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> קאמרי אלקטרופורזה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> Zeiss Vision Axio </td><td></td><td> כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ירוק יספיק </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> נקודת התכה הנמוך agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוגל </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגר סידן, מגנזיום המלוח, חופשי חופשי </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> אספקת חשמל </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> מקרר </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שליט </td><td> סטייפלס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> להחליק </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Lauryl sarcosinate </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> Sybr ירוק </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> מגש </td><td> FISהמדעי </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> מערבולת </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> אמבט מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש assay השביט

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ&quot;א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ&quot;א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג&#39;ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ&quot;א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ&quot;א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה. העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ&quot;א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ&quot;א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה ​​וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ&quot;א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ&quot;איוצר מקטעי דנ&quot;א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ&quot;א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ&quot;א. זנב דנ&quot;א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ&quot;א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ&quot;א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ&quot;א.

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ&quot;א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד ולכמת את כמות הנזק ל-DNA בתאי עצב באמצעות בדיקת COMET. זה מושג תחילה על ידי חשיפת הנוירונים לתנאים שונים הפוגעים ב-DNA, איסוף הנוירונים וערבובם עם aros נקודת התכה נמוכה. השלב השני הוא לשתק את הנוירונים בשקופיות.לאחר מכן, הנוירונים עוברים ליזה ולאחר מכן עוברים אלקטרופורזה בשלב האחרון. ה-DNA מוכתם בירוק סייבר. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנת בדיקת COMET משמשות כדי להמחיש ולכמת את רמות הנזק ל-DNA בתאי עצב בודדים.שלום, שמי אדי יאנג ואני עוזר פרופסור במחלקה לאונקולוגיה קרינתית באוניברסיטת אלבמה בברמינגהם. היום נדגים את בדיקת COMET, שהיא שיטה פשוטה לאיתור נזק ל-DNA בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות כגון צביעת מוקדי Gamma H two A X, כמו גם אלקטרופורזה של ג'ל שדה הדופק, הוא שטכניקה זו היא שיטה ישירה ורגישה למדידת נזק ל- DNA.בנוסף, עם שינויים קלים בטכניקה זו, ניתן לקבוע את סוג הנזק ל-DNA מכיוון שטיפולים רבים בסרטן פועלים על ידי גרימת נזק ל-DNA בגידולים ולעתים קרובות פועלים על ידי שינוי יכולת תיקון ה-DNA. ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו ליעילות הטיפול בסרטן. מי שתדגים את ההליך היום היא גב' סמארה נושין, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי, בגין על ידי קצירת תאי עצב שטופלו בנסיבות הניסוי הרצויות לתוך צינורות של 15 מיליליטר.סובב את הצינורות במשך חמש דקות ב-1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לאחר שאיבת ה-supernatant resus. השעו את הגלולה ב- PBS ואז סובבו את התאים שוב לאחר הכביסה השנייה. Resus משהה את התאים ב-PBS נוסף, סופר אותם ושומר אותם בחושך עד לשימוש במבחן השביט.כדי למנוע נזק ל-DNA לפני תחילת הבדיקה הבאה יש להמיס 1% במיקרוגל למשך שלוש דקות עד שכל הגרגירים נעלמים. לאחר מכן טובלים את השקופיות באגרוס המותך ומנגבים צד אחד עם מגבון קים. אפשר לאגרוס להתייבש באוויר לסרט שקוף בזמן שהאגרוס מייבש תמיסת ליזיס מצננת בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות ולהמיס יותר.אגרוס נקודת התכה נמוכה של 1%. קריר. מנה זו של אגרוס ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך חצי שעה. כדי להימנע מאינדוקציה מלאכותית של זנב שביט, כעת יש לדלל את תרחיף התאים העצביים שנקטף כך שיהיו 100,000 תאים למיליליטר.שלב את תרחיף התא עם אגרוס נקודת ההיתוך הנמוכה של 37 מעלות צלזיוס במערבולת ביחס של 1 עד 10 לזמן קצר והשתמש מיד בצד של קצה פיפטה כדי לפזר 50 מיקרוליטר של מתלה התא באופן שווה על שטח הדגימה של השביט המיובש באוויר Slide. מניחים את השקופיות המטופלות שטוחות במקרר למשך 30 דקות עד להופעת עיגול בשולי המגלשה. לאחר מכן טבלו את המגלשות בתמיסת הליזיס המצוננת מראש בחושך בארבע מעלות צלזיוס.לאחר 30 דקות, שאפו את תמיסת הליזיס. לאחר מכן דגרו את השקופיות במאגר אלקטרופורזה ניטרלי אחד למשך חצי שעה במקרר. לאחר מכן, הוסף מאגר אלקטרופורזה ניטרלי אחד מקורר מראש לתא אלקטרופורזה, ולאחר מכן הנח את השקופיות במגש ההחלקה של האלקטרופורזה, יישר את השקופיות כך שיהיו רחוקות באותה מידה מהאלקטרודות.לאחר מילוי התא מספיק כדי לכסות את המגלשות ב-0.2 אינץ' של מאגר אלקטרופורזה ניטרלי אחד, הגדר את מתח אספקת החשמל לוולט אחד לסנטימטר והפעל את הבדיקה בחושך למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. התחל בטבילת מגלשות אגרוס ותאי עצב חדשים בתמיסת ליזה טרייה מקוררת מראש, ולאחר מכן דגר אותם בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד לילה. לאחר מכן, הסר את השקופיות מתמיסת הליזיס, נקז אותן ולאחר מכן שטוף אותן פעם אחת עם מאגר נטרול קר למשך חמש דקות כדי להסיר שאריות לפני שלב הפיתול האלקליין.לאחר מכן הניחו את השקופיות בתא אלקטרופורזה ג'ל מלא במאגר אלקטרופורזה מקורר מראש וטרי שלא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל המגלשות. דגרו את המגלשות במאגר האלקליין למשך 30 דקות בחושך כדי לאפשר את פירוק ה-DNA וביטוי הנזק האחראי לאלקלי. לאחר מכן הפעל את הבדיקה בוולט לסנטימטר אחד למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הפעלת בדיקת השביט, רוקנו את מאגר האלקטרופורזה העודף ולאחר מכן טבלו את המגלשות במים מזוקקים מקוררים מראש בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, טבלו את השקופיות באתנול מקורר מראש, 70% גם בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות נוספות, הגדר את הדגימות לייבוש למשך הלילה, והרחיק אותן מאור בהיר.לאחר מכן מכתימים את השקופיות בירוק סייבר במקרר למשך 30 דקות. כעת הסר את השקופיות ואפשר להן להתייבש לחלוטין בחושך. הארוס יהפוך לשקוף כשהוא יבש לחלוטין.כדי לקבל תמונות מהבדיקה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר למסנן הירוק. לאחר מכן פתח את תוכנית בדיקת COMET כדי לנתח את התמונות שנרכשו. על ידי לחיצה על כפתור ראש השביט, התוכנה תחשב את הפרמטרים כולל מומנט הזנב הממוצע וכמות ה-DNA בגרעין.לאחר ניתוח לפחות 200 תאים לכל טיפול, ייצא את הנתונים ל- Microsoft Excel לצורך חישוב מומנט הזנב הממוצע והתוויית הנתונים. איור ראשון זה מציג דוגמה לניתוח בדיקת COMET של תאים עצביים עם ובלי זנב שביט. בבדיקת השביט השנייה שנותחה באמצעות תוכנת בדיקת COMET, הקרנה של תאי העצב נקבעה כגורמת נזק ל-DNA מכיוון שהתאים היו נתונים לשדה החשמלי.ה-DNA נדד בקצבים שונים עקב הבדלים בגודל כפי שנותח לאחר מכן עם תוכנת הבדיקה הנפוצה. צילום מסך ראשון זה מציג תמונות מייצגות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות תוכנית בדיקת COMET. לחיצה על הגרעין או על ראש השביט של תמונה אחת יצרה גרף מפה פלואורסצנטי וטבלת נתונים.ככל שהנזק לדנ"א גדול יותר, כך הדנ"א נדד רחוק יותר מהגרעין. זה הביא לירידה בעוצמת הקרינה בגרעין כפי שמצוין על ידי הצבע הירוק, ולאחר מכן מזוהה על ידי התוכנה המייצרת מומנט זנב גבוה יותר. באיור סופי זה, מוצג גרף מייצג של מומנט הזנב הממוצע המתקבל על ידי ניתוח נזק ה-DNA בתאי עצב מוקרנים ולא מוקרנים באמצעות בדיקת COMET ניטרלית מוצג כצפוי שלושה נזק DNA הנגרמת על ידי קרינה אפורה כפי שמצוין על ידי מומנט הזנב הממוצע הגבוה יותר בתאי העצב המוקרנים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאים בזהירות ולמנוע חשיפה לאור ישיר ולשלוט בטמפרטורה ב-pH. זאת כדי שהתאים לא יהיו נתונים ללחץ נוסף, שעלול לשנות את התוצאות שלך בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח DNA, תיקון מוקדים באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי אילו מסלולי תיקון DNA משתנים.לדוגמה, צביעה אימונו-פלואורסצנטית עבור מוקדי RAD 51 או פוספו, ניתן לבצע מוקדי DNA PK כדי למדוד תיקון רקומבינציה הומולוגית או לא הומולוגית, ותיקון הצטרפות בהתאמה.

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ"א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצונים.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

בדיקת השביט האלקליין מודדת שבירות גדילי DNA בתאים אוקריוטיים. על ידי הוספת שלב עיכול של אנדונוקלאז III או 8-אוקסוגואנין-DNA-N-גליקוזילאז אנושי, הבדיקה יכולה לזהות ביעילות נזק חמצוני ל-DNA. אנו מתארים שיטות לשימוש במבחנים האלה כדי לזהות נזק לדנ"א בכבד של חולדות.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

למדו לכמת נזק לדנ"א בנוירונים מהיפוקמפוס באמצעות שיטת השביט. שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר ורגיש של שבירות שרשרת DNA בודדת וכפולה במחקר נוירודגנרטיבי.

Assaying ניזק לדנ"א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

גלה סרטונים נוספים