Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

מערכת ניסויית זו מציעה מתודולוגיית תפוקה גבוהה לניטור ציטוטוקסיות בתיווך תאי T ברמת התא הבודד. ראשית, סמנו את תאי ה-T האפקטורים ותאי המטרה של הגידול בצבעים פלואורסצנטיים מתים. טען את שני סוגי התאים על מערכי בארות הננו וטבל את כל השבב במדיום המכיל נקסין ירוק ציט ומסומן פלואורסצנטי. חמש.

על מנת לזהות תאים נמקיים ואפופטוטיים כאחד, רשום כעת תמונה מוקדמת ראשונית כדי לקבוע את תפוסת הבאר ואת כדאיות התא בתחילת הבדיקה. לאחר שש שעות דגירה הקליטו תמונה שנייה. לאחר מכן השתמש בניתוח תמונה אוטומטי כדי לכמת את הליזה הספציפית לאנטיגן של EL 4 CD 19 חיובי על ידי תאי T חיוביים לרכב.

תוצאות המתקבלות משיטת תפוקה גבוהה זו יכולות לסנן ליזה ספציפית לאנטיגן של מטרות על ידי תאי אפקטור על סמך צביעה חיובית עם ציטוקסין. חמש. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת שחרור כרום 51 הוא שניתן להשיג אינטראקציות מטרה יעילות אמיתיות אחד לאחד ולמדוד את תדר הלוויין ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על איזה טיפול בסרטן מכיוון שהיא מאפשרת לחקור מתאמים של יעילות בטיפול בתאים אוטולוגיים כדי לייצר בארות ננו באמצעות מאסטר הסיליקון יש לערבב תחילה היטב את בסיס ערכת האלסטומר של הסיגר 180 4 וחומר הריפוי ב יחס משקל של 10 לאחד בכוס חד פעמית באמצעות סכין פלסטיק. מסירים את התערובת בתא ואקום למשך שעה.

לאחר מכן יוצקים את התערובת על מאסטר הסיליקון ונותנים לה לשבת במשך 30 דקות. כעת כדי לרפא את האלסטומר, מחממים את המכלול בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לאחר קירור בטמפרטורת החדר למשך שעה. הסר בזהירות את מערך בארות הננו PDMS ממאסטר הסיליקון.

מכסים אותו בסקוטש עד לשימוש יום לפני הניסוי עוברים 5 מיליון תאי מטרה בחמישה מיליליטר. יום הניסוי. גלולה 5 מיליון תאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-340 גרם למשך חמש דקות.

שאפו עודפי מדיה והשאירו אחריהם כ-50 מיקרוליטר מדיה כדי לתייג את התאים. הוסף 150 מיקרוליטר מתמיסת העבודה האדומה של גשש התאים הטרי וערבב היטב באמצעות דגירה של פיפטה P 200 למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. בעזרת ציטומטר המו מונים את תאי האפקטור שנקטפו מהתרבית.

לאחר מכן גלולה 5 מיליון תאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה. שאפו את המדיה העודפת. לאחר מכן הוסף תמיסת עבודה טרייה של חמישה כתם סגול מיקרו-מולרי תוסס במחזור D ותליית החייאה באמצעות פיפטה P 200.

דגרו על התאים ומתים במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ב-6.8 מיליליטר ו-6.0 מיליליטר של R-P-M-I-P-L-G-H כדי למקד ולתאי אפקטור בהתאמה ולערבב על ידי פיפטינג. לאחר מכן שכבה איטית של 3.5 מיליליטר של חבילת פיאל פלוס לתחתית כל צינור, צנטריפוגה את שני הצינורות ב-340 GS למשך 30 דקות ללא הפסקה ותאוצה במהלך הצנטריפוגה, הכן את מערך בארות הננו תחילה העבירו שבעה מיליליטר של PBS לפני המלחמה לצלחת ארבע בארות. נקה את החלק התחתון של שקופית הזכוכית באתנול באמצעות מחמצן פלזמה.

טפל ב-PDMS בהגדרת RF גבוהה למשך 30 עד 45 שניות. לאחר מכן הנח את המערך ב-PBS. העבירו את הצלחת לארון בטיחות ביולוגית ושאבו עודפי PBS מרחו אגר אצילי חם של 1% בקצוות העליונים והתחתונים של מגלשת הזכוכית כדי לשתק את המערך.

ודא שאתה לא נותן ל-PDMS להתייבש לאחר 10 דקות בשלושה מיליליטר PBS ולשאוף את עודפי האגר. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של R 10 לחלק העליון של מערך בארות הננו ושיווי משקל למשך כ-10 דקות. לאחר צנטריפוגה פיאלית שואבים חמישה מיליליטר מדיה מהשכבה העליונה של כל צינור.

נזהר לא לשאוף את השכבה המכילה את התאים עם פיפטה P 1000. קצרו את שכבת התאים הלבנה בין הפיאל למדיה. העבירו את התאים לצינורות חרוטיים סטריליים חדשים.

כעת שטפו את תאי האפקטור והמטרה שנקטפו פעמיים עם שלושה מיליליטר של R-P-M-I-P-L-G-H לפני המלחמה. לאחר הצנטריפוגה הסופית שאפו את המדיה העודפת והשעו מחדש את כדור התא. ב-500 מיקרוליטר של R 10, ספרו את התאים ברי קיימא בשיטת ההדרה הכחולה הטריאן על ציטומטר המו שואבים את המדיה העודפת ממערך הננו.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר שואב R 10 טרי. שוב, ודא שהחלק העליון של מערך הננו לא רטוב מדי ולא יבש מדי מכיוון שהוא ישפיע על התפלגות התאים. כעת, הפקידו 1 פעמים 10 עד חמישית מתאי פקטור ב-200 מיקרוליטר של R 10 על פני השטח של מערך הננו, מה שאפשר לתאים להתיישב למשך חמש דקות.

לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות סטנדרטי, ודא את ההתפלגות הרצויה של התאים. לאחר מכן הפקידו אחת כפול 10 לתאי המטרה החמישיים ב-200 מיקרוליטר של R 10 על פני מערך בארות הננו המכיל את תאי האפקטור. לאחר חמש דקות, הערך את התפלגות התאים במיקרוסקופיה.

לאחר מכן שטפו את מערך בארות הננו בזהירות עם שני מיליליטר של R 10 ושאבו עודפי מדיה בצינור חרוטי סטרילי נפרד של 15 מיליליטר. פיפטה שלושה מיליליטר R 10 חם מראש בשלושה מיקרוליטרים של ציט 0.5 מילי-מולרי, כתם חומצת גרעין ירוקה, ו-60 מיקרוליטר של X בחמישה LOR 6 47 מעורבב היטב על ידי פיפטינג. כעת פיפטה בעדינות את תמיסת הכתם על צלחת ארבע הבארות, וודא שהתאים לא נעקרים מהבארות לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני רוכשים תמונות של מערך בארות הננו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו מיקרוסקופ zes observer Z אחד, מצויד בבמה ממונעת ו-Lambda DG 4.

אתחל את התוכנה ואת המיקרוסקופ. בדוק את עוצמת האות באור המועבר ובערוצי הפלורסנט האחרים. התאם את הגדרת המיקרוסקופ כדי להבטיח אות מקסימלי לרעש תוך הימנעות מרוויה.

כעת פתח את רשימת המיקומים x ו-Y עבור מערך הנל. הגדר את מיקום האפס XY ואפס את המוקד במרכז בלוק מערך נל שבע על שבע בפינה השמאלית העליונה של חותמת מערך הנל. הגדר את מיקומי ה-XY כך שיתאימו למרכז כל בלוק ואת ערך Z כדי לשקף במדויק את המיקוד בכל בלוק.

כעת הגדר את רכישת התמונות במצב ליניארי ורכוש תמונות. לאחר סדרת ההדמיה הראשונה, החזר את מערכי בארות הננו לחממת תרבית התאים למשך שש שעות. טיפול בתסיסה עלול להוביל לעקירת תאים.

לאחר מכן חזור על רכישת התמונות בנקודת הזמן השנייה. בדיקה ציטוליטית זו בתפוקה גבוהה מודדת את תדירות הליזיס הספציפי לאנטיגן המסומן CD 19 תאי T חיוביים ספציפיים ל-CAR הודגרו יחד עם עכבר מסומן EL ארבעה תאי מטרה בבארות הבודדות של מערך ננו L. תרשימי ההיסטוגרמה של תא המטרה מייצגים בארות המכילות תא אפקטור יחיד ותא מטרה יחיד.

לאחר שש שעות של דגירה משותפת, היסטוגרמות תואמות של תאי מטרה ללא אפקטורים שימשו כבקרות שליליות לדיווח על תדירות מוות תאי הרקע. רצוי להשיג תדרים נמוכים של ליזה לא ספציפית בטווח של שניים עד 4% ניתן להתאים את מערך בארות הננו להדמיית זמן-lapse כדי לאפשר תצפית על אפקטור, צימוד מטרה ומוות תאים לאחר מכן. כאן תאי T חיוביים לרכב ללא תווית הודגרו יחד עם NA LM שישה תאי מטרה GFP ב-NOL והיו נתונים לניטור דינמי.

כאשר שין חמש נוסף למצע התרבית, התאים האפופטוטיים סומנו באדום ברגע ששולטים בהם. ניתן לבצע טכניקה זו כראוי תוך 10 עד 12 שעות בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו תפיסת מיקרו כדי לקבוע את פרופיל הפרשת הציטוקינים של התאים.