Name: הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: חקור הדמיית תאים חיים בזמן אמת של דינמיקת חלבונים בהפעלת תאי T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מספקת תובנות כמותיות על תהליכי איתות בתאי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים סופיה פריד לקבלת סיוע טכני. MBS הסוכנויות מודה הבאות על תמיכת המחקר שלהם: הקרן הלאומית למדע למענקי no.1659/08, 971/08, 1503-1508 ו491 / 10, משרדי בריאות ומדע למענקים אין. 3-4114 ו3-6540, סרטן אגודת ישראל באמצעות עזבון אלכסנדר Smidoda מאוחר, וקרן משפחת Taubenblatt למענק ההצטיינות ביו הרפואה.

<ol><li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+and+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li>
<li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+tumour+antigens%3A+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li>
<li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li>
<li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosines+113%2C+128%2C+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li>
<li>Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li>
<li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li>
<li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).</li>
</ol>

אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.

הרגולציה והפונקציה של תהליכים תאיים רבים תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים. הדמיה מיקרוסקופית מאפשרת מעקב בזמן אמת של חלבונים מתויגים fluorescently בתאים חיים. Colocalization של חלבונים מתויגים יכול להציע אינטראקציה ישירה או עקיפה בין החלבונים, וניתן להשתמש בו כדי לחזק את הממצאים שהושגו על ידי שיטות ביוכימיות, כגון immunoprecipitation. שלא כמו שיטות ביוכימיות, הדמיה לחיות תאים מאפשרת אינטראקציות בין החלבונים אלה כדי להיות שנצפו במרחב ובזמן, שתאפשרנה את הניטור של תהליכ...

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>מגיב / חומר< / חזק</td></tr> <tr><td>>Amaxa ערכת נוקלאופקטור תאי T אנושיים</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (שיבוט UCHT1) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS צינורות</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>מערכת זכוכית כיסוי גרמנית 4 שקופיות </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין </td><td>סיגמא</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין 0.1% (w/v) ב-H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק> </td></tr><tr><td>אמבט יבש דיגיטלי Accublock</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>צנטריפוגה אפנדורף</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת הרכבה ניתנת לחימום - הכנס חימום P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (נדרש למסגרת ההרכבה הניתנת לחימום)</td> <td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורציה</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמית חיה בזמן אמת של t-תא איתות גיבוש קומפלקס

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הגנה מפני מחלות זיהומיות מתווכת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. לימפוציטים מסוג T הם רכזי האב של מערכת החיסון, המסדיר את ההפעלה ותגובות של תאים חיסוניים 3,4 מרובים. הפעלת תא T תלויה בהכרה של אנטיגנים ספציפיים המוצגים על ידי תאי מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים). קולט אנטיגן T-cell (TCR) ספציפי לכל שיבוט תאי T וקובע סגוליות אנטיגן 5. הכריכה של TCR לאנטיגן גורמת לזירחון של מרכיבי קומפלקס TCR. על מנת לקדם את הפעלת תא T, אות זה חייב להיות transduced מן הקרום אל הציטופלסמה והגרעין, ייזום תגובות שונות חיוניות כגון גיוס של חלבוני איתות לTCR; אתר APC (סינפסה החיסונית), ההפעלה המולקולרית שלהם, סידור מחדש cytoskeletal, גובה של ריכוז סידן תוך תאי, ושינויים בביטוי גני 6,7. הנכוןitiation וסיום של אותות המפעילים הוא קריטי לתגובות תא T המתאימות. הפעילות של חלבוני איתות תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים, לפרסם שינויי translational כגון זרחון חלבון, היווצרות של קומפלקסי חלבונים, ubiquitylation החלבון וגיוס של חלבונים לאתרים שונים 8 סלולריים. הבנת הפעולה הפנימית של תהליך הפעלת תא T היא קריטית עבור מחקר חיסוני ויישומים קליניים. מבחני שונים פותחו כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים, עם זאת, מבחני ביוכימיים, כגון שיטת שיתוף immunoprecipitation בשימוש נרחב, אינם מאפשרים מיקום חלבון להיה להבחין, ובכך נמנע אפשרות התצפית של תובנות רבות ערך לדינמיקה של הסלולר מנגנונים. בנוסף, מבחני אלה בדרך כלל בתפזורת לשלב חלבונים מהתאים רבים ושונים שעשויות להיות בשלבים שונים של t שוניםהוא חקר את התהליך סלולרי. זה יכול להיות השפעה מזיקה על החלטה זמנית. השימוש בהדמיה בזמן אמת של תאי חיים מאפשר גם מעקב המרחבי של חלבונים ואת היכולת להבחין בין temporally אירועי איתות, ובכך שופך אור על הדינמיקה של תהליך 9,10. אנו מציגים שיטה של ​​הדמיה בזמן אמת של היווצרות איתות-מורכבת במהלך הפעלת תא T. T-cell קווים, כגון Jurkat T-תאים ראשוניים או, הם transfected עם פלסמידים קידוד לחלבונים של עניין התמזגו לחלבוני ניאון monomeric, מניעת oligomerization הלא פיסיולוגי 11. חיים תאי T הם ירדו מעל coverslip מראש מצופה עם נוגדן תא T הפעלת 8,9, אשר נקשר למתחם CD3/TCR, גרימת הפעלת תאי T תוך התגברות על הצורך בהפעלת אנטיגנים ספציפיים. תאים הופעל הם צילמו כל הזמן עם השימוש במיקרוסקופיה confocal. נתוני הדמיה מנותחים להניב תוצאות כמותיות, כגון colמקדם ocalization של חלבוני האיתות.

אנו מציגים דוגמה של הדמיה T-תא חי וניתוח. לפני ניסוי ההדמיה, SLP76 תאי T לקויים (J14) נותחו עם השימוש בFACS על מנת לקבוע את הביטוי של חלבוני הניאון (איור 1). תאי T transfected עם איתות חלבונים המתויגים mCFP-NCK וSLP76-mYFP הופקדו על שקופיות הפעלה וצלמו במהלך T-תא הפצה (איור 2). תמונות שנאספו מראות את הדינמיקה של לוקליזציה חלבון לאורך כל הפעלה ומתפשט (איור 3). עיבוד תמונה ממוחשב מספק תובנות חדשות ומידע הכמותי מהתאים דמיינו, תוך מזע...

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר היווצרות סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ראשוניים לבין דו-שכבות שומנים נתמכות (SLB). חלבוני פני השטח של תאי T מתקשרים עם ליגנדות בהתאמה המשותקות על SLB כדי ליצור סינפסה חיסונית, ואחריה תנועה של גרגירים ליטיים לכיוון הסינפסה, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לחקר אינטראקציה של תאי T עם דו-שכבות שומנים מישוריות נתמכות

סרטון זה מדגים הדמיה של תאים חיים של טופולוגיית סינפסות אימונולוגיות, וחוקר את יחסי הגומלין בין לימפוציטים מסוג T לבין תאי אפיתל הנושאים אנטיגנים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תזוזה של ציטופלסמה אדומה וטבעות קרום צהובות בתאי אנדותל, דבר המצביע על היווצרות סינפסות אימונולוגיות.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף לפתרון אותות Ca2+ מקומיים ראשוניים, המכונים מיקרו-דומיינים Ca2+ , בתאי מורין ראשוניים ובתאי T אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה משמש כמשאב רב ערך לחוקרים הבוחנים מסלולי איתות Ca2+ בתוך תאי מערכת החיסון ולפענח עוד יותר את תפקודם.

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים

חקור הדמיית תאים חיים בזמן אמת של דינמיקת חלבונים בהפעלת תאי T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מספקת תובנות כמותיות על תהליכי איתות בתאי חיסון.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

גלה סרטונים נוספים