דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים טכניקות לעטיפת תאים בהידרוג'לים פולימריים פוטו, כמו גם התאוששות לאחר מכן של pH של תאי בטא שנוצרו באופן טבעי מההידרוג'לים הרגישים לאנזים מאפיון ביולוגי. זה מושג על ידי ערבוב ראשון של שישה תאי בטא עם יתד זרוע, נורברטין מייסר וקרוסלינקר פפטיד רגיש לאנזים. לאחר מכן התאים עטופים באמצעות רדיקלים חופשיים ואז פילמור פוטו ליצירת הידרוג'ל.

השלב השני הוא תרבית תאים עטופים בהידרוג'לים באינקובטור פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים התרבו ליצירת אגרגטים, ההידרוג'לים עמוסי התאים נשטפים בתמיסת חיץ ולאחר מכן מודגרים בתמיסת צ'יה טריפסין. תחת ניעור עדין לשחיקת ג'ל, ואז האגרגטים המוחזרים נשטפים בזהירות כדי להסיר תמיסת אנזים ופולימר נשחק.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש באגרגטים תאיים אלה לניתוח מבני ופונקציונלי. אז היתרון העיקרי של צמיחת צעד ואז פוטוכימיה הוא שתנאי התגובה שלה מתונים יותר מגידול השרשרת המסורתי PEG dde. לכן, ההידרוג'לים מספקים מיקרו-סביבה מצוינת לסוגי תאים רבים, כולל תאי בטא בלבלב.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפולים שונים מבוססי תאים מכיוון שמערכת DIN זו מספקת מיקרו-סביבה מצוינת לניסויים במבחנה ופלטפורמה מצוינת להעברת תאים. בעוד שאנו מסנתזים את הפפטידים ששימשו בניסויים אלה במעבדה שלנו, ישנן חברות רבות שמהן ניתן להשיג את הפפטידים הצולבים שתיארנו. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת 20% PEG four NB במערבולת PBS את התערובת עד שהחומר נמס לחלוטין.

לאחר מכן העבירו את תמיסת קרמר דרך מסנן מזרק כדי לעקר אותה ולאחסן את Eloqua במינוס 20 מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 2% של יוזם הצילום ליתיום ארול פוספונאט ב- PBS. העבירו את תמיסת יוזם הצילום דרך מסנן מזרק ואחסנו את התמיסה המעוקרת בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.

שלב הכנה נוסף הוא להמיס את הפפטיד הרגיש לחרצין ב- PBS ולסנן מזרק את התמיסה לעיקור. תוספות מאוחסנות במינוס 20 מעלות צלזיוס. קבע את ריכוז קבוצת ההידרו סולף בתמיסת הפפטיד המוכנה באמצעות ריאגנט אלמן על פי פרוטוקול היצרן.

לאחר מכן, הכינו את תבניות ה-ATION על ידי חיתוך החלק העליון של סנטימטר אחד של מזרקים חד פעמיים סטריליים של מיליליטר. בעזרת סכין גילוח עיקר מחדש את תבניות המזרק. בעזרת אוטוקלאב, הכינו גיליון אלקטרוני המכיל חישובים של נוסחת הג'ל הרצויה, כולל נפח וריכוז חומרי המלאי, כולל פפטיד פולימרי, קרוסלינקר , יוזם פוטו ותמיסות חיץ.

תרבית תאים ראשונה מחממת מראש, תמיסת מלח מאוזנת של האנק בינוני, ושתי נסיעות ב-EDTA ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר צלוחיות של שישה תאי בטא דקות מהחממה והנח אותן במכסה הזרימה הלמינרית. לאחר שאיבת אמצעי תרבית התאים מהצלוחיות, יש לשטוף את התאים במיכלים חמים מראש, לאזן את תמיסת המלח.

לאחר מכן נסה לקרח את התאים באמצעות שלושה מיליליטר של חימום מוקדם, שני x נסיעות ב-EDTA ודגירה על הצלוחיות למשך ארבע דקות. לאחר הדגירה, הקש בעדינות על הצלוחיות על פני מכסה המנוע כדי לנתק לחלוטין את התאים. אשר את הניתוק והדיסוציאציה של התאים תחת מיקרוסקופ.

לאחר מכן, הוסף נפח שווה של מדיום תרבית תאים. כדי לנטרל את הטריפסין, מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה. לאחר מכן העבירו את התערובת לצנטריפוגה סטרילית של צינור חרוטי את תרחיף התאים למשך חמש דקות ב-200 RCF לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את התאים בארבעה עד חמישה מיליליטר של תרבית טרום חמה. מדיה.

לבסוף, קבע את צפיפות התאים על ידי ערבוב חלק מתרחיף התאים עם 50% טריאן כחול וספירת תאים עם ציטומטר המו. לאחר שהתאים מוכנים, מערבבים את הנפחים הנדרשים של יוזם פוטו קרוסלינקר פפטיד PEG 4 ו-B בריכוז סופי של תאים מילי-מולאריים ו-HBSS בצינור מיקרו-צנטריפוגה המבוסס על יחס TH ל-EEN של אחד לאחד ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-4%PEG 4 ו-B.

לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר מהתמיסה המתקבלת לכל תבנית מזרק. חשוף את תבניות המזרק לאור UV של 365 ננומטר בהספק של חמישה מילי-וואט לסנטימטר בריבוע למשך שתי דקות. כדי לפלמר את הג'ל לאחר פילמור פוטו, צללו את הג'לים לצלחת סטרילית של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים ודגרו את ההידרוג'לים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות כדי לשטוף כל תאים מחוברים באופן רופף או פקודות מאקרו לא מקושרות.

לאחר 30 דקות, הוציאו את הצלחת מהחממה והעבירו את הג'לים למיליליטר אחד של מדיה טרייה. רענן את המדיה כל יומיים-שלושה. הכן תמיסת אנזים של מיליגרם אחד למיליליטר על ידי הוספת תמיסת מלח מאוזנת של הנקס לטריפסין אלפא צ'ימי טריפסין.

ואז לעקר את התערובת בעזרת פילטר מזרק. לאחר מכן, הסר את צלחת התרבות מהחממה ושטוף את הג'לים בתמיסת מלח האיזון של האנק. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין פעמונים לכל באר לאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין על שייקר למשך כחמש עד 10 דקות על מנת להשיג שחיקת ג'ל מלאה.

לאחר שהג'ל מנותק לחלוטין, הניחו את הצלחת על קרח למשך מספר דקות כדי להפחית את פעילות ה-CH טריפסין. השלב הבא הוא להעביר את תרחיף התא לצינור מיליליטר אחד וצנטריפוגה לאט ב-45 RCF וארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה PEI והשהה בעדינות את הסטרואידים בתמיסת מלח האיזון של האנק.

לאחר מכן העבירו את תמיסת הסטרואידים המשוחזרת לצלחת חדשה של 24 בארות והניחו את הצלחת על קרח למשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לסטרואידים להתיישב ולהיצמד למשטח לצורך ניתוח גודל. רכוש תמונות ניגודיות פאזה של הספרואידים המיושבים באמצעות מיקרוסקופ אור למדוד קוטר ספרואידים משוחזרים באמצעות תוכנה כגון תוכנת אלמנט ניקון או תמונה J. שיטה זו של אנקפסולציה מבטיחה כדאיות תא ראשונית גבוהה כפי שכומתה על ידי צביעה חיה מתה. עם הזמן בתרבית התאים, חילוף החומרים של התאים כפי שנמדד על ידי אלמר, ריאגנטים כחולים גדלו במשך תקופה של 10 ימים בכל הריכוזים שנחקרו.

לאחר 10 ימים בתרבית תאים, הסטרואידים גדלו בגודלם ועדיין שמרו על כדאיות תאים גבוהה. בהידרוג'לים, ההידרוג'ל הפפטידי PEG תמך בהישרדות ובהתפשטות של תאי בטא עטופים, המוצגים כאן לאחר 10 ימים בתרבית, בהתאוששות סומטית עם אלפא צ'ים טריפסין משחרר את הסטרואידים ממטריצת ההידרוג'ל, ומייצר התפלגות צרה של גדלי סטרואידים שאינם תלויים בריכוז המטריצה. לאחר מכן ניתן להשתמש בסטרואידים אלה לאפיונים ויישומים נוספים תוך כדי ניסיון הליך זה.

חשוב לשמור על הומוגניות בתמיסת הקדם-פולימר במהלך האנקפסולציה כדי להבטיח שהתאים מפוזרים היטב. בעקבות הליך זה, ניתן לאפיין תאים משוחזרים באמצעות טכניקות אחרות כמו צביעה חיסונית שלמה וכתם מערבי על מנת לחקור את ההשפעה של מצב מטריצת ההידרוג'ל על ביטוי חלבון התא והפנוטיפ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעטוף תאים בהידרוג'לים, כמו גם כיצד לשחזר את התאים מהג'לים לאפיונים ביולוגיים נוספים.