הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנן משני מלנומה באמצעות מודל גידול אוטוגני של דג זברה. זה מושג על ידי יצירת בעלי חיים טרנסגניים שבהם המלנוציטים מבטאים גן מעניין והדגים נוטים למלנומה. לאחר מכן, הופעת המלנומה מקבלת ניקוד כדי להעריך אם הגן המעניין משנה את התחלת הגידול.

לאחר מכן מבוצעות פלישת גידול ובדיקות ספציפיות לתא כדי לקבוע כל השפעה נוספת של הגן המעניין על מלנומות ומלנוציטים טרום ממאירים. לבסוף, תאי מלנומה מושתלים כדי למדוד כיצד הגן המעניין משפיע על תדירות התאים המתחילים מלנומה בגידולים מבוססים. התוצאות מראות כיצד גן מועמד משפיע על תכונות שונות של מלנוציטים ומלנומות, כולל פלישה ויכולת השתלה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנסגנזה של קו הנבט לסקר גנים סרטניים מועמדים הוא שזמן, מאמץ והוצאות נחסכים, והתפוקה מוגברת על ידי בדיקה. היבטים שונים של גידול בבעלי חיים טרנסגניים פעמונים תדגים הליך זה תהיה שרניה אגר, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי ליצירת מבנים להזרקה. התחל ביצירת שיבוטי כניסה אמצעית על ידי PCR, הגברת מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של גנים מעניינים ושילוב מחדש ל-P don R 2 21.

לאחר מכן השתמש בטכנולוגיית שער מרובה אתרים כדי לשלב מחדש את גן מקדם ה-mifa הספציפי למלנוציטים המעניין ואת אות הפוליאדנילציה לתוך וקטור קופר המיני כדי למקם גנים מעניינים תחת שליטת מקדם ה-mifa להזריק 25 פיקוגרם מכל שיבוט, יחד עם 25 פיקוגרם של TOL שני מעבירים mRNA לעוברי דג זברה הומוזיגוטיים משולשים טרנסגניים של תא אחד. מיפה בראף FP 53. בעלי חיים מוטנטיים הם חסרי מלנוציטים ונוטים לטרנספורמציה ולהיווצרות מלנומה.

יחד עם הגן המעניין. וקטור המיני קופר מכיל מיני גן MVA מציל. כך שבעלי חיים שהוזרקו בהצלחה יפתחו מלנוציטים שניצלו, המבטאים את הגן המעניין.

דגירה על העוברים המוזרקים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס 24 שעות לאחר ההפריה או HPF. הסר את כל העוברים המתים 72 שעות לאחר ההפריה באמצעות מיקרוסקופ מנתח באור מקרי על רקע לבן. בחר בעלי חיים טרנסגניים עם מלנוציטים שניצלו.

כאשר בעלי החיים מגיעים לארבעה ימים לאחר ההפריה, העבירו אותם למיכלים של שלושה ליטר במשתלה של מתקן דג הזברה. בגיל חודשיים, בחר את בעלי החיים עם לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציטים גדול מארבעה מילימטרים בריבוע. סנן את החיות שנבחרו מדי שבוע לנוכחות גידולים.

לבודד בעלי חיים נושאי גידול למחקר. צייר עקומות הישרדות ללא מלנומה עם הגיל בשבועות על הבטן ואחוז הישרדות ללא מלנומה על הקואורדינטה. השוו בעלי חיים עם מלנוציטים המבטאים גן מעניין לשליטה בחיות המבטאות EGFP ומלנוציטים.

השתמש במבחן דירוג יומן כדי לקבוע אם שתי העקומות שונות מבחינה סטטיסטית. לבצע בדיקת פלישת גידול. התחל בבחירת דגי זברה מבודדים המפתחים גידולים גביים באזור שבין הגבול האחורי של המוח האחורי לגבול הקדמי של סנפיר הגב.

שבועיים לאחר הופעת המלנומה, השתמש בטריקה כדי להמית את הדג לאחר קיבוע והטמעת הדג בפרפין. בצע חמישה חתכים רוחביים מיקרומטר דרך הנגעים. אחד. כל 50 מיקרומטר חותכים את כל הנגע כך שניתן לזהות את נקודת הפלישה העמוקה ביותר.

השתמש בהמטין ובאואין כדי להכתים את החלקים. העריכו את פלישת הגידול על ידי מדידה אם תאי הגידול נשארים מחוץ לשכבה הקולגנית, פולשים לשרירי הגב או פולשים הלאה לתוך עמוד השדרה. קבע את ההבדל הסטטיסטי בין שתי קבוצות הדגימות לביצוע צביעה חיסונית.

להרדים את הדג ב-0.17 מיליגרם למיליליטר טריקה עם אור מקרי תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש במלקחיים חדים עם קצה דק כדי למרוט קשקשי גב. הקפדה לא לפגוע במלנוציט המכיל מחצית מהאבנית.

מניחים את הקשקשים ישירות מהמלקחיים למיליליטר אחד של קיבוע ודוגרים בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב של יותר או שווה לשעתיים. העבירו את הדגים למי הדגים ועקבו אחר הדגים כדי לאשר התאוששות מוצלחת למלנוציטים פיגמנטיים מלבינים. ראשית יש לשטוף מאזניים קבועים ב- PBST פעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת אקונומיקה טרייה וכסו במנעולי בושם או מכסה כדי למנוע מגזים להתפוצץ בצינורות. המשיכו להלבין עד שהפיגמנט נעלם. לאחר מכן יש לשטוף ב-PBST ארבע פעמים בחמש דקות בטמפרטורת החדר.

דגירה למשך 30 דקות לפחות בתמיסת בלוק, ולאחר מכן דגירה עם כ-400 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני ותמיסת חסימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את המאזניים שלוש פעמים במשך 30 דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר, דגרו עם נוגדן משני למשך שעתיים עד לילה בטמפרטורת החדר. לאחר עמידה עם dpi, מרחו טיפה של מגן וקטורי על מגלשת זכוכית והרכיבו את המאזניים כך שהצד הקעור של הקשקשים פונה כלפי מטה כנגד המגלשה. הנח תלוש כיסוי זכוכית מעל הדגימות.

השתמש בלק שקוף כדי לאטום את הקצוות ולהתבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלורסנט. לאחר מושתל מקרין, דג קספר בן חודשיים עד שלושה חודשים עם 25 אפורים של קרינת גמא יום אחד לפני ההשתלה. אפשר לדגים להתאושש במי הדגים.

השתמש בטריקה כדי להמית דג נושא גידול, חתך את הגידול והכניס אותו לצלחת פטרי עם כחמישה מיליליטר של פילטר מעוקר 0.9 XPBS עם 5% FBS עם סכין גילוח קוביות את הגידול בזמן שהוא עובד בטמפרטורת החדר ועם פיפטה P 1000 חוזר על עצמו לייצור תאים בודדים. העלו את הנפח ל -25 מיליליטר. סנן את התמיסה דרך מסנן רשת של 40 מיקרומטר וסובב פנימה צנטריפוגה שולחנית ב-453 RCF למשך 10 דקות.

השעו מחדש את הגלולה ב-0.9% PBS 5% FBS לריכוז הרצוי. בעזרת ציטומטר המו, חשב את מספר התא המדויק ודלל את מתלה התאים כך שנפח ההזרקה הסופי יהיה כחמישה מיקרוליטר. לדוגמה, אם יש להזריק 50,000 תאים, יש לדלל את תרחיף התאים לריכוז סופי של 10,000 תאים למיקרוליטר.

החליקו את הצינור המכיל את תרחיף התאים כל כמה דקות כדי למנוע התגבשות של התאים עם 100% אתנול ו-0.9 XPBS. שטפו מזרק המילטון עם קצה שיפוע של 26 שניות 7, 0, 1 ו-10 מיקרוליטר פעמיים-שלוש לפני העמסת המזרק בחמישה מיקרוליטר של מתלה התא. לאחר הרדמת הדג המקבל המוקרן בטריקה, הניחו אותו על צדו על מגבון קים לח.

מייצבים את הדג ביד אחת ומכניסים את המחט כשהשיפוע פונה כלפי מעלה בזווית של 45 מעלות לתוך צד הדג מעל חלל הצפק. בערך באמצע הדרך בין הגבול האחורי של המוח האחורי לגבול הקדמי של סנפיר הגב. לחץ בעדינות על הבוכנה.

אפשר לדגים להתאושש במי דגים טריים והתבונן בדגים מדי יום לחריטת גידול. אם התרחשה חריטה, ניתן לראות גם המשך צמיחה והתפתחות מחלות. לעוברי דג הזברה של תא אחד BRAF FP 53 MIFA הוזרקו וקטור מיני קופר המכיל את סט האונקוגן של מלנומה DB אחד או EGFP כל אחד בשליטת מקדם ה-MFA כפי שמוצג כאן.

עקומות שכיחות הגידול עבור המבוגרים גילו כי ה-SET DB 1 האיץ משמעותית את הופעת המלנומה בהשוואה לבקרת EGFP כפי שניתן לראות כאן, צביעת המטין ו-EOSIN מראה כי מלנומות המבטאות SET DB one היו פולשניות יותר מקומית מאשר מלנומות בקרת EGFP. איור זה מציג קשקשי גב של דג זברה מולבנים או לא מולבנים שנצבעו בנוגדנים המזהה את גורם השעתוק המקומי הגרעיני של mifa כדי להעריך את יכולת ההשתלה של הגידול. תאי מלנומה בודדו מדג BRAF FP 53 mifa שהוזרקו עם מיני R-E-G-F-P 50,000 תאים הוזרקו תת עורית למוטציה של קספר מושתלת שהוקרנה יום קודם לכן עם 25 אפורים כפי שניתן לראות כאן בגיל שבועיים.

תאים שמקורם בתורם פיגמנטי זוהו בקלות. אז לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את ההשלכות התפקודיות של שינויים גנטיים הקשורים למלנומה באמצעות דג הזברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן משני מלנומה על ידי בדיקה, הבדלים בפלישת הופעת הגידול, ביטוי גנים ויכולת השתלה באמצעות מודל גידול אוטומטי של דג זברה.