שיטות ניסיוניות לבדיקת ההשפעות של הפפטיד neurotrophic, ADNF-9, נגד אפופטוזיס מושרה אלכוהול במהלך הריון בעכברי C57BL / 6

מטרת הליך זה היא להעריך את ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של פפטידים טרופיים במודל חשיפה לאלכוהול עוברי. זה מושג על ידי הזדווגות תחילה של חיות הניסוי ולאחר מכן טיפול בנקבות ההרות עם פפטידים טרופיים כשלב שני, העוברים מנותחים כדי לבודד מוחות עובריים לשימושים ניסיוניים. לאחר מכן, מוחות העובר מוטמעים בג'לטין לצורך חתך, ולאחר מכן צביעת מנהרה כדי לקבוע תוצאות מוות תאי.

זה מראה שחשיפה לאלכוהול לפני הלידה מגדילה את מספר התאים החיוביים למנהרה בבולטות הגנגליונים. בהשוואה למתן קבוצת הביקורת של הפפטיד הטרופי, D ו-F 9 הפחיתו משמעותית את העלייה הנגרמת על ידי אלכוהול בתאים חיוביים במנהרה בהשוואה לבעלי חיים שטופלו באלכוהול. לכן הדגמה ויזואלית של מתכת זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את נתיחת מוח העובר ואת השלבים המוטמעים מכיוון שמוחות העובר קטנים מאוד לניתוח ולעיבוד חיתוך של שישה עכברים שחורים מגזע ראשון C 57 על ידי הכנסת עכברים נקבות בנות שישה שבועות במשקל של כ-20 גרם לכלובי בית זכרים למשך שעתיים מיד לאחר ההסרה.

בדוק אם יש פקק זרע אצל כל נקבה כדי לוודא שהתרחשה הזדווגות. אם קיים פקק זרע, ייעד את יום האפס העוברי הזה ב-E שבע משקל תואם נקבות בהריון לארבע קבוצות. קבוצת דיאטה נוזלית אחת של אלכוהול סיפקה גישה חופשית כמקור היחיד לחומרים מזינים.

שתי קבוצת ביקורת של Perfed שלוש קבוצת טיפול בפפטיד, שאמורה לקבל הזרקה תוך צפקית של DNF 9 פפטיד לצד חשיפה לאלכוהול. דיאטה נוזלית. רשום את נפח התזונה הנוזלית הנצרכת על ידי בעלי החיים תוך 24 שעות מצינורות מכסה בורג מדורגים של 30 מיליליטר כדי לקבוע את הכמות היומית של אלכוהול, תזונה נוזלית או דיאטה נוזלית מזווגת שניתן לספק באמצעות עודף חופשי כמקור היחיד לחומרים מזינים.

ודא שתזונה נוזלית טרייה מסופקת מדי יום מ-E 7 עד E 13 לאחר הקרבת Myer E 13 ההרה על ידי המתת חסד של פחמן דו חמצני, ואחריה פריקת צוואר הרחם. הניחו את הפגר על לוח החיתוך במצב שכיבה ונקו את הבטן עם 70% אתנול. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לבצע חתך בבטן.

ברגע שהבטן פתוחה, החזיקי את הרחם עם מלקחיים והשתמשי במלקחיים שניים כדי לקרוע לאט ובעדינות את רירית הרחם מהרחם מבלי לנקב את העוברים. הוציאו בזהירות את העוברים מהרחם והעבירו אותם לתמיסת מיון האיזון של האנק בצלחת תרבית תאים בגודל 60 מילימטר על 15 מיליליטר על קרח רטוב, הניחו את הכלי ומיכל הקרח על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד למיקרודיסקציה. משוך את עור העוברים בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.

לאחר שהגולגולת נחשפת ומומחשת בבירור במיקרוסקופ הסטריאו, תפסו את בסיס הגולגולת בגובה חוט השדרה וגזע המוח בעזרת מלקחיים והתחילו לקלף את הגולגולת. המשך לקלף את הגולגולת חתיכה אחר חתיכה מהחלקים האחוריים לקדמיים של הראש. לאחר שהמוח נחשף במלואו, השתמש במלקחיים כדי לחלץ אותו.

לאחר מכן נתחו את מוח העובר מבסיס נורת המפעל או הקדמון לבסיס ה-Met Postfix כל מוחות העוברים המנותחים ב-4% פרלדהיד למשך יומיים-שלושה. מוחות עובריים יכולים גם להיות מוקפאים אם בודקים אותם לבדיקות מערביות או אנזימטיות. לאחר הכנת תמיסה של 10% של ג'לטין בדרגה A שהוכנה במים מזוקקים, מלאו תבנית הטבעה קליפה באמצע הדרך והמתינו עד שהג'לטין יתמצק.

הנח מוחות עובריים בקרה ומטופלים לפני הלידה זה לצד זה על גבי הג'לטין המוצק. זאת כדי לשמור על תנאים עקביים הן בין קבוצת הביקורת והן בין קבוצת הניסוי. ודא שהג'לטין לא חם מדי והוסף ג'לטין נוזלי על גבי מוח העובר ליצירת תבנית שלמה.

התבנית הסופית צריכה להידמות לתמונה זו, לקרר את תבנית הג'לטין המוכנה המחזיקה את מוח העובר למשך 15 דקות. לאחר מכן, קלף את פלסטיק תבנית ההטבעה. התבנית הסופית צריכה להיראות כך ואז להעביר את מוח העובר המכיל ג'לטין ל-4% פרלדהיד למשך יומיים.

ביום השלישי יש לחבר את בלוק הג'לטין המכיל מוחות עובריים קבועים לשלב הוויום. לאחר מכן חתכו את המוחות באמצעות סט ויומי בעובי של 25 עד 50 מיקרון לחיתוך עטרה. אספו את חלקי מוח העובר ב-PBS, ואז הרכיבו את חלקי מוח העובר על סופר כפור בתוספת מגלשות במים והניחו להם להתייבש במשך 15 דקות.

לאחר שחלפו 15 דקות. הנח את השקופיות ב-PBS לבדיקת תגובת המנהרה. ראשית, טבלו את השקופיות בתמיסה של 20 מיקרוגרם למיליליטר פרוטאינאז K ו-PBS למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות כל אחת על שייקר אורביטלי. דגרו את החלקים עם מי חמצן 3% במתנול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לנער. לאחר מכן שטפו את השקופיות כמו קודם.

לאחר מכן, דגרו חלקים בתמיסה חדירה למשך שתי דקות על קרח. לאחר הדגירה נשטף פעמיים ב- PBS. כמו קודם, השתמש ברקמת מעבדה כדי לייבש את אזור המגלשה סביב החלקים.

לאחר מכן השתמש בעט טפיחה כדי לצייר סביב המקטעים בשקופית. זה מונע דליפה של תמיסת הצביעה, ובכך מאפשר להשתמש בנפח קטן. דגרו קטע אחד בכל זוג עם תערובת תגובת מנהרה שהוכנה על פי הוראות היצרן.

הוסף תמיסת נשא ללא מגיב מנהרה לקטע הבקרה השלילית. לאחר מכן דגרו את המגלשות למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שחלף זמן הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-PBS על שייקר מסלולי כמו קודם.

לאחר מכן יבש את האזור סביב הרקמה עם מגבון מעבדה. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם תמיסת POD ממיר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. לאחר מכן שטפו את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם tris HCL.

העבירו את השקופיות למחזיק והניחו אותן בצנצנת קופלין המכילה 0.05% DAB ו-0.003% מי חמצן. מכסים את הצנצנת בנייר אלומיניום ומניחים אותה על שייקר אורביטלי על קרח למשך שבע דקות לאחר הדגירה, שוטפים PBS כמו קודם, אם רוצים. ניתן לאחסן את השקופיות ב-PBS לפני שממשיכים להכתים נגד טילים כמפורט בחלק הטקסט של הפרוטוקול.

התמונות הבאות, מראות את ההשפעות של הפפטיד הנוירוטרופי, DNF תשע כנגד אפופטוזיס המושרה על ידי אלכוהול באמצעות בדיקת מנהרה בבולטות הגנגליונית כאשר חשיפה לאלכוהול בשלב E 13 גרמה לעלייה במוות התאים כפי שמצוין על ידי ראשי החץ בקבוצת A LC בהשוואה לקבוצת PF. מתן D NF NINE לצד חשיפה לאלכוהול לפני הלידה גרם לירידה בתאים החיוביים למנהרה. ניתוח סטטיסטי הראה כי מתן AD ו-F 9 מנע עלייה בתאים חיוביים למנהרה.

הערכים מוצגים כאמצעים פלוס מינוס שגיאת תקן של הממוצע. כוכבית בודדת מציינת ערך P של פחות מ-0.052. כוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.01 על ידי מבחן פוסט הוק של ניומן קולס.

כל קבוצה הכילה N של ארבעה. אז לאחר פיתוחו, טכניקה זו דרך לחוקרים ולתחום התפתחות המוח לחקור את ההשפעות של תרופות או תרכובות והתפתחות מוחית בעכברים.