Name: הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: למדו כיצד לבצע הקלטת פוטנציאלים שדה חוץ-תאיים במוח הקדמי של זחלי דג זברה בשלמותם. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי פעילות דמוית-פרכוסים בחיות חיות, ותומכת במחקר על אפילפסיה ושינויים גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות לפיטר קסטרו ומתיו Dinday על מאמציהם המוקדמים להקמת דג זברה במעבדה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק EUREKA (# R01NS079214-01).

<html> 1. ייצור ביצים ואוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג זברת גידול בעלי כדלקמן נהלים סטנדרטיים שתוארו בעבר 8. בקצרה, דג זברה בוגר מוגדר ברביית טנקים עם חוצצים במקום. כאשר האורות בחדר הגיעו בבוקר שלמחרת, חוצצים יוסרו מרביית טנקים ודגים מותרים כ 20-60 דקות של זמן זיווג באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מטנקי הרבייה נאספות במסננת ולשטוף במי ביצה. ביצים ואז מועברות לצלחת פטרי עם מי ביצה. ביצים ופסולות מופרים יוסרו באמצעות פיפטה העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי המכילה מקום לביצים שנאספו בחממה (28-32 מעלות צלזיוס). לאחר בקיעה, סביב שני ימים לאחר ההפריה (DPF), להסיר סיסי וכל פסולת אחרת עם פיפטה העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום רצוי לאחר ההפריה (3-8 DPF) להסיר צלחת פטרי המכיל זחלי חופשיות חייה ומקום על שולחן מעבדה בטמפרטורת חדר. </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Microelectrode מושך והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש חולץ micropipette, מושך 1.2 מ&quot;מ OD ורוסיליקט זכוכית נימי לשתי מחטים וחנות בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ או תיבת פיפטה ריקה על ידי נחת מעל רמפות מרק טיפשיות. מחטים יכולות להיות משך מראש. OD שונות זכוכית נימים ניתן להשתמש בהתאם לסוג של המגבר headstage הזמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Backload microelectrode עם פתרון הקלטה תאי (2 M NaCl) באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מזרק Nalgene מסנן (4-מ&quot;מ) וMicrofil נימה (מכשירי ורנר Precision) המצורפת. לנער או קש בולוס לעבר קצה המחט עד שיש כמה בועות או לא הנותרים. </li></ol> 3. ריתוק אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חדש של אגר 1.2% נמוכים היתוך נקודה במי ביצה. פתרון אגר מקום בסט אמבט מים ב ~ 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן coverslip עם חדר הקלטה ומקום במקפיא (5-10 דקות). חדר ההקלטה צריך matcשעות שהשתמשו באסדת electrophysiology. אנו משתמשים בחדר בפרופיל נמוך פתוח יהלומי אמבטית הדמיה מורנר מכשירים (הדגם RC-26GLP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש פסטר או ההעברה פיפטה, מקום דג זברת זחל אחד בטיפה קטנה של מי ביצה בצלחת פטרי צלחת נקיה. לאגל זה, להוסיף טיפה של תמיסה המכילה חומר הרדמה (0.02% tricaine) וסוכן משתק (1 α-bungarotoxin מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקח על דג זברה לאובדן של תנועה (5 עד 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip / חדר הקלטה ממקפיא. הנח קאמרי על הבמה של stereomicroscope. באמצעות פיפטה העברה, לערבב כמה מ&quot;ל של 1.2% ההיתוך agarose נקודה הנמוך עם פתרון טרנספר (עם דגים) לתא coverslip / הקלטת אגל ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה פיפטה או מחט בוטה בסדר, זחלי עמדה תחת stereomicroscope כך שההיבט הגבי של הדג חשוף למשטח ג&#39;ל agarose. אפשר agarose להקשיח (5-10 דקות), ולאחר מכן באמצעות העברת מרית שטוחה ב אגרתנעל לחדר הקלטה להגדיר על אסדת electrophysiology. </li></ol> 3. הקלטת שדה תאית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2-5 מ&quot;ל של הקלטת מדיה דג זברה לתא ההקלטה. אם שינויי סמים קאמריים צורך, ינקבו עם פתרון הקלטה בקצב של כ 1 מ&quot;ל / דקה. אין חמצון של פתרון ההקלטה הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microelectrode (כ 1 מיקרומטר קוטר קצה, 2-7 MΩ) לheadstage המגבר רכוב על micromanipulator תלת ממדי. בדקו שmicromanipulator הוא בתנוחה נכונה על מנת לאפשר טווח התנועה וההסתגלות. הבא את קצה microelectrode לתוך מטוס מבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, ובאמצעות התאמה גסה נמוכים יותר לנקודה שמעל ומעט לפני ראש דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המגבר ב&quot;-מהדק נוכחי &quot;מצב אפס אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התאמה גסה נמוכה קצה האלקטרודה כך שהוא רק נוגע בשלurface של דג הזברה, מעט לפני המוח הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צעדי התאמה עדינים לקדם את קצה האלקטרודה עד שמחורר את העור של דג הזברה. אפשר להתיישב ולאחר מכן לקדם את האלקטרודה כמה מיקרונים לתוך המוח קדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט פעילות חשמלית במצב הנוכחי מהדק באמצעות תוכנת Axoscope. נתונים נרכשים בקצב דגימה של 10 קילוהרץ. </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת ההקלטה התאית מוצגת כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של פעילות המוח. הקלטות אלה הן מקבילות לניטור electroencephalographic (EEG) משמש בדרך כלל כדי להעריך את הנוכחות של פריקה חשמלית חריגה (כלומר, תפיסה) במכרסמים של 11 חולי אפילפסיה ו12. הקלטות תאיות יכולות להיות משולבות עם מניפולציות תרופתיות, כפי שמוצג כאן. אלו סוגים של הקלטות יכולים לשמש גם להערכת פנוטיפים אפילפטיים פוטנציאליים בדג זברה מהונדסת גנטי. דג זברה מוטנטים הם בדרך כלל זמין למוטציות גנטי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> התכה נמוכה agarose </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1360-100 </td><td> לפזר בתקשורת עובר ב1.2% </td></tr><tr><td> הקלטת מדיה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 </td><td> 1 המ&quot;מ NaCl, 2.9 mM KCl, 10 HEPES מ&quot;מ, 1.2 המ&quot;מ MgCl 2, 10 mM דקסטרוז, 2.1 המ&quot;מ CaCl 2 pH לכ 7.3 עם N NaOH 1 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> מעבדות argent </td><td> MS-222 </td><td> 0.02% </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 2133 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> צינורות זכוכית נימים </td><td> וורנר מכשירים </td><td> G120TF-3 </td><td> משוך להתנגדות של 2 -7 MΩ </td></tr><tr><td> מגבר מהדק תיקון </td><td> וורנר מכשירים </td><td> PC-505B </td><td> אנו משתמשים במגבר וורנר במצב מהדק שוטף; רווח נקבע ברמה של 2 mV / Pa ו Bessel המסנן נקבע על 2K. מודלים דומים ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן. </td></tr><tr><td> מסנן / מגבר </td><td> סיגנוס טכנולוגיה </td><td> FLA-01 </td><td> אנו משתמשים בקדם מגבר Cygnus; רווח נקבע על 10-20; תדירות Cut-off להגדיר ב 1-2K; מסנן חריץ ב. מודלים דומים ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן. </td></tr><tr><td> אקסון / D לוח ותוכנת Axoscope </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> אקסון Digidata 1320A; Axoscope 8.2 </td><td> נתונים נאספים בשימוש במצב Axoscope רכישה ללא פער; דגימה ב 10 קילוהרץ. ניתן להשתמש במודלים ותוכניות דומים על פי הוראות היצרן. </td></tr><tr><td> מי ביצה </td><td&gt; מיידי אוקיינוס </td><td></td><td> 3 גרם מיידי אוקיינוס ​​ים מלח, מ&quot;ל 0.1% כחול 2 תילן במי 10 מ&quot;ל deionized </td></tr></tbody></table>

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

אפילפסיה משפיעה על כמעט 3 מיליון בני אדם בארצות הברית ועד 50 מיליון אנשים ברחבי עולם. מוגדר כהתרחשות של התקפי התגרות ספונטניים, אפילפסיה יכולה להיות שנרכשה כתוצאה מפגיעה במוח או מוטציה גנטית. מאמצים להתקפי מודל בבעלי חיים בעיקר נצלו רכשו עלבונות (תרופות convulsant, גירוי או ניזק מוחי) ומניפולציות גנטיות (מציאת antisense, הומולוגי רקומבינציה או transgenesis) במכרסמים. דג זברה הוא מודל למערכת חוליות 1-3 שיכולים לספק חלופה רבה ערך למחקר אפילפסיה מכרסם מבוסס. דג הזברה נמצאים בשימוש נרחב במחקר של חוליות לגנטיקה או פיתוח, להפגין מידה רבה של דמיון גנטי ליונקים ולהביע homologs ל~ 85% ממוטציות אנושיות ידועות בגן בודד אפילפסיה. בשל גודלם הקטן (4-6 מ&quot;מ אורך), זחלי דג זברה יכולים להישמר בנפחי נוזלים נמוכים כמו 100 μl במהלך ההתפתחות המוקדמת וערהyed בצלחות רבות גם. ריאגנטים ניתן להוסיף ישירות לפתרון שבו עוברים מתפתחים, לפשט את מנהל תרופות ומאפשרים מהיר בהקרנת vivo של תרכובות בדיקה 4. oligonucleotides הסינטטי (morpholinos), mutagenesis, אבץ האצבע nuclease וגישות מהונדסות ניתן להשתמש במהירות כדי לייצר מציאת גן או מוטציה בדג זברת 5-7. מאפיינים אלה להרשות מחקרי דג זברת יתרון חסר תקדים סטטיסטי כוח ניתוח על מכרסמים בחקר הפרעות נוירולוגיות כמו אפילפסיה. בגלל &quot;תקן הזהב&quot; למחקר אפילפסיה הוא לנטר ולנתח את ההפרשות החריגות החשמל שמקורן במבנה מרכזי במוח (כלומר, פרכוסים), שיטה יעילה כדי לתעד את פעילות מוח בזחל דג זברה מתוארת כאן. שיטה זו היא עיבוד של טכניקות הקלטה תאיות קונבנציונליות ומאפשרת ניטור יציב לטווח ארוך של פעילות מוחית בזחלי דג זברה ללא פגע. Sהקלטות שפע מוצגות להתקפים חריפים הנגרמים על ידי יישום של תרופות convulsant אמבטיה והתקפים ספונטניים שנרשמו בדגים מהונדסים גנטי.

דוגמאות לפריקת התקפים דמוי electrographic נרשמה במוח הקדמי של זחלי דג זברה אגר-מוטבעים מוצגות באיור 1. פריקת פרץ גדול משרעת רבת עלייה חדה בדגימות אלה הייתה מעורר על ידי יישום אמבט של תרופת convulsant, pilocarpine mM 40 (ב; 6 DPF) או picrotoxin mM 1 (בנקודת B, 8 DPF). בהקלטות אלה, משותקים ודג הזברה אגר משובץ ברציפות נמצאים במעקב לתקופה של עד 90 דקות. דגים נשארים קיימא בתנאים אלה להקלטה של ​​עד 24 שעות. תרופות נוספות לרחצה ובינונית בדרך כלל המפוזרת לאגר כדי לעורר פע...

שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת חזקה<em&gt; In vivo</em&gt; לקריאה מתוך התקף כמו פעילות. טכניקה זו יכולה להיות בשימוש עם זחלי דג זברה מהונדסת גנטי נושאים גנים הקשורים לאפילפסיה או התקפים שהומצאו על ידי מתן של תרופות convulsant.

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג רישומי שדה חוץ-תאיים מהמוח הקדמי של דג זברה זחל שלם. זה מושג על ידי שיתוק תחילה של דג הזברה הזחל בגוש ארוס. לאחר מכן, מיקרו אלקטרודה מקליטה ממוקמת במוח הקדמי תחת הדמיה ישירה.השלב האחרון הוא תיעוד הפעילות החשמלית של המוח הקדמי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתוצאות כדי לנטר פעילות התקפים אלקטרוגרפיים חריגה בזחלי דג זברה שלמים. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר ביקשתי להדגים שניתן לעורר התקפים בזחל דג הזברה גידול דג הזברה לפי הנהלים הסטנדרטיים שתוארו קודם לכן. על רגל אחת.דגי זברה בוגרים מוקמים במיכלי רבייה עם חוצצים במקום. כאשר האורות בחדר נדלקים למחרת בבוקר, המחיצות מוסרות והדגים מקבלים 20 עד 60 דקות של זמן הזדווגות ללא הפרעה. לאחר מכן נאספות ביצים מהמיכלים, מועברות לצלחת פטרי עם מי ביצים ומנקות מפסולת בעזרת פיפטת העברה מניחות כעת את הביצים בחממה, ובעוד כיומיים הביצים יבקעו.לאחר הבקיעה, הסר את הקוריון וכל פסולת אחרת בעזרת פיפטת העברה ואז החזיר את הזחלים לאינקובטור עד שהם מגיעים לנקודת הזמן ההתפתחותית הרצויה. בהכנה, משוך נימי זכוכית סיליקט בקוטר חיצוני של 1.2 מילימטר לתוך מחטים באמצעות מושך מיקרו פיפטה. אחסן את המחטים בצלחת פטרי 150 מילימטר מעל רמפות מרק.כעת ארזו, טען את המיקרו אלקטרודה עם תמיסת הנתרן הכלורי המולארית. בעזרת מזרק ליטר אחד עם מסנן מזרק של ארבעה מילימטר וחוט מחובר, הקש על הבולוס ליד קצה המחט עד שנותרו מעט בועות או לא נשארו כלל. הכינו תמיסה טרייה של אגר LMP 1.2% במי ביצים ושמרו אותו מומס באמבט של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הכינו פתק כיסוי עם תא ההקלטה המתאים והכניסו אותו למקפיא למשך חמש עד 10 דקות. דוגמה זו משתמשת בתא הדמיה פתוח של אמבט יהלום בפרופיל נמוך בצלחת פטרי נקייה טובלת זחל אחד, דגים בטיפה של מי ביצה באמצעות פיפטת העברה. לאחר מכן, ערבבו טיפת תמיסה המכילה חומר הרדמה ומשתק למשך חמש עד 10 דקות.עקוב אחר דג הזברה לאובדן תנועה. לאחר מכן הסר את החלקת הכיסוי ותא ההקלטה מהמקפיא. הנח את החדר על במת המיקרוסקופ הסטריאו לתא.בעזרת פיפטת העברה מוסיפים כמה מיליליטר אגרוס לדג במים ומערבבים אותם יחד בעזרת קצה מיקרו פיפטה או מחט קהה דקה. מקם את הזחלים כך שההיבט הגבי של הדג ייחשף למשטח הדומם של האגרוס. לאחר שהאגרוס מתקשה, השתמש במרית שטוחה כדי להעביר את בלוק האגרו עם הזחלים לתא הקלטה שהוקם על מתקן אלקטרופיזיולוגיה.באסדה, הוסף שניים עד חמישה מיליליטר של אמצעי הקלטה של דג זברה לתא ההקלטה. אם יש צורך בשינויים תרופתיים, יש להחדיר את החדר בתמיסת הקלטה בקצב של כמיליליטר לדקה, אין צורך בחמצון. לאחר מכן, הכנס מיקרו אלקטרודה לשלב ראש המגבר המותקן על מיקרו מניפולטור תלת מימדי.לאחר הטעינה, בדוק שלמניפולטור המיקרום יש טווח תנועה והתאמה טוב. לאחר מכן הביאו את קצה המיקרו-אלקטרודה למישור הראייה של המיקרוסקופ גבוה מהבמה, ובאמצעות התאמת המסלול, הורידו אותו לנקודה ממש מעל ומעט לפני ראשו של דג הזברה. כשהמיקרו אלקטרודה במקומה, הכנס את המגבר למצב מהדק זרם ואפס את האלקטרודה בשדה הראייה.השתמש בכוונון המסלול כדי להוריד את קצה האלקטרודה כך שהוא פשוט ייגע מעט במשטח של דג הזברה מול המוח הקדמי. לאחר מכן, בשלב ההתאמה העדין, קדם את קצה האלקטרודה עד שהוא מנקב את עורו של דג הזברה. לאחר הניקוב, אפשר למיקרו פיפטה להתיישב לאט לאט לקדם את האלקטרודה כמה מיקרונים לתוך המוח הקדמי.כעת השתמש בתוכנת aScope כדי לתעד פעילות חשמלית. במצב מהדק נוכחי, רכוש נתונים בקצב דגימה של 10 קילו-הרץ. הדג נשאר בר קיימא במשך 24 שעות של רישום כדי ליישם תרופות, להוסיף אותן בנפחים של שניים עד חמישה מיליליטר ולהמתין 30 עד 45 דקות עד שהתרופות יתפזרו דרך האגר לתוך דג הזברה.ארבעה מוחות. תצורת אמבטיה סטטית מקובלת, מה שהופך את הזלוף הרציף למיותר. באמצעות שיטות אלה, ניתן לקבל הקלטות חוץ-תאיות גם מהגידול האופטי.הפרשות דמויות התקפים אלקטרוגרפיות נרשמו במוח הקדמי של שמונה ימים לאחר ההפריה, זחלי דג הזברה, התפרצויות ספייק מולטי משרעת גדולות בוטלו על ידי מריחת אמבטיה של 40 מילי-מולארי פילוקרפין, תרופה עוויתית. התפרצויות דומות הופקו עם תרופה עוויתית. ריטוקסין מיושם במילימולר אחד.פריצת פרץ ספונטנית נצפתה מדג זברה מהונדס גנטית שלושה ימים לאחר ההפריה. בבעל חיים זה, הזרקות מורפו אוליגונוקלאוטיד בשלב תא אחד עד שניים שימשו כדי להפיל ביטוי של גן לתסביך טרשת שחפת, צורה של אפילפסיה בילדים הקשורה להתקפים ואוטיזם. אם מבוצע כהלכה, ניתן להשלים הליך זה תוך 30 דקות או פחות.

forebrain-electrophysiological-recording-in-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הפרוטוקול מתאר את ההליך לביצוע אלקטרופיזיולוגיה בדגי זברה בוגרים. שיטה זו יכולה לשמש למדידת פעילות עצבית in vivo.

אלקטרופיזיולוגיה של דגי זברה בוגרים: שיטה למדידת הפעילות החשמלית החוץ-תאית של תאי עצב ב-Vivo

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.

ניתוח התנהגותי ופיזיולוגי במודל דגי זברה של אפילפסיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מפשט את המדידה של אור electroretinogram עורר תגובות דג זברה זחל. אלקטרודה הרומן בצורת חרוט ספוג-עצה יכולים לעזור להפוך את המחקר של פיתוח ויזואלי בזחל דג זברה שימוש את electroretinogram ארג קל יותר להשיג עם תוצאות אמינות ועלות נמוכה יותר.

הקלטת Electroretinogram דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה ספוג-טיפ בצורת חרוט הרומן A

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

למדו כיצד לבצע הקלטת פוטנציאלים שדה חוץ-תאיים במוח הקדמי של זחלי דג זברה בשלמותם. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי פעילות דמוית-פרכוסים בחיות חיות, ותומכת במחקר על אפילפסיה ושינויים גנטיים.

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

גלה סרטונים נוספים