Name: מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למדו כיצד למדוד את הקשיחות הכפיפה של מיקרוטובולים באמצעות מבחן דאייה מונע קינזין. שיטה זו מאפשרת לקבוע את אורך ההתמדה של מיקרוטובולים בודדים ולהבין את מכניקת השלד התאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים למליסה Klocke לסיוע הכנת האיור 1 ואנה רטליף להוכחה בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי חברת המחקר לקידום מדע.

1. פתרוני microtubule דאיית Assay מניות להכין מראש assay דאייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלמר 0.5 microtubules מ&quot;ג כותרת דלילות עם 22 fluorophore האורגני הבהיר. ריכוז תווית היעד הוא fluorophore 1 לכל מיקרומטר של microtubule, או צפיפות תיוג של כ 1 fluorophore ל1500 הדימרים טובולין. אחסן בטמפרטורת חדר, אור שמוגן באלומיניום, נייר כסף לתקופה של עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר 21 ביוטין-kinesin בכ 1 מיקרומטר. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב5 aliquots μl לשימוש בניסויים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ assay (א.ב.) של imidiazole 50 מ&quot;מימ, אשלגן כלורי mM 50 (KCl), 4 מגנזיום כלוריד מ&quot;מ (MgCl 2), אתילן גליקול 2 מ&quot;מ tetraacetic החומצה (EGTA), 6.7 pH. מסנן וסטרילי חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס biotinylated שור אלבומין (ביוטין-BSA) עד 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2.חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס streptavidin (SA) עד 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב20 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס α-קזאין עד 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס dithiothreitol (DTT) במי deionized ב 200 מ&quot;מ. חנות ב -20 ° C ב100 aliquots μl, השתמש בשעות 8 הפשרה. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס פקליטקסל (PT) בsulfoxide דימתיל HPLC כיתה (DMSO) בשעת 4 מ&quot;מ. חנות ב 10 aliquots μl ב -80 ° C לטווח ארוך, -20 ° C לטווח קצר. יש להשתמש תוך 8 שעות של הפשרה. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר סוכר במי deionized במינון 120 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חנות ב100 aliquots μl ב -20 ° C. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסלפתור אדנוזין טריפוספט (ATP) במי deionized ב150 מ&quot;מ, 7.0 pH. חנות ב 5 aliquots μl ב -80 ° C, השתמש בשעות 8 הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100x מניות חמצן הדחת 25 על ידי המסת 10000 גלוקוז אוקסידאז יחידות ויחידות 156.000 catalase לחיץ assay סך μl 600. צנטריפוגה בקצרה בmicrocentrifuge לגלולה מוצקה; supernatant סינון עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב -80 ° C ב 10 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol> 2. Microtubule הרחיפה Assay, הכנת פתרון באותו יום הכן את הפתרונים ב2.1-2.6 ביום של הניסוי. בעזרת תרגול, פתרונות 2.2-2.6 יכולים להיות מוכנים בזמן שטיפת זרימת תאים. אלא אם נאמר אחרת, לשמור פתרוני מניות על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן AB, 1 מ&quot;ל של חיץ assay עם 10 μl של DTT המניות (AB עם 2 המ&quot;מ DTT). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יו BSA חיץ, 40 &amp; mu; מערבל תערובת ביחס 1:1 של ביוטין-BSA המניות וא.ב.. שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ BSA, ערבוב 645 μl של AB עם 5.5 BSA μl (1 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ SA, ערבוב 57 μl של AB עם מלאי streptavidin μl 3 (0.5 מ&quot;ג / המ&quot;ל streptavidin בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ α-קזאין, ערבוב 200 μl של BSA חיץ, מניית קזאין 50 μl, ו -0.8 μl של 15 מיקרומטר ATP (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​α-קזאין, 0.8 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA, 50 ננומטר-ATP בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה, ערבוב 95 חיץ μl α-קזאין, מניית גלוקוז 2.5 μl, לערבב 1 μl 100x חמצן הדחה, מניית פקליטקסל 1 μl, μl 1 2-mercaptoethanol (βME). הוסף βME תחת מנדף. השתמש במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה בתוך 1 שעה של הכנת זהירות:. ΒME הוא רעיל מאוד וריח נורא. הקפד לפתוח רק במנדף. בקבוק בחנותהיעדר האור, אור מדרדר βME ויכולתו להפחית photobleaching. </li></ol> 3. Assay microtubule הרחיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות על ארבעה נתיבי זרימה בין coverslip 24 x 60 מ&quot;מ והמ&quot;מ coverslip 22 x 22 באמצעות גריז ואקום, extruded ממזרק דרך קצה פיפטה, כspacer. כל נתיב זרימה צריך להיות כ 10 μl בנפח (כרכים באים בקנה המידה בהתאם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 10 μl של חיץ ביו BSA לתוך כל סמטה. דגירת 5 דקות על מנת לאפשר לBSA מעייל משטחי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA μl 15 להסיר חופשי ביוטין-BSA, תוך המשך כדי לחסום את שקופית פני השטח. השתמש Kimwipe או נייר סינון כדי להסיר את החיץ מהצד השני של תא זרימה, להיות בטוח שלא לאפשר לבועות אוויר לצאת דרך חדר הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 15 μl SA-החיץ לתוך כל סמטה. חכה 10 דקות, או עד 2 שעות. Streptavidin יהיה לאגד את המשטח בכריכת ביוטין-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA 15 μl להסיר החופשי SA תוך כדי לחסום את שקופית פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלולים עם 15 חיץ μl α-קזאין. α-קזאין מסייע לחסום נוסף מחייב שאינו ספציפי של kinesin וmicrotubules לזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל kinesin עד 10 ננומטר במאגר α-קזאין ותרחץ כל שביל עם 15 μl של kinesin זה - פתרון α-קזאין. חכה 15 דקות (או עד שעה) לkinesin biotinylated כדי לאגד באופן ספציפי לstreptavidin קרקע המאוגדת. התחומים המוטוריים kinesin יישארו חופשיים microtubules אגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל פקליטקסל ל40 מיקרומטר בטמפרטורת חדר חיץ α-קזאין, ותרחץ כל שביל עם 15 μl של פתרון זה לשטוף את kinesin החופשי ומראש לטעון כל תא זרימה עם פקליטקסל פתרון כדי למנוע מmicrotubules depolymerizing. קר גם depolymerizes microtubules, כדי לוודא שהצעדים הללו מתרחשים בטמפרטורת חדר עם החדר temperatuמחדש פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כותרת fluorescently microtubules 1:100-1:1,000 במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה עם mM ATP 1. שטוף 15 μl לנתיב אחד ולהתבונן בתוך 30 דקות. </li></ol> 4. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב microtubules הגלישה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; מיקרוסקופ מסוגל לפתור fluorophores הבודד כגון התקנת TIRF מסחרית או ביתי לבנות נדרש 26 (איור 2). את microtubules צריך להיות מונע על ידי מנועי kinesin על המצע בכ 0.5 מיקרומטר / s, תלוי בטמפרטורה. אם השדה של הנוף של המיקרוסקופ הוא 50 מיקרומטר, microtubules הבודד צריך להיות גלוי לכ 100 שניות. הגדרת עוצמת תאורה, כך שfluorophores הבודד לא photobleach מהר יותר מ 100 שניות. אם אתם משתמשים בעירור ליזר, הגדרת הספק של כ 3-5 mW היא מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רצפים של תמונות לניתוח. 600 תמונות ב5 הרץ (2 סך הכל דקות) עובד היטב. השתמש ברצפים ארוכים מספיק שmicrotubules חוצה את כל התחום של הנוף. </li></ol> 5. ניתוח נתונים שגרת IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro,</a> מצורפת. שגרה זו מחזירה ערך אורך התמדה מבוסס על כל microtubules הגלישה בתמונה ברצף נתון. כך או להפעיל את השגרה הזאת בכל תמונה ברצף, שינוי פרמטרים בעצימות בהתאם להגדרת מיקרוסקופ המסוימת שלך, או בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר כל fluorophore המצורף microtubule ליצור מסלולי fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את כל המסלולים של fluorophores על microtubule ניתן למסלול microtubule כלל החוזרים עבור כל microtubule בתמונה ברצף (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את זווית משיק לכל נקודה לאורך המסלול (איור 4)ולחשב &lt;cos θ s&gt; במשוואה. 1 על ידי ממוצעים של הקוסינוס של זווית ההבדל עבור כל זוג הנקודות המופרדות של הנתיב באורך (איור 5). מצא את אורך ההתמדה לmicrotubule בודד או קבוצת microtubules ידי &lt;cos ההולם של θ&gt; למשוואה. 1, שקלול נקודתי נתונים הבודדים בכושר על ידי מספר הערכים עצמאיים של cos θ s המשמשים לחישוב ממוצע. </li></ol>

<ol><li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li>
<li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102(2008).</li>
<li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li>
<li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li>
<li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li>
<li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li>
<li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physical+chemistry+b%22%5BJournal%5D)">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li>
<li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li>
<li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Gliding+assays%22+for+motor+proteins%3A+A+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li>
<li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627(2011).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li>
<li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li>
<li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+tensegrity+in+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biomech%22%5BJournal%5D)">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li>
<li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+nanoscience%22%5BJournal%5D)">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li>
<li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li>
<li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li>
<li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li>
<li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+R+%22Physical+biology+of+the+cell%22">Physical biology of the cell</a>. , Garland Science. (2008).</li>
<li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li>
<li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific%2C+high-precision+label+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li>
<li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curve+reconstruction+from+unorganized+points%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+aded+geometric+design%22%5BJournal%5D)">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מדידות אורך התמדה הן אפיון טוב של התכונות המכאניות של biopolymers הבודד. במאמר זה, יש לנו תאר שיטה למדידת אורך ההתמדה של microtubules. כפי שצוין במבוא, שיטה זו היא להרחיב בקלות לבחינת מאפייני microtubule מכאניים במגוון רחב של תנאים פשוט על ידי שינוי את ריאגנטים, הטמפרטורה, או הצמיגות בשלב הסופי של הגלישה assay, 3.9, או על ידי microtubules polymerizing, צעד 1.1, בתנאים שונים. הטכניקה עצם היא מהירה לביצוע. ברגע פתר...

Cytoskeleton, רשת של biopolymers נמצא ברוב התאים האיקריוטים, ממלא תפקיד בארגון סלולרי, תחבורה תאית, ומכניקת תא. המאפיינים המכאניים של biopolymers של cytoskeleton (בעיקר תקטין וmicrotubules) לשחק תפקיד משמעותי בקביעת התכונות המכאניות של התא ככולו 12. מאז שלמה מכניקה סלולרית יכולה לאפיין תאים בריאים וחולים 13,14 ומעורב בתנועתיות סלולריות 15, את התכונות המכאניות של רכיבי cytoskeletal הבסיסיים היו אזור פעיל של מחקר בשני העשורים האחרונים 1. הגמישות (או נוקשות) של biopolymers מאופיין באורך ההתמדה, אורכו של פולימר אשר מתכופף על ידי כ 1 רדיאן תחת תנודות תרמיות בטמפרטורת הסביבה. מספר הטכניקות פותח כדי למדוד אורך התמדה 16, לexampטכניקות פעילות le אשר כרוכות כיפוף הפולימר באמצעות זרימה הידרודינמית, מלכודות אופטיות, או שדות חשמליים 4,17,18, וטכניקות פסיביות אשר מודדות את התנודות של פולימרים חופשיים בפתרון 5,6. המדידות הפעילות, עם זאת, דורשות setups המיוחד כדי ליישם את הכוחות ידועים בסולם מיקרומטר, והמדידות, התנודות חופשיות יכולות להיות מאתגרות בשל דיפוזיה מחוץ למטוס של מוקד מיקרוסקופ בשימוש. במאמר זה, אנו מתארים, טכניקה משלימה, פסיבית כדי למדוד את אורך ההתמדה של microtubules, פולימר cytoskeletal. הטכניקה כוללת מבחני דאייה, אשר להבטיח כי הפולימר נשאר תמיד במישור המוקד של 19. יתר על כן, זה כרוך fluorophores מעקב הבודד מחובר באופן קבוע לפולימר של ריבית, כך שמקומות מסוימים לאורך הפולימר מאופיינים היטב. קריקטורה של השיטה מוצגת בFigurדואר 1. Kinesin נע במיוחד לקראת הסוף + של microtubules, כך microtubules בassay גלישה הם מונעים unidirectionally. הסוף המוביל של microtubule, מעבר kinesin האחרון צורף, הוא חופשי להשתנות תחת כוחות התרמיות של הפתרון שמסביב. כmicrotubule מונע קדימה, הסוף משתנה עד קשירת מולקולה חדשה kinesin המשך שקופית הזכוכית קופא בתנודות נתונות. בגלל kinesin מייחס microtubules חזק מאוד, microtubule מוגבל ללכת בדרך של הסוף המוביל. לכן, התנודות הסטטיסטיות שקפאו למסלול microtubule זהות לתנודות הסטטיסטיות של הקצה החופשי של 11 microtubules, ולכן יכולות לשמש כדי לחשב את אורך ההתמדה פי 20 <img alt="משוואה 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srג = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; איפה אני p הוא אורך ההתמדה של microtubule, θ s היא הזווית בין משיקים למסלול המופרד באורך של קו מתאר, ו&lt;&gt; מסמן ממוצע לאורך כל הזוגות של עמדות המופרדות באורך של קווי מתאר. Assay הגלישה עוצמה משתמש biotinylated kinesin ב21-הסליל מפותל קשורים באופן ספציפי לשקופית הזכוכית באמצעות הצמדת streptavidin-ביוטין. התקשרות זו מבטיחה כי התחומים המוטוריים חופשיים להיקשר ולהניע microtubules. על מנת לעקוב אחר מסלולי microtubule, microtubules מתויגים דלילות עם fluorophores אורגני 22,23 - התוויות חייבות להיות דלילות מספיק שfluorophores היחיד הם פתיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדה. fluorophores היחיד נמצאים במעקב באמצעות שגרת ניתוח תמונה נכתבה בIDL. המסלולים שכל fluorophore חייבים מיקרופון ניתןrotubule משולבים לתוך מסלול microtubule מורכב באופן אוטומטי 24. זוויות θ לכל נקודה לאורך מסלול המשיקות מחושבות; מזוויות משיקות אלה &lt;cosθ של&gt; הערך מחושב לכל אורכו של קו מתאר. לבסוף, נתונים אלה מתאימים למשוואה. 1 כדי לחלץ אורך התמדה לmicrotubule נתון, או לmicrotubules רב באותו assay הדאייה. השיטה היא חזקה מספיק כדי לעבוד עם microtubules הוכן במגוון רחב של מצבים (עם סוכנים שונים מייצבים או מולקולות קטנות אחרות מאוגדים לmicrotubule, עם חלבונים מאוגדים microtubule קשור (מפות), או עם מגוון רחב של פתרונות צמיגים). במעבדה שלנו, הטכניקה נעשתה שימוש כדי לאפיין את אורך ההתמדה של microtubules כפונקציה של אורך לאורך microtubules וmicrotubules עם סוכני מייצבים שונים. המגבלה העיקרית היא שmicrotubules חייב עדיין שלתנועתיות upport kinesin. מאז kinesin הוא אנזים מנוע חזק, זוהי מגבלה די רופפת. על ידי החלפת microtubules עם אקטין וkinesin עם משפחת אנזים מיוזין, אורך ההתמדה של אקטין יכול להימדד באותה הטכניקה.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; ריאגנטים</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazole</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אשלגן כלורי</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מגנזיום כלוריד</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinylated BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-קזאין</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidin</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dithiothreitol</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פקליטקסל</td&gt;<td&gt; מעבדות LC</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז אוקסידאז</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalase</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ה-ATP</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoethanol</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; רעיל. קנה כמות קטנה.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 מ&quot;מ מס &#39;1 1/2 כוס כיסוי</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 מ&quot;מ מספר 1 מכסה זכוכית</td&gt;<td&gt; זהב חותם</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גריז ואקום גבוה</td&gt;<td&gt; דאו-קורנינג</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; ציוד</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מיקרוסקופ TIRF</td&gt;<td&gt; רב</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; מיקרוסקופ TIRF השתמש בשיטה זו היה התוצרת בית.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (תוכנה)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; יכול להחליף MATLAB, ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה אחרת.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

מדידות קשיחות כפיפה של biopolymers שימוש במבחני דאייה

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules הם פולימרי cytoskeletal אשר ממלאים תפקיד בחלוקת תאים, מכניקה של תאים, ותחבורה תאית. כל אחת מהפונקציות הללו דורש microtubules שנוקשים וישר מספיק כדי להקיף חלק משמעותי של קוטר התא. כתוצאה מכך, אורך microtubule התמדה, מידה של נוקשות, נחקר באופן פעיל בשני העשורים האחרונים 1. עם זאת, נותרו שאלות פתוחות: microtubules הקצר הם 10-50 פעמים פחות נוקשה מאשר microtubules הארוך 2-4, ואפילו microtubules הארוך מדד אורכי התמדה המשתנים על פי סדר הגודל 5-9. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת אורך התמדת microtubule. השיטה מבוססת על בדיקת גלישת microtubule kinesin מונחה 10. על ידי שילוב של ניאון תיוג דליל של microtubules הבודד עם מעקב אחת של חלקיק הבודד fluorophores המצורף לmicrotubule, glidinמסלולי G של microtubules הבודד מתבצעים מעקב בדייקנות ננומטר ברמה. אורך ההתמדה של המסלולים הוא זהה לאורך ההתמדה של microtubule בתנאים המשמשים 11. שגרת מעקב אוטומטית משמשת ליצירת מסלולי microtubule מfluorophores המצורף לmicrotubules הבודד, ואורך ההתמדה של מסלול זה מחושב באמצעות רוטינות שנכתבו בIDL. טכניקה זו היא מהירות ישימה, ומסוגל למדוד את אורך ההתמדה של 100 microtubules ביום אחד מניסויים. השיטה ניתן להאריך למדידת אורך התמדה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל אורך התמדה כפונקציה של אורך יחד microtubules. יתר על כן, את שגרת הניתוח משמשת יכולה להיות מורחבת למבחני שרירן מבוסס משחק גלישה, כדי למדוד את אורך ההתמדה של סיבי יקטין גם כן.

תמונת מצב מבדיקת גלישה מוצגת באיור 2. צפיפות microtubule טובה היא microtubules 1-10 לשדה הראייה; משמעותי יותר יגרום mistracking כmicrotubules חוצים זה את זה. עלילה של מסלולי 11 microtubule מבדיקת הגלישה באיור 2 מוצגת באיור 3. מסלולים אופייניים הם ארוכים 10-30 מיקרומטר; כמה מסלולים יש פערים בי microtubule 1 חוצה אחר. מסלולים אלו יכולים להיות מושלכים מניתוח. מסלול ...

שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במבחן גלישה כדי למדוד את קשיחות ה-UAL של מיקרו-צינורות. זה מושג על ידי חיבור ספציפי של החלבון המוטורי קינזין לשקופית מיקרוסקופ עם תחומים מוטוריים חופשיים לקשירת מיקרו-צינורות. השלב השני הוא להוסיף לדגימה מיקרו-צינורות עם תווית פלואורסצנטית, המתורגמים על ידי הקינזין.הסרטונים הבאים של מיקרו-צינורות גולשים נאספים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השלב האחרון הוא ניתוח סרטוני בדיקת הגלישה כדי לחשב את קשיחות כיפוף המיקרו צינורית. בסופו של דבר, מבחני הגלישה משמשים לקביעת קשיחות הכיפוף של מיקרו-צינורות בודדים.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מכניקת השלד התא, כגון קשיחות הכיפוף של פולימרים ציטו-שלד בודדים. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אנה רטליף, סטודנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מאגר הבדיקה העובד על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 200 מילי-מול DIO שלושה אטול או DTT למיליליטר אחד של תמיסת מאגר הבדיקה וערבב.שמור את זה ואת כל פתרונות העבודה האחרים בטמפרטורת החדר במהלך ההליך. לאחר מכן, באמצעות מאגר הבדיקה העובד, הכינו 40 מיקרוליטר של מאגר BSA ביוטין על ידי שילוב אלבומין סרום בקר מסונן ביוטיני סטרילי בשני מיליגרם למיליליטר עם מאגר הבדיקה העובד ביחס של אחד לאחד וערבוב התמיסה. לאחר מכן הכינו את מאגר ה-BSA על ידי שילוב של 645 מיקרוליטר של מא

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

העמידות של פולימרים וחומרים מרוכבים פולימרים מחוזקים בסיבים בשירות היא היבט קריטי לעיצובים ולתחזוקה מבוססת מצב. אנו מציגים פלטפורמת בדיקות מעבדה חדשה בעלות נמוכה לחקירת ההשפעה של עומסים מכניים וסביבתיים במקביל, ועשויים לסייע בתכנון מבנים מרוכבים יעילים יותר אך בטוחים יותר.

בדיקת פלטפורמה לעמידות ללימודים של פולימרים ומחוזקים בסיבים פולימריים מרוכבים תחת גירויים במקביל Hygrothermo-מכאניים

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

המתודולוגיה רומן מוצגת לסנתז ואלסטומרים נוזליים-גבישים עיקרי שרשרת התכנית באמצעות מונומרים מתחילים זמינים מסחרי. מגוון רחב של נכסים טרמומכני היה מותאם על ידי התאמת כמות crosslinker, תוך ביצועי actuation היו תלויים בכמות של מאמץ ליישם במהלך תכנות.

סינתזה של אלסטומרים נוזליים-גבישים לתכנות ראשי-שרשרת באמצעות תגובת תיאול-acrylate שני שלבים

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

אנו מציגים פרוטוקול לביצוע בדיקות כיפוף 3 נקודות על מילימטר סולם סיבים באמצעות בדיקה מכנית לפי הזמנה. המכשיר יכול למדוד כוחות שנעו בין µN 20 עד 10 N, ולכן יכול להכיל מגוון של גדלי סיבים.

מילימטר סולם Flexural בדיקות מערכת למדידת התכונות המכאניות של הספוג הימי Spicules

מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג'ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield

טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את 'חסימת העורקים' של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.

. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

למרות שנוקשות המטריקס החוץ-תאית (ECM) היא רגולטור מרכזי להתנהגות התא, מנגנוני החישה והטרנסדוקציה הבסיסיים נותרו לא ברורים. כדי להתמודד עם זה, אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת סובסטרטים מבוססי פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מכוונת, כדי לקדם את הבנתנו את הקשר בין תא ל-ECM.

יצירת תת-מטריצות חוץ-תאיות פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מוגדרת ליישומים בביולוגיה תאית

למדו כיצד למדוד את הקשיחות הכפיפה של מיקרוטובולים באמצעות מבחן דאייה מונע קינזין. שיטה זו מאפשרת לקבוע את אורך ההתמדה של מיקרוטובולים בודדים ולהבין את מכניקת השלד התאי.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

גלה סרטונים נוספים