אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

מטרת הליך זה היא לדמות את ממשק רקמת המוח השלם סביב מכשירי מיקרו מושתלים כרוניים ברקמת מוח של מכרסמים. זה מושג על ידי שימוש ראשון באלסטומר סיליקון מהיר ואקריליק דנטלי דו-חלקי כדי לכסות את הגולגולת וליצור כובע גולגולת סביב המכשיר המושתל במוח. לאחר החדרת החיה לעיבוד רקמות קיבוע ולאחר המוות, החלק המושתל במוח של המכשיר מופרד ממכסה הראש על ידי שריפת האקריליק הדנטלי וחיתוך התא המהיר.

לאחר מכן, המוח מוסר ונחתך עם ויום כדי ללכוד את השתל בקטע רקמה. השלב האחרון הוא הכנת הרקמה להדמיה פלואורסצנטית על ידי שטיפת תיוג, ולאחר מכן ניקוי קטע הרקמה בתמיסת ניקוי אופטית. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת כדי להראות את התגובה הביולוגית השלמה ששתל המוח החודר מייצר ברקמה הסובבת בקנה מידה תת-תאי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הסברה, המכשיר, הוא שהטכניקה נמנעת משיבוש הרקמה המקיפה והיצמדות למכשיר המושתל כך שניתן יהיה לבחון את רקמת הממשק שלמה. שיטה זו מסתמכת על טכניקות אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה מתקדמות ומביאה לנתוני מיקרוסקופיה קונפוקלית המתארים בפירוט את האזור המקיף מכשיר מושתל במוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התותבות העצביות, כגון המידה שבה מוות תאי מקומי, היווצרות צלקות גליה וארגון מחדש של כלי הדם משפיעים באמת על אורך החיים של מכשירי מיקרו-אלקטרודות מושתלים במוח.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הממשק העצבי הכרוני של מערכי מיקרו אלקטרודות מושתלים במוח. ניתן ליישם את הטכניקות הכרוכות בשיטה זו גם בתחומים אחרים של מחקר מדעי המוח, כולל צינוריות מושתלות או סיבים אופטיים במכסה אדים, התחל את ההליך על ידי הסרה זהירה של העור ורקמות אחרות סביב מכסה הגולגולת האקרילי, באמצעות מלקחיים ומספריים קטנים תוך לבישת כפפות לא רגישות לחום. השתמש במגהץ חייל כדי לייצר חלון באקריליק השקע ולחשוף אזור של איטום מהיר בסיסי.

המכשיר צריך להיות גלוי עטוף בחותם המהיר השקוף. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ כירורגי, חתכו לתוך אלסטומר הסיליקון בעזרת מספריים מיקרו מעוקלים. לאחר מכן הסר חתיכות קטנות של איטום מהיר בעזרת פינצטה ומספריים מיקרו עד למצב בו המכשיר נכנס למוח.

המשך לחתוך לאורך פני השטח של הגולגולת כדי להפריד את רכיבי המכשיר המחוברים לפוליסיליקון והגולגולת מהרכיבים המושתלים במוח. היזהר בעת חיתוך דרך רכיבי המכשיר החשופים. הימנע מדחיפה או גרירה של השתלים ברקמה הקבועה.

לאחר מכן הסר את העצם סביב כובע הראש בזהירות באמצעות ה-shes הגולמי לאחר מכן. השתמש במרית כדי להפריד את המוח עם המכשיר המושתל מהגולגולת. כעת הניחו את המוח בצלחת פטרי מזכוכית מלאה ב-HBHS.

השתמש בבלוק המוח ובסכיני גילוח כדי לחתוך את המוח וליצור מישור שטוח התואם באופן הדוק לזווית המכשירים המושתלים. לאחר מכן, לחץ על שני סכיני גילוח דרך רקמת המוח וחשוף את המשטח השטוח שיותקן על הוויברם. לאחר מכן, הניחו מעט קרח מתחת לפלטפורמת Vibram.

לאחר מכן יבש בקצרה את משטח הטישו על מגבת נייר. לאחר מכן, כוון את הדגימה כך שהממד הרחב ביותר יהיה מקביל לכיוון התנועה של להב הטון הרוטט כדי למנוע מהלהב להפיל את הרקמה מיד להדביק את המישור השטוח לבמה עם דבק סופר. לאחר שהדבק מניח PBS צונן לצלחת הוויברטו סביב הרקמה.

כעת חותכים את פרוסות הרקמה בין 250 ל-500 מיקרון באמצעות קצב הרטט המרבי וקצב התקדמות להב איטי עם זווית להב של 10 מעלות מהאופקי. לאחר מכן אוספים פרוסות בזהירות בעזרת מברשת וגורפים מרית ומאחסנים HBHS בצלחת 24 באר בארבע מעלות צלזיוס תוך איסוף פרוסות, שומרים תיעוד של העובי והמיקום של כל פרוסה כשהן מוסרות לצלחת 24 הבארות. לאחר שמכשיר ה-Insitu נראה, אסוף פרוסת רקמה בעובי של כ-500 מיקרון.

על מנת ללכוד את המכשיר בפרוסת רקמה בודדת כדי לאסוף קטע רקמה דק יותר, ניתן לאסוף בזהירות פרוסות של 100 מיקרון כדי להתקרב מקרוב למכשיר. בשלב זה ניתן לאסוף פרוסה בעובי של פחות מ -500 מיקרון עם המכשיר בפנים. התחל בעיבוד רקמות על ידי שטיפת הפרוסות שלוש פעמים בחמש דקות לכל שטיפה ב-HBHS.

לאחר מכן דגרו אותם בנתרן בורה הידריד למשך 15 דקות. כל צד של הפרוסה הופך לאט את הפרוסה באמצעות מברשת צבע קטנה והימנע מלגעת באזורים סביב המכשיר המושתל. ניתן להשתמש גם בכף מיקרו מצופה נירוסטה או טפלון יחד עם המברשת הקטנה.

כעת יש לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים בחמש דקות לכל שטיפה בתמיסת כביסה בטמפרטורת החדר. חסום אותם בתמיסת כביסה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי הפיכת הפרוסות. לאחר שעה לאחר שעתיים, יש לדגור את הפרוסות בנוגדנים ראשוניים למשך כ-48 שעות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בצע שש שטיפות מהירות של שלוש דקות עם תמיסת כביסה. לאחר מכן בצע שש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה. לאחר מכן, דגרו אותם בנוגדנים משניים למשך כ-48 שעות בארבע מעלות צלזיוס.

שוב, בצעו שש שטיפות מהירות של שלוש דקות ולאחר מכן שש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה. לאחר מכן, הסר את תמיסת הכביסה והוסף את תמיסת ניקוי אבנית U2 המבוססת על גליצרול. מכסים את הצלחת בנייר כסף ושומרים בארבע מעלות צלזיוס.

הניחו לפרוסות העבות להתנקות כשבוע או קטעי רקמה עבים מאוד למשך שבועיים-שלושה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הפינוי, הרכיבו את חלקי הרקמה על שקופיות באמצעות תמיסת ניקוי כאמצעי הרכבה. אטמו את כל השקופיות עם לק שקוף ואחסנו אותן במרחק של ארבע מעלות צלזיוס מהאור, תוך שימוש במטרות מיקרוסקופ למרחק עבודה ארוך יותר.

התחל בהדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר או שני מיקרוסקופ פוטונים. נדגים עם תוכנת שליחה XS L SM 7 10 Carl Xi ושלב תרגום XY מבוקר מחשב לתמונה פנורמה תלת מימדית סביב שתל לתיקון מקדם השבירה של תמיסת הניקוי. בהדגמה זו, אנו מזינים ערך מקדם שבירה של 1.4 בתוכנת המיקרוסקופ Leica Zen עבור פתרון הסליקה U2.

הגדרה זו מתאימה בעדינות מרווחי צעד Z כדי להסביר את אי ההתאמה של מקדם השבירה ברקמה הסמוכה להתקן. הערך באופן גס את חלון ציר Z המתאים והגדרות איסוף נתונים בממד zdi עבור כל ערוץ פלואורסצנטי באמצעות הספק לייזר נמוך, כ-0.5% עד 5% וגדלי צעד Z גדולים. לאחר מכן השתמש בתוכנת פנורמה Zen כדי להגדיר את המטרה במרכז ה-XY של הפנורמה הסופית וכדי לקבוע את מספר מיקומי האיסוף הנדרשים עבור ציר x ו-y.

כדי לכסות את אזור העניין שלך, הערך מחדש וסיים את חלון האוסף של ציר Z על ידי בדיקה מהירה של המסגרת הראשונה והאחרונה של הערימה. לאחר מכן, הגדר ידנית את רגישות הגלאי ואת עוצמת הלייזר לרמפה כראוי עם העומק המוגבר. המטרה היא בדרך כלל לשמור על אותה עוצמת תמונה ללא קשר לעומק ההדמיה לתוך פרוסת הרקמה, וגם להימנע מרעשי רקע גבוהים.

אסוף כל סדרת נתוני תמונות פלואורסצנטיות במידת הצורך כדי למנוע אותות חופפים, הפעל קווי לייזר ברצף. שנה את הגדרות התוכנה כדי לאסוף את הנתונים או את נתוני השידור והשתמש בלייזר באורך גל חודרני יותר, כגון 6 33 ננומטר כדי ללכוד ערוצים אלה. לאחר מכן קבע את עוצמת הלייזר המתאימה וזהה רגישות לאיסוף השתקפות והעברה וחזור על אותה סדרת איסוף סביב המכשיר המושתל.

לבסוף, ייצא את הנתונים לעיבוד מאוחר יותר, כימות וניתוח. הדמיה דרך שני צידי השקופית יכולה לאפשר לך להעריך את הממשק סביב מכשיר כפי שמוצג כאן כאשר מיקרוגליה לאורך גב הסיליקון של MEA נראית מצד אחד ומיקרוגליה לאורך אתרי אלקטרודות ועקבות נראים בצד השני. לאחר שניתן לדמות רקמה מותקנת באמצעות שלב תרגום XY, ניתן ליצור סקירה כללית של התוויות הפלואורסצנטיות על פני כל פרוסת הרקמה ברזולוציה הרצויה.

כאן, גרעיני תאים מוכתמים בקרסים 3, 3, 3, 4 2 ומונוציטים microglia מסומנים ב-3 2 9. אחד נגד רשות השידור צולם בו זמנית בערוצים נפרדים. כמו כן נאספו אור שידור והחזר המראים את מיקום השתל בן ארבעת השבועות ביחס לווים ונתוני IVA one, שכבת העל של כל הערוצים, אך השידור מוצג כאן.

ניתן לאסוף בדיקה מפורטת של ממשק הרקמה השמור מורפולוגית סביב מכשירי מיקרו מושתלים בהגדלה גבוהה לניתוח תגובת הרקמה המקומית, ההחזר וההעברה מאפשרים לוקליזציה של המכשיר בעוד נוגדנים פלואורסצנטיים או תוויות כימיות מאפשרים הדמיה מפורטת של רכיבי הרקמה לאורך ממשק הרקמה השלם. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור באמת להקדיש זמן להפרדה זהירה של המכשירים המושתלים דרך מכסה הראש ולתכנן ששלב זה ייקח למעלה מ-30 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף ולעבד פרוסות מוח המכילות מכשירים מושתלים.

אתה אמור גם להיות מסוגל לתייג ולאסוף נתונים היסטולוגיים המתארים את הנוירוביולוגיה סביב מכשירים אלה.