מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

פרוטוקול זה מייצר קומפלקסים מיוצבים קוולנטית של פפטידים טרנסממברניים למחקרים מבניים שמטרתם להבין כיצד חלבוני ממברנה מתקשרים זה עם זה באמצעות התחומים המשובצים בשומנים שלהם. ראשית, בטא חלבון היתוך מתויג hist המכיל את הרצף הטרנסממברני המעניין באי קולי. לאחר מכן חלץ את החלבון משבר גוף ההכללה באמצעות גינס וחומר ניקוי באמצעות מטריצת זיקה ניקל.

רכז את חלבון ההיתוך המתויג hist ודי סולפיד קשר אותו לצורה הדיאמטרית על ידי שטיפת העמודה בתמיסה המכילה חומרים מחמצנים. לאחר מכן, יש להוציא את חלבון ההיתוך המקושר בחומצה אצטית Tri Fluor ולטפל בציאנוגן ברומיד כדי לשחרר את שותף ההיתוך להמשיך לבודד את תוצר הפפטיד המקושר מתערובת העיכול על ידי HPLC שלב הפוך. בסופו של דבר, הזהות והטוהר של המוצרים מאומתים על ידי ניתוחי דף SDS וספקטרומטריית מסה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמתחמים סוציומטריים טהורים מיוצרים למחקרים מבניים באמצעות טכניקות כמו תמיסה או תמ"ג במצב מוצק. גם כאשר ידוע ששני תחומים טרנסממברניים מקיימים אינטראקציה, מסיסות פפטידים והיווצרות מורכבת הם לעתים קרובות מנוגדים בתנאי ניסוי. התחלה עם קומפלקס מוגדר היטב מיוצב קוולנטי יכולה להרחיב משמעותית את מגוון תנאי הניסוי שניתן לבדוק לאיסוף נתונים באיכות גבוהה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להתמודד עם הקושי לטפל בשברי החלבון ההידרופוביים הללו. פרוטוקול זה והעצות הניתנות בכתב היד הנלווה נועדו לספק פתרון פשוט לכמה מהאתגרים הנפוצים ביותר בתהליך החיזוי והטיהור. חיך, תרבית של ליטר אחד של חיידקים המבטאת את היתוך הפפטיד הטריפ ומשעה מחדש ב-50 מיליליטר של מאגר ליזה.

לאחר מכן בצע שלושה מחזורי סוניקציה בתפוקה מקסימלית למשך דקה אחת והתקרר על קרח במשך חמש דקות. קצרו את חומר גוף ההכללה הבלתי מסיס על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20, 000 גרם למשך 15 דקות והניחו בצד את הסופרנטנט. ניתן לחזור על שלבי הסוניקציה והצנטריפוגה אם נדרש טוהר משופר של שבר ה-IB.

שמור דגימות של הגלולה והחומר העליון לניתוח דף SDS כדי לאשר את הנסיעה. לוקליזציה של היתוך TM לגופי הכללה ממיסה כעת את כדורי גוף ההכללה בתמיסת גינס באמצעות בין 25 ל-50 מיליליטר לליטר תרבית. מעובד: יש לערבב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות עם חשיפה מדי פעם.

לאחר מכן, נקה את ליזאט גוף ההכללה על ידי צנטריפוגה ב 75, 000 עד 100, 000 פעמים G למשך שעה. בטמפרטורת החדר, סנן את הסופרנט דרך ממברנה של 0.2 מיקרון בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שלב את ליזאט גוף ההכללה המנוקה עם שרף זיקה ניקל שאוזן לתמיסת גינה לקשירת אצווה.

מערבבים את התרחיף בעדינות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. טען את מתלה שרף הניקל ליזאט של גוף ההכללה לתוך עמוד זרימת כבידה ריק עם תמיכת מיטה נקבובית עד שכל הנפח יזרום דרכו. אסוף והניח בצד את הזרימה שדרכה עשויה עדיין להכיל חלבון היתוך לא קשור.

לאחר מכן שטפו את שרף הניקל בכוח הכבידה. זרימה עם חמישה נפחי מיטה של תמיסת אוריאה המכילה חמישה מילי-מולרי קרן מרקפטואתנול. בצע שטיפה שנייה ללא קרן מרקפטואתנול לכביסה השלישית.

השתמש בתמיסת אוריאה בתוספת נחושת גופרתית וגלוטתיון מחומצן. לאחר מכן סגור את יציאת העמוד ודגר 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות מקסימלית של קשר די גופרתי. שוטפים את תמיסת האוריאה המחמצנת עם 10 נפחי מיטה של מים.

לאחר מכן החל קו ואקום לייבוש מיטת העמודים ולסגור את שקע העמודים. כעת במכסה מנוע בטיחות כימי, הוסיפו 1.5 נפחי מיטה של TFA מסודר, ערבבו את שרף הניקל בעזרת מרית קטנה כדי להבטיח חשיפה אחידה לחומצה ודגרו למשך חמש דקות. אסוף את החומצה לשחרר בעדינות עם חברת תעופה דחוסה במידת הצורך כדי לדחוף החוצה את כל הנוזל.

חזור על שלב דילול החומצה עם עוד 1.5 נפחי מיטה של TFA מסודר כדי למדוד את תפוקת החלבון, בצע דילול של ה-TFA EIT באתנול טרי פלואורו ומדוד את הספיגה ב-280 ננומטר כנגד A-T-F-A-T-E. מדללים את החומצה elu ל-80% ריכוז TFA סופי על ידי טיפה. הוספת מים תוך ערבוב עדין.

אם אתה מזרז טפסים, הוסף בחזרה כמות קטנה של TFA עד שהפתרון יתבהר. לאחר מכן תקן ל 80% עם מים. שמור דגימת עיכול מראש של חמישה מיקרוליטר לניתוח דפי SDS והקפיא אותה מיד בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, שקלו גבישי ציאנוגן ברומיד עבור כ-0.2 גרם למיליליטר דגימה. הקפדה על שקילת הכימיקל הרעיל בבטחה. מוסיפים את הציאנוגן ברומיד לדגימה בקולט אדים ומערבבים בעדינות עד להמסה מלאה.

כעת שטפו את כלי התגובה בתוך אטם הגז האינרטי ודגרו במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור. שמור דגימת עיכול פוסט של חמישה מיקרוליטר לניתוח דפי SDS, הקפאה מיד בחנקן נוזלי וליופיליזציה יחד עם דגימת העיכול המקדים. לאחר מכן העבירו את תגובת העיכול לקלטת דיאליזה תאית מחודשת, המאפשרת עלייה משמעותית בנפח.

דיאליזה של הדגימה למשך הלילה כנגד ארבעה ליטר מים במכסה המנוע הנשי הכימי. למחרת בבוקר, הסר את תמיסת התגובה הדיאליזה עם משקעי חלבון מרחפים מקלטת הדיאליזה והעביר את התרחיף לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן הקפיאו וליופיליזציה של הדגימה למשך מספר ימים כדי להסיר את המים וכל עקבות של ציאנוגן, ברומיד ו-TFA ממיסים עד 100 מיליגרם של מוצרי עיכול ליופיליזציה לשלושה מיליליטר של ערבוב מסודר של חומצה פורמית עד שהתמיסה מתנקה לחלוטין.

טען את הדגימה על עמודת zoax SB 300 C3 בקנה מידה מכין בזרימה של ממס A באמצעות לולאת דגימה של חמישה מיליליטר. לאחר מכן יש להוציא את תוצרי העיכול בשיפוע של ממס B, על פני חמישה נפחי עמודות לפחות. נתח את שברי ה-HPLC לפי דף SDS וספקטרומטריית מסה MALDI TOF כדי לזהות את המינים המעניינים ולאשר את הליופיליזציה המסה הצפויה שלו.

שברי HPLC המכילים את תוצר הפפטיד הצולב. אם המוצר מתייבש לסרט ולא לאבקה, ניתן להמיס אותו מחדש בנפח קטן של HFIP קפוא בנוזל וליופיליזציה. שוב, התוצאה תהיה חרוט לבן רך שניתן להטות ולשקול בקלות רצף DNA המקודד את האזורים הטרנסממברניים והדגלים של מולקולת האיתות הטרנסממברנית של הקולטן החיסוני.

DAP 12 שובט לתוך וקטור הפפטיד PMM באמצעות אתרי הגבלה הינדיים שלוש ו-BAM H one. מבנה הביטוי החיידקי שנוצר מייצר חלבון היתוך טריפ מתויג עם שאריות מתיונין וציסטין פנימיות ייחודיות למחשוף ציאנוגן ברומיד וקישור צולב חמצוני. רמת הביטוי המושגת עבור היתוך טריפ משתנה בהתאם לרצף חומצות האמינו של הפפטיד המצורף.

תכשיר זה הניב כ-120 מיליגרם של חלבון היתוך טהור שלם מליטר אחד של תרבית וארבעה מיליליטר של מטריצת ניקל. לאחר ליזיס תאים, חלבון ההיתוך היה ממוקם בכדור גוף ההכללה. כ-70% מהיתוך ה-DAP 12 TM המטוהר בניקל היה דיסולפיד מקושר לצורת DME.

למרות שתוצרי הפפטיד DAP 12 TM אינם ניתנים לזיהוי בקלות בדגימות העיכול הכוללות של CYANOGEN bromide, השוואה של רצועות האיחוי השלמות ושברי הטריפ בדגימת העיכול המופחת מצביעה על כך שהעיכול של האיחוי היה שלם בכ-60% בהפרדה טיפוסית זו של תוצרי העיכול. בעמודת C3 בקנה מידה הכנה באמצעות HPLC פאזה הפוכה, המוצרים הקשורים נרמזו בשיפוע דו-שלבי של ממס B.תוצר הפפטיד הצולב של דיס סולפיד ניתן לזיהוי בניתוח דף SDS של שברי ה-HPLC העיקריים בתנאים שאינם מפחיתים ומפחיתים. ניתוח ספקטרומטריית מסה מאלדי טוף מאשר את זהותו של פפטיד הדם בשיא הרביעי עם התוצר העיקרי ב-6729.2 דלטון.

אל תשכח שעבודה עם ציאנוגן ברומיד, ממיסים אורגניים וחומצות מרוכזות עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש להצטייד בציוד מגן מתאים בעת ביצוע הליכים אלה ולעולם אין לטפל בציאנוגן ברומיד מחוץ למכסה המנוע הכימי המאושר. טכניקה זו סיפקה את חומר המחקר העיקרי לשלושה מבני תמיסה שונים של קומפלקסים של פפטידים טרנסממברניים המדגימים כיצד קולטנים חיסוניים מרובי תת-יחידות מורכבים באמצעות אינטראקציות חלבון בתוך קרום הלימפוציטים.

אנו מאמינים שהיישום של טכניקה זו יוכיח את עצמו כבעל ערך שווה עבור מערכות חלבון ממברנות אחרות.