תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה melanogaster

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסמן נוירונים בודדים במערכת העצבים המרכזית של עוברי דרוזופילה בשלב מוקדם 17. זה מושג על ידי איסוף ביצים ומתן אפשרות להן להתפתח לשלב הנכון. השלב השני של ההליך הוא כלור ידני ויישור הביצים.

בעקבות דיווה זו, קולוניזציה ותיוק של העוברים הופכים את חוט העצב לנגיש. השלב האחרון הוא לתייג תאים בודדים על ידי יישום Iono retic של עין למות ליפופילית. בסופו של דבר, התוצאות מאפשרות הדמיה של מורפולוגיה של נוירון בודד אם רוצים בהקשר של דפוסי ביטוי GFP ידועים או ברקע מוטנטי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות תיוג תאים בודדות קיימות כמו markum הוא שהיא פועלת בעובר ומאפשרת לדמיין תאים מזוהים בכוונה. הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה ביותר מכיוון ששלבים רבים עדינים ולכן קשים ללמידה. אפשר לזבובים בריאים להטיל עוברים על צלחות אגר.

החלף את הצלחת כל שעה וחצי בחום של 25 מעלות צלזיוס ושמור על העוברים. דגרו את העוברים על הצלחות שלהם בטמפרטורה של 25 או 18 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הנדרש. כשהוא מוכן, העבירו את העוברים לשקופית מכוסה בסרט דביק דו צדדי.

הימנע מהעברת אגר כלשהו עם העוברים מכיוון שהוא יפריע להדבקתם לסרט. בקלטת. הניחו לעוברים להתייבש במשך חמש עד 10 דקות בזמן ההמתנה.

מצפים פתק כיסוי בגודל 24 מילימטר על 60 מילימטר בדבק הפטן. הניחו טיפת דבק קטנה במרכז השקופית ופזרו אותה לסרט דק מאוד בעזרת פתק כיסוי מרובע של 18 מילימטר. לאחר שהעוברים התייבשו, גע בהם בעדינות עם מחט.

הקוריון ייפתח והעובר יידבק למחט. העבירו מיד את העוברים נטולי הכלור לגוש אגר כדי למנוע את התייבשותם. יישר אותם שם 10 ברצף, צדי הגחון כלפי מעלה.

חותכים את עודפי האגר מהבלוק בעזרת אזמל. לאחר מכן גע בעדינות בעוברים עם החלקת הכיסוי המצופה דבק הפטן. עליהם להיצמד להחלקת הכיסוי עם צידי הגחון כלפי מטה.

מרחו מסגרת של סרט דבק סביב החלקה של הכיסוי והצמידו אותה לשקופית מיקרוסקופ. שמירה על העוברים על גבי החלקת הכיסוי. כסו את העוברים בכמויות נדיבות של PBS בצד הגבי של כל עובר ליד הקצה האחורי שלו.

חודרים לקרום הוויטל בעזרת מחט זכוכית, קורעים את הממברנה לאורך קו האמצע הגבי וגוררים את העובר החוצה מהקרום. כעת כוון מחדש את הצד הגחוני של העובר כלפי מטה במקום אחר על מצע דבק הפטן. תייק את העובר עם מחט זכוכית על ידי ניקוב עדין של דופן הגוף וקריעה לאורך קו האמצע הגבי.

בעזרת המחט, לחץ כלפי מטה על דופן הגוף כך שיידבק למגלשה. קרעו את המעי בקצוות הקדמיים והאחוריים שלו, והרימו את המעיים. מכיוון שמספר עוברים יהיו מתויקים באותה שקופית, כדאי להיות מדויקים מאוד עם הכיוון שלהם או לצייר את הכיוון שלהם.

לאחר מכן, ניתן לקבע את העוברים קלות למשך 10 עד 15 דקות בפורמלדהיד 7.4% ב-PBS ולאחר מכן ארבע שטיפות ב-PBS תוך שימוש בזהירות רבה כדי להימנע מנגיעה בעוברים לפני השטח של התמיסה. כוחות מתח הפנים יהרסו אותם תחת מטרה של פי 10. מרכז את שדה הראייה על עובר מוכן, הגדל את ההגדלה ואתר את התא המעניין תחת אופטיקה DIC או תחת פלואורסצנטיות.

אם תא המטרה מבטא GFP, ודא שדיאפרגמת השדה של המיקרוסקופ פתוחה רק לקצה שדה הראייה, ולא מעבר לתאורה צרה. קרן תסייע במיקום המיקרו פיפטה בחזרה למטרה של 10 x ותמקם את אלקטרודת האמבטיה עבור מגבר ה-DC לתוך התמיסה הרחק מהעובר ומנתיב המיקרו פיפטה. התקן את המיקרו פיפט ההזרקה המלא בתמיסת ליתיום כלוריד למחזיק והצמד אותו למניפולטור המיקרו

באמצעות בקרות הקורס מקם את המיקרופיפט מתחת למטרה והרבה מעל העובר. אם הזווית של המיקרו פפה תלולה מדי, הקצה לא ייכנס לפוקוס. אם הוא רדוד מדי, הפיר יתנגש בקיר האמבטיה במרכז הקצה בשדה הראייה.

כעת הורד את המיקרו פיפטה והתמקד לסירוגין עד שהפיפטה נמצאת ב-PBS ולא רחוק מדי מעל העובר. כעת שנה למטרה בעוצמה גבוהה ומרכז את הפיפטה בתוך שדה הראייה. כאשר הפיר נמצא בפוקוס, הזז את המיקרו פיפטה בציר X עד שקצהו נמצא במרכז שדה הראייה.

קצה המיקרו פיפטה צריך להיות הרבה מעל מפלס העובר. עבור לתאורת פלואורסצנטיות ובדוק את הקצה. בדוק אם יש דליפה של עין הצבע.

כוונן את זרם ה-DC כך שגביש עין הצבע לא יצטבר בקצה. כעת הורד את המיקרו פיפט בציר Z לכיוון העובר. התאמת המיקוד בהדרגה כאשר העובר נכנס לפוקוס.

עבור לשימוש בשליטה העדינה. מקדו את התא שיוזרק במרכז השדה ולאחר מכן התמקדו מחדש בקצה המיקרו-פיפטה. מנקודה זו ואילך, ייתכן שיהיה נוח יותר להשתמש בבקרת הבמה של המיקרוסקופ כדי להזיז את העובר ביחס למיקרו-פיפטה.

הבא את קצה המיקרו פיפט למגע עם התא ועשה שקע על פני השטח שלו. העבירו מספר ננו אמפר של זרם דה-פולריזציה למשך מספר שניות. גביש קטן של עין צבע ייווצר על התא כדי לאשר שהתא סומן.

פתח לזמן קצר את התריס כדי להאיר את השדה באור פלורסנט. אם גוף התא מראה סימני תיוג, הפעל זרם למשך מספר שניות נוספות. לאחר מכן כבה את הזרם ומשוך במהירות את העובר הרחק מהמיקרו פיפטה באמצעות פקדי הבמה.

אם לא ניכר סימון עין D, ייתכן שהמיקרו פיפטה נסתמה ויש להחליפה. אם קצה הפיפטה נתקע ברקמות אחרות בשורש התא ומכתים את הרקמה הזו, נסה למשוך מעט את המיקרו פיפט ולהתקרב שוב לתא לפני שתפנה להחלפת המיקרו פיפטה לפי הצורך. המשך לתייג תאים אחרים באותו עובר או בעוברים אחרים באותה שקופית.

הזז את הקצה לקצה שדה הראייה וחזור על ההליך. הסר את רוב התמיסה בתא ההזרקה. לאחר מכן תקן את העוברים על ידי הוספת 7.4% פורמלדהיד PBS למשך 10 דקות, ולאחר מכן ארבע שטיפות עם PBS.

כעת ניתן להמיר את התכשיר או להרכיב אותו למיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות הפרוטוקול המתואר. נוירון בין מלא דאי הומר ללא רבב תחת אופטיקה של DIC. ההקשר המרחבי של התא המסומן בתוך הרקמה שמסביב הלא מסומנת נפתר היטב.

לדוגמה, ניתן לראות את מיקומי גוף התא בתוך קליפת המוח ושל הקרנת הסיבים בתוך הגלולה הנוירולוגית בתכשיר זה. טיפת הצבע הייתה קצת גדולה מדי. מספר תאים שכנים סומנו בו זמנית, מה שמקשה על קישור הקרנות בודדות לגופי תאים נפרדים.

שימו לב גם שתחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, רזולוציית הרקע נמוכה בהרבה ללא המרת תמונה. ניתן גם להזריק בתכשיר זה תאים מרובים במקטעים סמוכים, נוגדן נגד שני כתמים מהירים של פאלס בגלולת הנוירו. למרות גופי התאים השקופים, התכשיר מראה תופעת לוואי אפשרית של תקופות המרת תמונות ממושכות.

התאים המסומנים בעוצמה רבה יותר נוטים להיות מוכתמים ולהתחיל להתנפח בהשוואה לתיוג תא בודד באופטיקה קונפוקלית. תיוג עין צבע בעוברים הנושאים מבנים מדווחים של GFP יכול לספק הקשר מרחבי וזהות של התא המלא D בתוך אוכלוסיות ספציפיות של סוגי תאי עצב או גליה חיוביים GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין ולבצע תיוג של נוירונים בודדים במערכת העצבים העוברית לאחר oph.

אבל בזמן שאתה מנסה את ההליך הזה, אנא זכור שכל שלב הוא תובעני, אז צפה לכמה חזרות עד שכל ההליך יתנהל בצורה חלקה.