Name: זיהוי יפהפה נרדם הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למד לזהות אונקוגנים וגנים מדכאי גידולים בדגם עכברים באמצעות PCR מקשר. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנהלי גידולים גנטיים חדשים באמצעות Sleeping Beauty transposon.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לMoriarity Branden, הדוד Largaespada, ווינסנט Keng באוניברסיטת מינסוטה, והאדם Dupuy באוניברסיטה איווה על סיועם בפיתוח הפרוטוקול שתואר לעיל.

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

המחברים אין לי מה לחשוף.

מסך קדימה גנטי באמצעות המערכה היפיפייה הנרדמת transposon מספק שיטה לזיהוי מוטציות הגורמת לסרטן. על ידי בחירת האמרגן המתאים לשלוט Cre recombinase בנוסף לכל מוטציות predisposing, מסך SB יזהה ידוע וגנים סרטניים מועמד חדש. ההצלחה של מסך SB היא תלויה במידה רבה את העכברים שנבחרו ליצירת המסך. לtransposon, מומלץ להשתמש בשני זנים שונים של עכברים שנשאו concatamer של transposons אונקוגניות על כרומוזומים שו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> לשכת אינדוקציה-חותם בטוח </td><td> מוח מדעי עץ </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Buffered פורמלין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> פתרון רטיבות חלבון </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ תמוגה תא </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE המאגר </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute 96 גם צלחות </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> סעפת אבק QIAvac 96 </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-microplate Genie, 120V </td><td> תעשיות מדע, בע&quot;מ </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> ligase DNA T4 עם מאגר הקשירה 5x </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs 25mm </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Taq פלטינום </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> DNA פולימראז תקי FastStart </td><td> רוש </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE המאגר </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE המאגר </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium רומיד </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות transposon בגידולים מוצקים באמצעות pcr לינקר בתיווך

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

ניתוח גנומי, proteomic, transcriptomic, וepigenomic של גידולים אנושיים מצביע על כך שיש אלף חריגות בתוך כל הגנום סרטן בהשוואה לרקמות מתאימות. בהתבסס על ניתוחים אלו ניתן לראות כי יש הרבה נהגים גנטיים ידועים של הסרטן 1. למרבה צער הנהגים האלה חבויים בתוך מספר גדול בהרבה של אנומליות נוסע בגנום שלא תורם באופן ישיר להיווצרות גידול. היבט נוסף של הגנום של הסרטן הוא שקיימת הטרוגניות גנטית ניכרה בתוך סוגי גידולים דומים. כל גידול יכול נמל מוטציות שונות המעניקות יתרון סלקטיבי להיווצרות גידול 2. ביצוע מסך גנטי קדימה משוחד בעכברים מספק את הכלים ליצירת גידולים ולנתח ההרכב הגנטי שלהם, תוך הפחתת רקע המוטציות נוסעות. היפיפייה נרדמת המערכת (SB) transposon היא שיטה אחת כזאת 3. המערכת מנצלת SB הנייד vectors (transposons) שניתן להוסיף לאורך הגנום על ידי אנזים transposase. מוטציות מוגבלות לסוג תא מסוים באמצעות שימוש באלל transposase המותנה שמופעל על ידי Cre recombinase. קווי עכבר רבים קיימים שrecombinase המפורש Cre ברקמות ספציפיות. על ידי חצייה אחד מהקווים הללו לאלל transposase המותנה (למשל קס-stop-קס-SB11), מערכת SB מופעלת רק בתאים שמבטאים Cre recombinase. Cre recombinase יהיה בלו קלטת תחנה שחוסמת ביטוי של אלל transposase, הפעלת mutagenesis transposon בתוך סוג התא המיועד לכך. מסך SB הוא שיזם רביית שלושה זנים של עכברים מהונדסים כך שעכברי הניסוי לשאת אלל מותנה transposase, concatamer של transposons, ואלל recombinase Cre רקמות ספציפיות. עכברים אלה אפשרו לגיל ועד צורת גידולים והם הופכים גוססים. העכברים הם אזהדנ&quot;א הגנומי necropsied ומבודד מהגידולים. בשלב הבא, הדנ&quot;א הגנומי נתונת המקשר בתיווך-PCR (LM-PCR) כי תוצאות בהגברה של לוקוסים הגנומי המכילים SB transposon. LM-PCR בוצע על גידול חד יגרום למאה amplicons השונה המייצג את מאה לוקוסים הגנומי המכילים הוספות transposon ב4 גידול יחידים. הוספות transposon בכל הגידולים מנותחות ואתרי החדרה נפוצים (CISS) מזוהים באמצעות שיטה סטטיסטית מתאימה 5. הגנים בתוך חבר העמים הם סבירים מאוד להיות אונקוגנים או גני מדכאי סרטן, והם נחשבים לגנים סרטניים מועמד. היתרונות של שימוש במערכת SB לזיהוי גנים סרטניים מועמדים הם: 1) transposon יכול בקלות להיות ממוקם בגנום בגלל הרצף שלו ידוע, 2) טרנספוזיציה יכולה להיות מופנה לכמעט כל סוג תא ו3) transposon מסוגל מציג גם רווח והפסד מוטציות-of-פונקצית 6. Following הפרוטוקול מתאר כיצד לתכנן ולהוציא לפועל מסך קדימה גנטי באמצעות מערכת transposon SB לזיהוי גנים סרטניים מועמד (איור 1).

לאחר תכנית הרבייה כבר נקבע, מגדלים צריכים לייצר המלטה כל 19-21 ימים. גודל המלטה משתנה בין 5 ל 12 גורים, בהתאם לגילו של המגדלים והרקע הגנטי. בנוסף, ודא שהגנוטיפ של ההמלטה כדלקמן גנטיקה המנדלית כדרך לאשר כי תכנית הרבייה היא גם נכונה ומוצלחת. לניסוי כמוצלח, שכיחות גידולים בחיות הניסוי צריכה להיות גבוהה משמעותי מגידול בשכיחות פקד החיים. אם לא מוטציה &quot;predisposing&quot; נכללה בניסוי צריך להיות כמה שאין גידולים בפ...

שיטה של ​​זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה משתמשת<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; Transposon כmutagen אקראי המכוונת לרקמות ספציפיות. מיפוי הגנום של הוספות transposon המניעות את היווצרות גידול מזהה אונקוגנים רומן וגני מדכאי סרטן

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

הליך זה מראה כיצד לזהות אונקוגנים חדשים וגנים מדכאי גידול על ידי מיפוי טרנספוזיציות על החדרות בעכבר המניעות את היווצרות הגידול. זה מושג על ידי יצירה וקצירת גידולים ממודל העכבר הטרנסגני. השלבים הבאים של ההליך הם לבודד את ה-DNA של הגידול, לבצע PCR בתיווך מקשר, ואז לרצף את דגימות ה-DNA המוגברות ולנתח את הטרנספוזיציה בהחדרות.בסופו של דבר, ההליך מזהה גנים מועמדים למניעי גידול. היתרון העיקרי בשימוש ב-PCR בתיווך קישור בשילוב עם סקר גנטי בלתי מוטה באמצעות טרנספוזונים של היופי הנרדם הוא שאנו יכולים לזהות בקלות גורמים גנטיים חדשים לסרטן. התחל תמיד את הדיסקציה על ידי ריסוס החלק החיצוני של העכבר שהוקרב באתנול 70%.יש לחלק את הרקמות והגידולים שנאספו לארבעה חלקים, בגודל של 50 עד 100 מיליגרם. תקן קטע אחד בפורמין 10% חוצץ למשך 18 שעות, ואחריו 70% אתנול. ניתן להשתמש בסעיף זה לצביעה של h ו-e ו/או אימונוהיסטוכימיה.הצמד להקפיא את החלקים הנותרים בחנקן נוזלי. ניתן לאחסן אותם במקפיא ולהשתמש בהם לבידוד D-N-A-R-N-A וחלבון לאיסוף DNA מדגימת גידול קפואה. ראשית טוחנים דק את הרקמה בעזרת סכין גילוח.לאחר מכן, עכל את הרקמה בצינור של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של מאגר ליזיס תאים, וחמישה מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר. תמיסת פרוטאז K מערבלת את התערובת ביסודיות וממשיכה במיצוי DNA סטנדרטי מבוסס איזופרופנול. התחל

identification-sleeping-beauty-transposon-insertions-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל ורב-תכליתי להשראה, ניטור וניתוח גליובלסטומה חדשה (GBM) באמצעות DNA טרנספוזון המוזרק לחדרים של עכברים יילודים. תאים של האזור התת-חדרי, התופסים את הפלסמיד, הופכים, מתרבים ומייצרים גידולים בעלי מאפיינים היסטו-פתולוגיים של GBM אנושי.

Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ&quot;א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

מאמר זה מתאר מבנה פשוט המבוסס על ה-PCR כדי לנטר את הפעילות של כריכת שורות פעילה של קו 1 וכדי למפות דה נובו בגנום נתון. באמצעות קו התא MCF7, אנו מדגימים בזאת כיצד ניתן להחיל שיטה זו כדי לזהות פעילות של קו -1 ממוקם ב 22q 12.1.

זיהוי הפעילות הרטרוטרנספוזיציה של קו חם-1s באמצעות PCR הופכי למרחקים ארוכים

עבודה זו מוגדרות מראש פרוטוקול מתקדם כדי להעריך במדויק את טעינת הגידול על ידי זיהוי של חלבון פלורסנט ירוק אותות biלומינסנציה, כמו גם שילוב של טכניקת גילוי מולקולרי כמותי.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.

מידול גידולי מוח in vivo באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצג חתימות מוטציה של מטופל

למד לזהות אונקוגנים וגנים מדכאי גידולים בדגם עכברים באמצעות PCR מקשר. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנהלי גידולים גנטיים חדשים באמצעות Sleeping Beauty transposon.

זיהוי

גלה סרטונים נוספים