זיהוי יפהפה נרדם הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

הליך זה מראה כיצד לזהות אונקוגנים חדשים וגנים מדכאי גידול על ידי מיפוי טרנספוזיציות על החדרות בעכבר המניעות את היווצרות הגידול. זה מושג על ידי יצירה וקצירת גידולים ממודל העכבר הטרנסגני. השלבים הבאים של ההליך הם לבודד את ה-DNA של הגידול, לבצע PCR בתיווך מקשר, ואז לרצף את דגימות ה-DNA המוגברות ולנתח את הטרנספוזיציה בהחדרות.

בסופו של דבר, ההליך מזהה גנים מועמדים למניעי גידול. היתרון העיקרי בשימוש ב-PCR בתיווך קישור בשילוב עם סקר גנטי בלתי מוטה באמצעות טרנספוזונים של היופי הנרדם הוא שאנו יכולים לזהות בקלות גורמים גנטיים חדשים לסרטן. התחל תמיד את הדיסקציה על ידי ריסוס החלק החיצוני של העכבר שהוקרב באתנול 70%.

יש לחלק את הרקמות והגידולים שנאספו לארבעה חלקים, בגודל של 50 עד 100 מיליגרם. תקן קטע אחד בפורמין 10% חוצץ למשך 18 שעות, ואחריו 70% אתנול. ניתן להשתמש בסעיף זה לצביעה של h ו-e ו/או אימונוהיסטוכימיה.

הצמד להקפיא את החלקים הנותרים בחנקן נוזלי. ניתן לאחסן אותם במקפיא ולהשתמש בהם לבידוד D-N-A-R-N-A וחלבון לאיסוף DNA מדגימת גידול קפואה. ראשית טוחנים דק את הרקמה בעזרת סכין גילוח.

לאחר מכן, עכל את הרקמה בצינור של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של מאגר ליזיס תאים, וחמישה מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר. תמיסת פרוטאז K מערבלת את התערובת ביסודיות וממשיכה במיצוי DNA סטנדרטי מבוסס איזופרופנול. התחל פרוטוקול זה על ידי חישול המקשרים בשפופרת של 1.5 מיליליטר.

מערבבים 50 מיקרוליטר מכל תמיסת קישור עם שני מיקרוליטר נתרן כלורי מרוכז. לאחר מכן הנח את הצינור בגוש חום של 95 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, כבו את האש ותנו לו להתקרר לאט לטמפרטורת החדר, מה שיכול לקחת שעה או יותר לאחר הקירור.

ניתן לאחסן את המקשרים האנאליים במקפיא עד הצורך. הכן 2 צלחות באר 96 על ידי עלי תוך ציטוט מיקרוגרם אחד של DNA מכל דגימה לבארות מתאימות בשתי צלחות הבאר 96. לדוגמה, הנח מיקרוגרם אחד של DNA מדגימה אחת בבאר A אחת משתי לוחות הבאר.

ה-DNA באחת מ-96 לוחות הבארות יתעכל באמצעות האנזים הימני NLA 3 ויעכל את דגימות ה-DNA בצלחת 96 הבארות האחרות באמצעות האנזים השמאלי BFA. אפשר ל-DNA להתעכל למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, סיים את העיכול בחום, והשבית את האנזימים למשך 20 דקות.

כעת נקו את תגובות העיכול באמצעות צלחת באר מיני שלל 96. בעזרת הפיפטה הרב-ערוצית, העבירו כל דגימה לשלל המיני. צלחת באר 96.

מניחים את צלחת השלל המיני 96 באר בסעפת ואקום. מרחו ואקום על הצלחת עד שהבארות נראות יבשות. בדרך כלל, 15 דקות לאורך פרוטוקול זה.

יש לנקוט בזהירות רבה כדי לא לזהם את הדגימות שלך. כאשר עובדים עם 96, צלחות באר שומרות על בארות מכוסות בכובעים ככל האפשר והימנעו מלהעביר את הפיפטה שלך מעל בארות פתוחות מכיוון שכל טיפה של נוזל לא רצוי עלולה להרוס את הדגימה. הסר את צלחת השלל המיני מסעפת הוואקום וחסום את תחתית הצלחת במגבת נייר עד לייבוש מלא.

השעו מחדש את ה-DNA במיני שלל. צלחת באר 96 על ידי הוספת 30 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים לכל אחד. ובכן, הניחו את צלחת השלל המיני על שייקר אורביטלי המכוון לגובה למשך שתי דקות.

לאחר מכן, העבירו את תכולת צלחת השלל המיני לצלחת נקייה של 96 בארות. כדי לבצע את תגובות קשירת המקשר. הכן את תגובת הקשירה על ידי ערבוב כמות מספקת של מאגר קשירה, מקשר כרוע משלב 3.2 T ארבעה DNA ליגאז ומים במאגר ריאגנטים.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטר של DNA מעוכל מהשלב הקודם לצלחת חדשה של 96 בארות. לאחר מכן השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי Eloqua 10 מיקרוליטר של תגובת הקשירה לכל הבארות של צלחת 96 הבאר. אחרי הכל, הבארות היו עמוסות ב-DNA וריאגנטים לקשירה.

דגרו על הצלחת למשך ארבע שעות עד לילה בחום של 16 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר. סיים את הקשירה על ידי השבתת ה-T four Ligase ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

כמו קודם, נקו את תגובת הקשירה באמצעות צלחות שלל מיני וסעפת ואקום לייבוש הצלחת ולאחר מכן כתם את תחתית הצלחת עד שהיא יבשה לחלוטין. השעו מחדש את ה-DNA ב-30 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. מניחים על שייקר אורביטלי למשך שתי דקות ולאחר מכן מעבירים את תכולת צלחת השלל המיני לצלחת נקייה.

לאחר מכן, בצע עיכול DNA שני עם bam H אחד כדי להשמיד את הטרנספוזונים הנותרים. עכל את ה-DNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד שש שעות או לילה, ולאחר מכן מנקים את העיכול באמצעות צלחות שלל מיני לפי אותו הליך כמו קודם. בצע PCR של 30 מחזורים באמצעות פריימר ספציפי לטרנספוזיציה ופריימר ספציפי למקשר.

התגובה צריכה להכיל שלושה מיקרוליטרים של ה- DNA המעוכל עם מקשרים. לאחר מכן, נקה את תגובת ה-PCR באמצעות מיני שלל. 96 צלחות באר וסעפת ואקום כפי שבוצע בעבר.

השעו מחדש את ה-DNA ב-30 מיקרוליטר מים והעבירו את המתלים ל-96 נקי. המשך משוחק היטב על ידי דילול שני מיקרוליטרים של תוצרי תגובת ה-PCR ל-148 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים תוך שימוש בשני מיקרוליטרים בלבד של המוצרים המדוללים. בצע 30 מחזורי PCR באמצעות גרסאות מקוננות של הפריימרים בנפחים של 100 מיקרוליטר.

פריימרים אלה מיועדים למכונת Illumina GA two X. לכל דגימה יהיה ברקוד ייחודי של 12 זוגות בסיסים מריצת ה-PCR, 45 מיקרוליטר מכל מוצר על ג'ל 1% עם AUM ברומיד. צריכה להיות מריחה של מוצרי PCR המייצגים אמפליקונים של החדרות טרנספוזונים רבות ושונות בגידול.

השתמש בשיטת שטיפת הוואקום שתוארה קודם לכן כדי לנקות את 50 המיקרוליטרים הנותרים של PCR, ולאחר מכן השהה מחדש את ה-DNA ב-50 מיקרוליטר מים ובצע שוב את שטיפת הוואקום. עכשיו Resus, השעו את ה- DNA ב -30 מיקרוליטר TE והעבירו אותו לצלחת נקייה של 96 בארות. קבע את ריכוז ה-DNA בכל דגימה.

לאחר מכן שלב כמויות שוות של DNA מכל דגימה בצינור יחיד. ניתן לרצף כמה מאות דגימות DNA בנתיב יחיד של ריצת Illumina כל עוד כל דגימה נוצרה באמצעות פריימר ברקוד מובהק באמצעות הפרוטוקול. L-M-P-C-R מוצלח אמור להגביר מאות טרנספוזיציות בהחדרות בגידול בודד לאחר הפעלת מחצית מתוצר ה-PCR המשני על ג'ל של 1%, מריחה של DNA מייצגת הגברה זו.

אם LM PCR לא יצליח, יהיה היעדר מריחה של DNA. במקום זאת, תראה רצועות סופיות של DNA המרצפות 1 עד 200 גידולים בנתיב יחיד של פלטפורמת Illumina GA two X אמורה לייצר למעלה מ -30 מיליון רצפים של 100 זוגות בסיסים כל אחד תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לעבוד לאט ובזהירות כדי להבטיח שלא יתרחש זיהום לאחר הליך זה.

ניתן לבצע ניתוח של הגורמים הגנטיים שהתגלו לאחרונה לסרטן על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, איזה מהגורמים הללו יכול להיות ממוקד לטיפול?