Name: הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: למד להקים תרבות נוזלית מקוטבת של תאי אפיתל קלו-3 באמצעות מערכת Transwell. השיטה כוללת מדידת TEER ובדיקת פלואורסצין לבחינת שלמות המחסום האפיתליאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לאליזבת Blanchard לקבלת הסיוע הטכני שלה. הממצאים והמסקנות בדו&quot;ח זה הם של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

<ol><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+airway+epithelial+cells+%28calu-3%29%3A+a+model+of+human+respiratory+function%2C+structure%2C+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+research+and+practice%22%5BJournal%5D)">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li>
<li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li>
<li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li>
<li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li>
<li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li>
<li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+%28PADDOCC%29+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e%22%5BJournal%5D)">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li>
<li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+research%3A+PTR%22%5BJournal%5D)">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li>
<li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li>
<li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li>
<li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li>
<li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+nutritional+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+%28SARS%29+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729(2010).</li>
<li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947(2012).</li>
<li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li>
<li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized%2C+specific+to+ciliated+cells%2C+and+without+obvious+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li>
<li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li>
<li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כאשר הקמת Calu-3 LCC במוסיף Transwell, תאים לא יכולים לקטב בכלל, או לא יכולים לקטב באופן מלא, כפי שהוגדרו על ידי TEER ≥ Ω 1000 × 2 סנטימטר ו≤ 1% איזון צבע נתרן fluorescein בין תאי apical וbasolateral. בנוסף, Calu 3 תאים בLCC יכולים לקטב באופן מלא, אך עשויה להיות לא עקבי TEER בין מדידות. למרות תנודות במדידות TEER של Calu-3 LCC הן נורמליות מיום ליום, נדנדות פעם מקוטבות באופן מלא, דרמטיות בTEER לא צפויות עד שהתרבות באופן טבעי יורדת עם גיל, שיכול להיות קטן כמו 5 שבועות או כל עוד 12 שבועות לאחר זריעה. היכולת של Calu-3 LCC לקטב תלויה בחלקו על אופן בו תאים נשמרים וsubcultured לפני השימוש במערכת Transwell. תאים שצמחו מעבר למפגש 90% כmonolayer במהלך subculturing, כי כבר subcultured יותר מ 10 פעמים מהמניות קפוא, או שלא תהיהen מסופק עם מדיום טרי על לוח זמנים קבוע נוטה פחות לקטב באופן מלא, וכל קיטוב צפוי לרדת במהירות. חוסר חלקי או מלאה של קיטוב גם ניתן לייחס לשינויים בחומר והגודל נקבובי של Transwells משמש לCalu-3 LCC, ושונות הרבה להרבה בTranswells של הרכב דומה וגודל נקבובי עשויות להשפיע גם על קיטוב. נקבוביים בגדלים גדולים יותר יכולים לאפשר Calu-3 לצמוח דרך קרום Transwell לתוך תא basolateral, מניעת התרבות מקיטוב. העדר הקיטוב יכול להיות גם בשל התפתחות חיידקים, שצוין על ידי תרבות בינונית מעורפלת, מה שמוביל להתמוטטות הבאה של צומת ההדוקים בין 3 Calu תאים. מדידות TEER משתנות של Calu-3 LCC עלולות להיגרם על ידי הפרעות מכאניות של monolayers Calu -3 LCC התא, מוסיף, או את הצלחות בעצמם. שינויים בינוניים ומדידות TEER צריכים להתבצע בלי עצות פיפטה או אלקטרודה מובילה לגעת בתאים. בעת ביצוע פעולות אלה, יש להקפיד להימנע מהחדרת בועות אוויר אל תאי apical וbasolateral, אשר משבשים את היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות. היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות בתרבות שהיא למעשה מקוטב יכולה גם מוגבלת על ידי הצטברות חלבון על מוביל אלקטרודות. למעלה לבנות זה עשוי להסיר עם משייף עדין, או ניתן לתקן על ידי החלפת אלקטרודה. ברגע Calu-3 LCC לקטב לחלוטין וTEER כבר לא עולה, Calu-3 LCC מוכן לשימוש כמודל במבחנה לאפיון תגובות תא אפיתל ריאה מארחת לזיהום בדרך נשימה. מערכת זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תגובות כיוונית לפתוגנים השוואה לשורות תאי ריאת monolayer-תרבית משמשות באופן מסורתי כדי ללמוד פתוגנים בדרכי נשימה, כגון A549-2 והפ תאים, עם יתרונות הנוספים של Calu-3 LCC being מהיר יותר לפיתוח, המתקבל בקלות רבה יותר, ופחות יקר להפקה מאשר NHBE הראשוני, מקוטב, מובחן. בדומה לNHBE, מקוטב Calu-3 להפגין היווצרות צומת הדוקה, ולייצר mucins. עם זאת, בניגוד לNHBE, Calu-3 תאים מקוטבים אינם מבחין לתוך שכבות של תאי בסיס ותאי אפיתל ריסי columnar, וCalu-3 כמה תאים מקוטבים לפתח תחזיות ריסים כמו 19. כך, למרות ששימושי לבחינת תגובות מקוטבות של תאי האפיתל בדרכי אוויר לנשימת עלבון, Calu-3 המקוטבים LCC הוא לא מודל אידיאלי לבדיקת פיתוח דרכי נשימה או שיפוץ בתגובה לעלבון או פגיעה בדרכי נשימה. ייצור ריר על ידי תאים בתרבית במבחנה עשוי להשפיע infectivity סלולרי, כמו גם שחרורו של וירוס מדבק והתפשטות וירוס במודל מקוטב, והשוואה ישירה בין ייצור הריר Calu-3 המקוטבים LCC וNHBE מקוטב, בדיל לא דווח . A549 ו- 2 תאים HEPמחדש קל יותר לתרבות מאשר-3 Calu תאים, עם זאת, שלא כמו Calu-3 LCC, הם לא יוצרים תרבויות מקוטבות כאשר גדלו במוסיף Transwell, ובכך מהווים מודל אידיאלי לבדיקה לא במבחנה את התגובות של תאי האפיתל מקוטבים לזיהום וירוס בדרך נשימה .

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין 0.05% - 0.02% EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> הבינוני החיוני המינימאלי של הנשר (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> חום להשבית, 56 ° C, 30 דקות </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות 100x (10 מ&quot;מ) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> חנות ב 4 ° C בחושך </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> תוספת EMEM עם FBS חום מומת עד 10% בסרום, עקר מסנן </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + תוספים (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> תוספת EMEM לריכוזים סופיים: FBS חום מומת, 20%; 1X חומצות אמינו; 2 L-גלוטמין מ&quot;מ; 10 HEPES מ&quot;מ; עקר מסנן </td></tr><tr><td> צלחות Transwell 24 גם </td><td> קורנינג שחקן משנה </td><td> 3472 </td><td> 3 גודל נקבובי מיקרומטר, פוליאסטר </td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמא </td><td> E7023 </td><td> הכן ל 70% באמצעות DH 2 O סטרילי </td></tr><tr><td> PBS של Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ ללא ניאון </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO 4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 מ&quot;מ 3 NaHCO במים סטריליים; עקר מסנן </td></tr><tr><td> fluorescein נתרן </td><td> סיגמא </td><td> 6377 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בחיץ סטרילי שאינו ניאון; עקר מסנן, להגן מפני אור; חנות ב 4 ° C עד 6 חודשים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 האלקטרודה </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA צלחת קורא </td><td></td><td></td><td> מסוגל למדוד 486 או 490 </td></tr></tbody></table>

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של airway האנושי המקוטב-3 calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

משטחי apical וbasolateral של תאי האפיתל של דרך נשימה להפגין תגובות כיוונית לחשיפת הפתוגן בגוף חי. לפיכך, אידיאלי במודלים חוץ גופייה לבחינת תגובות תאיות לפתוגנים נשימה לקטב, ויצר משטחי apical וbasolateral. מודל אחד כזה הוא מובחן תאים נורמלים אדם סימפונות אפיתל (NHBE). עם זאת, מערכת זו דורשת דגימות רקמת ריאה, מומחיות ובידוד תאי האפיתל culturing מרקמות, וזמן כדי ליצור תרבות ממשק אוויר נוזלית. -3 Calu תאים, הנגזרים מאדנוקרצינומה סימפונות אנושיות, הם מודל חלופי לבחינת התגובה של תאי האפיתל של דרך נשימה הפרוקסימלי לעלבון נשימה 1, תרכובות תרופתיות 2-6, ו7-9 חיידקים ופתוגנים נגיפיים, כוללים וירוס שפעת, rhinovirus ותסמונת חמורה נשימתית חריפה - המשויכת קורונה 10-14. לאחרונה, Wהדואר הוכיח ש- 3 Calu תאים רגישים לוירוס בדרך נשימת סינסיציאלי (RSV) זיהום באופן עקבי עם NHBE 15,16. הנה, אנחנו פירוט הקמת התרבות המקוטבת, נוזל מכוסה (LCC) של-3 Calu תאים, תוך התמקדות בפרטים הטכניים של גידול ו- 3 Calu תאי culturing, שמירה על תאים שתרבית לLCC, ואנו מציגים את שיטה לביצוע זיהום וירוס בדרך נשימה של-3 Calu תאים מקוטבים. עקביות להשיג Calu-3 מקוטב LCC, Calu-3 תאים יש subcultured בקפידה לפני culturing במוסיף Transwell. Calu 3-תרבויות monolayer צריכות להישאר מתחת למפגש 90%, יש subcultured פחות מ 10 פעמים ממניות קפוא, וצריכים להיות מסופקות באופן סדיר עם מדיום חדש. תרבית לאחר בTranswells, Calu-3 LCC חייב להיות מטופל בזהירות. שינויים בתקשורת לא סדירים והגבלה מכאנית או פיזית של שכבות תאים או צלחות להשפיע לרעה על קיטוב עבורכמה שעות או ימים. קיטוב הוא פיקוח על ידי הערכת התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER) ומאומת על ידי הערכת האיזון הפסיבי של fluorescein נתרן בין תאי apical וbasolateral 17,18. המישורים לאחר TEER או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר, Calu-3 LCC מוכנים להשתמש כדי לבחון תגובות תאיות לפתוגנים בדרכי נשימה.

כשגדל כתרבויות נוזליות מכוסות (LCC) במערכות תרבות Transwell, כפי שמודגם באיור 1,-3 Calu תאים לקטב, פיתוח משטחי apical וbasolateral מובחנים. בעקבות שיטה המתוארת כאן, התנגדות החוצה אפיתל החשמלית (TEER) של Calu-3 LCC מגיעה לרמה או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר תוך 3 שבועות לאחר זריעה, דוגמה שמוצגת באיור 2. צומת ההדוקים שנוצרו בין תאים מקוטבים למנוע איזון פסיבי של מולקולות קטנות בין תאי apical וbasolateral. לפיכך, בדיקת איזון fluorescein נתרן שונה משמשת כדי לאשר את הקיטוב של Calu-3 LCC 15,17,18. כTEER של Calu-3 monolayers הסלולרי בעליות LCC, כמות שfluorescein פסיבי equilibrates לתוך תא basolateral פוחתת. ברגע TEER הוא 1,000 Ω × 2 סנטימטר, כמות fluorescein שequilibrates ב<html> לתא basolateral הוא ≤ 1%, כפי שמוצגים באיור 3, ולכן Calu-3 LCC נחשבים למקוטב באופן מלא כאשר TEER הוא ≥ Ω 1000 × 2 סנטימטר. מדידת TEER השיא של Calu-3 LCC עשויה להשתנות מניסוי לניסוי. עם זאת, ברגע שרמת ערכי TEER לכל ניסוי נתון, מקוטב באופן מלא, אינו נגוע Calu-3 LCC עשוי להיות יציב במשך 5 עד 12 שבועות לאחר זריעה. העדר פיתוח התנגדות בTranswell-מתורבתים Calu-3 עשוי להיגרם על ידי מספר גורמים כמפורטים בטבלה 1. רגע TEER מישורי Calu-3 LCC או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר, המודל מוכן לשמש לבדיקה תגובות נשימת אפיתל תאים לפתוגנים בדרכי נשימה, כולל וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV). חשיפה לתוצאות RSV בירידה מהירה יותר בשלמות התרבות מקוטבת בהשוואה לזיהום מדומה של תאים (איור 4). = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג חתך של תאי Transwell-תרבית. תאים גדלים על משטח הפסגה של הקרום להוסיף. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> איור 2. התפתחות של עמידות טרנס אפיתל החשמלי (TEER) וקיטוב של Calu-3 תאים לאחר זריעה במוסיפה Transwell. בכל נקודת זמן, TEER מוצגת כΩ x סנטימטר חציון 2 ± SEM של 32 בארות עצמאיות מניסוי נציג אחד. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> איור 3. הפסיבי equili<html> bration של fluorescein נתרן לתוך תא basolateral של Calu-3 monolayers הסלולרי מעוכב כתאים הופכים מקוטבים. נתונים מצטברים מארבעה ניסויים העצמאיים הוא מוצג. כל נקודת נתונים מייצגים מדידה בודדה. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> איור 4. זיהום RSV של Calu-3 LCC המקוטב מאיץ ירידה בשלמות monolayer. Calu-3 תאים מקוטבים היו נגוע בRSV-A2 במשרד פנים = 1 ביום 0, והקוטביות הייתה פיקוח במשך 8 שבועות לאחר הדבקה. ניסוי נציג אחד מוצג. נתונים מוצגים כהתנגדות ממוצעת של 8 בארות עצמאיות לזיהום ± SEM כל נקודת זמן. * P &lt;0.05 בין תרבויות חיקוי ו- A2 הנגועות-RSV, כפי שנקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. דרכים &quot;&gt; <tbody><tr><td> גיליון </td><td> רזולוציה (ים) </td></tr><tr><td> התנגדות אינה מדידה </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות אוויר בבארות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו שתאים אינם גדלו על הפלסטיק הרבה מתחת להוסיף (המציין כי תאים עשויים שגדלו דרך הנקבובי של ההוספה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעבור 2-3 שבועות לאחר זריעה לפיתוח התנגדות מלא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הרכב והגודל נקבובי של מוסיף משמש, לשנות במידת צורך (מומלץ להוסיף פוליאסטר, גודל נקבובי 0.3 מיקרומטר, ללא ציפויים, ראה חומרים לפרטים נוספים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, והחלפה במידת צורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו בינוני להתפתחות חיידקים </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> התנגדות מתפתחת, אבל קיטוב מלא (≥ Ω × 1000 סנטימטר 2) לא הושג </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זמן נוסף לקיטוב לפתח (אולי מדי פעם לקחת עד 4 שבועות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקביות להחליף בינוני בתרבויות Transwell, לסירוגין בין היום הרביעי 3 ואז אחרי ההאכלה הקודמת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות יחידים במוסיף כי ממוקמות את השורות החיצוניות של צלחות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שונים בהרבה ממוסיף Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> תאים לקטב באופן מלא, אבל התנגדות אינה עקבית מקריאה אחד למשנו </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תפגעו או לערום צלחות בחממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תגרום לרעידות בארון הבטיחות הביולוגי תוך Transwell plates מטופלות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות אוויר בבארות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נא לא להפריע את שכבת התא עם טיפי פיפטה כשמשתנית מדיה או ביצוע קריאות TEER </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני μl 200 בתא האפיקלי; עוצמת קול נמוכה יותר עלולה לגרום לקריאות TEER יציבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, ולהחליף במידת צורך </li></ul></td></tr></tbody></table> 1. בעיות טבלת פתרון בעיות, שעשוי להתעורר כאשר 3 Calu תאי culturing בTranswells. גורמים רבים תורמים לקיטוב מלא ב- 3 Calu תאים בתרבית נוזל מכוסה, הסבירה שרובם מסומנים בטבלה זו.

הממצאים והמסקנות בדו&quot;ח זה הם של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים תרבית מקוטבת מכוסה נוזל של שלושה תאי Calu באמצעות מערכת תרבית Transwell להקמת מערכת תרבית Transwell. ראשית, הכינו צלחת טרנסוול על ידי העברת תוספות לשורות החיצוניות של הצלחת והוספת מדיום לתאי הבסיס של כל באר. השלב השני הוא הכנת תאי תרבית חד-שכבתיים לתרחיפים של תאים בודדים.לאחר מכן, התאים התלויים יושבים בתאים האפיקליים של מוסיף הטרנסוול. השלב האחרון הוא החלפה מוחלטת של מדיה רוחבית אפיקלית ובסיסית. בתרבית מוסיף במחזור של שלושה ולאחר מכן ארבעה ימים למשך שבועיים-שלושה עד שהתאים מקוטבים לחלוטין.בסופו של דבר, התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל ובדיקת שיווי משקל פסיבית של נתרן פלואורסצאין משמשות להדגמת קיטוב של תרביות calu שלוש מכוסות נוזל. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו על פני שימוש בתאי אפיתל סימפונות אנושיים רגילים הוא שקלור שלוש נגישים יותר ומתפתחים מהר יותר לתרביות מקוטבות מוכן לשימוש כל ההליכים לגידול קאלו מקוטב. שלוש תרביות מכוסות נוזל או LCC מבוצעות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקות תרבית סטריליות.התחל בהכנת צלחת באר טרנס 24 באר. לזריעה באמצעות מלקחיים סטריליים, העבר את תוספות ה-transwell מהחלק הפנימי לשורות החיצוניות של הצלחת מבלי לגעת בתוספת. תאי ממברנה צריכים להיות תת-תרבות רק לבארות בשורות החיצוניות של הצלחת.ב-600 מיקרוליטר של EMEM המכיל 10% FBS המכונה להלן EMEM 10% לכל תא בסיסי. כדי למנוע הכנסת בועות אוויר, כוון את הפיפטה לקיר של כל תא ושחרר לאט את המדיום לבאר. לאחר מכן, נתק את קולו שלושה תאים מצלוחיות תרבית רקמות ותאי תת-תרבית כמתואר בטקסט הפרוטוקול, השהה ביסודיות את התאים השטופים בחמישה מיליליטר של EMEM 10% על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה, קבע ספירת תאים בת קיימא וכוללת בשיטת ההדרה הכחולה הטריאן והמשך רק אם 80% עד 90% הם ברי קיימא.לאחר מכן, בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר, יש לדלל תאים לריכוז של שניים כפול 10 לששת התאים הקיימים למיליליטר. עם EMEM 10% הוסף 100 מיקרוליטר של קאלו מרחף שלושה תאים לתא האפיקלי של כל טרנסוול למעט בארות A אחד ו-D אחד. כוון בעדינות את הפיפטה כנגד תעלת ההנחיה הפנימית של דופן ההכנסה ושחרר לאט את התאים.אל תיגע בפיפטה בקרום ההכנסה. ערבב בעדינות את תרחיף שלושת התאים של CALU במהלך שלב ישיבה זה כדי לשמור על השעיה הומוגנית של תאים לבארות A אחת ו-D אחת, שיהיו בארות בקרה או ריקים נטולי תאים ב-100 מיקרוליטר של EMEM 10% ללא תאים. דגרו את צלחת באר הטרנס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-7% פחמן דו חמצני באטמוספירה אווירית בחממה שבה ההפרעה הפיזית תהיה מינימלית כדי לשפר את יעילות הקיטוב.אין לערום צלחות זו על גבי זו שלושה ימים לאחר תת-תרבית ולהכניס שלושה תאים לתוך טרנסוולים, החלף את המדיום השואב בעדינות לחלוטין מתוספות הטרנסוול באמצעות פיפטה נימית המחוברת למלכודת ואקום עם ואקום עדין. הסר תחילה את המדיום האפיקלי מכל הבארות ולאחר מכן הסר את המדיום הבסיסי מכל הבארות. אל תיגע בקרומי ההכנסה בזמן שאיבת המדיום.הוסף 200 מיקרוליטר של EMEM 10% לתא האפיקלי של בארות נטולות תאים A אחד ו-D אחד. ואז לבארות היושבות, מכוון את המדיום לתא האפיקלי באמצעות הצד של התוספת כדי להנחות את קצה הפיפטה. אין להוסיף מדיום ישירות על התאים ואל תיגע בקרום ההכנסה.לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של EMEM 10% לתאים הרוחביים הבסיסיים כדי למנוע הכנסת בועות אוויר לתאים הרוחביים הבסיסיים. הוסף מדיום לכל אחד על ידי זווית הפיפטה על קיר כל תא ושחרור המדיום לאט לבאר. החזר את צלחת הטרנסוול לחממה לאחר המדיום הראשון הזה. החלפת.יש להחליף את המדיום במחזור לסירוגין בין היום הרביעי ואז השלישי לאחר ההאכלה הקודמת עד שהתאים מקוטבים לחלוטין. הקיטוב מנוטר על ידי הערכת התנגדות חשמלית או קרע של ה-CALU 3 LCC באמצעות וולטר שכויל ונבדק. כדי להתחיל בהליך זה, הסר את האלקטרודה מאוויר האתנול יבש למשך חמש עד 10 שניות ושטוף את האלקטרודה ב-EMEM סטרילי 10%הגדר את מתג המצב של הוולטר להגדרת ההתנגדות והפעל את הכוח.התחל במדידות עם בארות הבקרה נטולות התאים כדי לקבל מדידות בסיסיות ולאחר מכן המשך במדידות עבור כל אחת מהן. ובכן, הכניסו בעדינות את האלקטרודה לאחת משלוש היציאות המאפשרות גישה לתא הבסיסי של תרבית הטרנסוול. הנח את האלקטרודה כך שהעופרת הארוכה יותר פשוט תיגע קלות בתחתית הבאר החיצונית ותישאר אנכית.והעופרת הקצרה יותר נמצאת במדיום תרבית הרקמות של התא האפיקלי מבלי לגעת בקרום ההכנסה, לחץ על כפתור המדידה R והמתן עד שהקריאה תתייצב. חזור על שתי היציאות האחרות עבור כל באר ורשום את המדידות מכל שלוש היציאות בסך הכל שלוש מדידות לכל באר כדי לוודא שהקיטוב הושלם. בדיקה משנית המודדת דיפוזיה פסיבית של נתרן פלואורסצאין בין התאים האפיקליים והבסיסיים מבוצעת באחת עד שלוש תרביות טרנסוול.הסר בזהירות את המדיום הן מהתאים הרוחביים הבסיסיים והן מהתאים האפיקליים של תרביות הטרנסוול שייבדקו. שטפו תרביות transwell על ידי הוספה עדינה של 600 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, DPBS סטרילי לתאים הבסיסיים ו -100 מיקרוליטר DPBS סטרילי בטמפרטורת החדר לתאים האפיקליים. הסר בעדינות DPBS מהבארות.הוסף 600 מיקרוליטר של חיץ סטרילי שאינו פלואורסצנטי לתאים הבסיסיים, ואחריו 100 מיקרוליטר של נתרן פלואורסצין סטרילי לתאים האפיקליים. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. אחרי שעה.העבר את דגימת המאגר הלא פלואורסצנטי מהתא הבסיסי של כל מעבר בדיקה לצינור נקי נפרד. לצורך ניתוח, הסר את מעברי הבדיקה המשמשים לבחינת דיפוזיה פסיבית של נתרן פלואורסצאין מהצלחת והשליך. החזירו את הצלחת עם הטרנסוולים הנותרים לחממה.מניחים 100 מיקרוליטר מכל תמיסה סטנדרטית של נתרן פלואורסצאין שהוכנה בעבר בשלוש עותקים לתוך צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר. הכן שלושה דילולים של כל דגימה רוחבית בסיסית במאגר שאינו פלואורסצנטי. עבור כל דגימה, הוסף 100 מיקרוליטר של דגימה לא מדוללת ו-100 מיקרוליטר מכל דילול בשכפול לצלחת תחתונה שטוחה של 96 באר.מדד את ספיגת הדגימה בקורא לוחות EISA ב-486 ננומטר או 490 ננומטר. כדי להתחיל בהליך זה, תחילה יש לשטוף תאים ו-EMEM ללא סרום עם פיפטה נימית המחוברת למלכודת ואקום עם מדיום ואקום עדין לשאוב בעדינות מכל הבארות, להסיר את המדיום האפיקלי ואחריו את המדיום הבסיסי, לשאוב מדיום מבארות נטולות תאים A אחד ו-D אחד, ולאחר מכן מבארות זרעים. אל תיגע בממברנות ההכנסה בזמן שאיבת המדיום.הוסף 100 מיקרוליטר של EMEM ללא סרום לתא האפיקלי של בארות נטולות תאים A אחד ו-D אחד, ולאחר מכן לבארות היושבות המכוונות את המדיום לתא האפיקלי. השתמש בצד התותב כדי להנחות את קצה הפיפטה. אין להוסיף מדיום ישירות על התאים ואל תיגע בקרום ההכנסה.הבא ב-600 מיקרוליטר של EMEM חופשי בסרום לתאים הבסיסיים. הוסף מדיום לכל באר טרנס על ידי זווית הפיפטה על דופן התא ושחרור איטי של המדיום לבאר שאב בעדינות מדיום נטול סרום מבארות. החל מבארות נגועות לא נגועות או מדומה, הוסף את דילול הנגיף הבא לתא האפיקלי של בארות הטרנס המתאימות.100 מיקרוליטר של EMEM ללא סרום לבארות לא נגועות. 100 מיקרוליטר של תכשיר ללא וירוסים מדולל ב-EMEM ללא סרום לבארות נגועות מדומות ו-100 מיקרוליטר של וירוס מדולל ב-EMEM ללא סרום לווירוס. לאחר מכן, ב-600 מיקרוליטר של EMEM ללא סרום לכל התאים הבסיסיים, דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-7% פחמן דו חמצני למשך שעתיים.לאחר שעתיים, שאפו מדיום מבארות תחילה מבארות לא נגועות ולועגות, ולאחר מכן מבארות נגועות. הסר תחילה את הסופרנטנטים האפיקליים ואחריהם את הסופרנטנטים הצדדיים הבסיסיים. לבסוף, החלף את המדיום ב -200 מיקרוליטר EMEM, 10% בתאים האפיקליים ו -600 מיקרוליטר EMEM 10% בתאים הבסיסיים לפי השיטה המודגמת בסרטון זה.ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל או הקרע של שלוש תרביות מכוסות נוזל מגיעה לרמה בגובה 1000 מ' על סנטימטר רבוע או מעל תוך שלושה שבועות לאחר הזריעה. דוגמה לכך מוצגת באיור זה מכיוון שהצמתים ההדוקים הנוצרים בין תאים מקוטבים מונעים שיווי משקל פסיבי של מולקולות קטנות בין התאים האפיקליים והבסיסיים. בדיקת שיווי משקל נתרן פלואורסצ שונה משמשת לאישור קיטוב של שלוש תרביות מכוסות נוזל.ככל שהשכבה של קאלו שלושה תאים חד-שכבתיים ותרביות נוזליות גדלה, כמות הפלואורסצאין שמתאזנת באופן פסיבי לתא הבסיסי פוחתת נתונים מצטברים מארבעה ניסויים עצמאיים מוצגים כאן, וכל נקודת נתונים מייצגת מדידה אינדיבידואלית. ברגע שהקרע הוא 1000 בבעלות סנטימטר מרובע, כמות הפלואורסצאין שמתאזנת לתא הבסיסי של BA קטנה או שווה ל-1%לכן, calu שלוש תרביות מכוסות נוזל נחשבות למקוטבות לחלוטין כאשר השכבה גדולה או שווה ל-1000 בבעלות סנטימטר מרובע. ברגע ששכבת התרביות המכוסות בנוזל שלוש מגיעה למישור של 1000 ומעלה בבעלות סנטימטר מרובע, המודל מוכן לשימוש לבחינת תגובות תאי אפיתל בדרכי הנשימה לפתוגנים נשימתיים, כולל וירוס סינציאלי נשימתי או RSV כפי שמוצג.בדוגמה זו, חשיפה ל-RSV המיוצג באדום מביאה לירידה מהירה יותר בתרבות המקוטבת. שלמות בהשוואה לזיהום מדומה של תאים המיוצגים בנתונים כחולים מוצגת כעמידות חציונית של שמונה בארות עצמאיות לכל זיהום, פלוס או מינוס SEM לנקודת זמן. הכוכבית מצביעה על P פחות מ-0.05 בין שתי תרבויות נגועות מדומות ל-RSVA כפי שנקבע על ידי מבחן ה-T של התלמיד.אל תשכח כשאתה עובד עם גורמים זיהומיים, זה יכול להיות מסוכן ועליך ללבוש PPE מתאים ולהשתמש בשיטות מעבדה טובות בעת ביצוע הליכים אלה.

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

תאי אפיתל באף, שהושגו באמצעות ביופסיה לגרד שטחית של מתנדבים אנושיים, הם התרחבו ומועברים על גבי מוסיף בתרבית רקמה. בהגיעם confluency, תאים גדלים בממשק נוזל האוויר, מניב תרביות של תאי ריסי ולא ריסי. תרביות תאי אפיתל באף מובחנות לספק מודלים ניסויים מעשי ללימוד הרירית בדרכי הנשימה.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.

מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תאים דמויי אפיתל דמויי אפיתל פלוריפוטנטיים מסוג 2 המושרים על ידי בני אדם (iAT2s). תאים אלה יכולים להיות מתורבתים ככדורים המתחדשים בעצמם בתרבית תלת-ממדית או מותאמים לתרבית ממשק אוויר-נוזלי (ALI).

יצירת כדורים תלת-ממדיים ותרביות ממשק אוויר-נוזל דו-ממדיות של תאי אפיתל פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מסוג 2

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

אפיתל האף הוא אתר המחסום העיקרי בו נתקלים כל הפתוגנים הנשימתיים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש בתאי אפיתל אף ראשוניים שגודלו כתרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח במערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

זיהום של תאי אפיתל אף ראשוניים הגדלים בממשק אוויר-נוזל כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

מאמר זה מתאר את היצירה של מודל מחסום דרכי נשימה מורכב ורב-תאי המורכב מאפיתל ריאות שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), מזנכימה, תאי אנדותל ומקרופאגים בתרבית ממשק אוויר-נוזל.

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

למד להקים תרבות נוזלית מקוטבת של תאי אפיתל קלו-3 באמצעות מערכת Transwell. השיטה כוללת מדידת TEER ובדיקת פלואורסצין לבחינת שלמות המחסום האפיתליאלי.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה

גלה סרטונים נוספים