Name: כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למדו לכמת את תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. השיטה מודדת ישירות מודולוס של 0.7 קילופסקל ועובי של 380 ננומטר בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לאלנה Lomakina, ריצ&#39;רד Bauserman, מרגרט יונגמן, השי וקנין, ג&#39;סיקה סניידר, כריס Striemer, Nakul Nataraj, האנג לי צ&#39;ונג, Tejas Khire, ואריק לאם על סיועם בפרויקט זה. פרויקט זה מומן על ידי NIH # PO1 HL 018208.

1. שיטות לשכת תזרים סלולרי 1.1 תא זרימה, מוצג באיור 1, נבנה כך שניתן לגדל תאים תחת גזירה של 1.0 Pa (10 / סנטימטר dyn 2) ולאחר מכן מועברים ישירות למקלט MFP3D AFM (סנטה ברברה, קליפורניה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הזרימה היה מוכן לניסוי על ידי ניקוי תחילה את שקופיות הזכוכית בפתרון Piranha (03:01 H 2 SO 4: H 2 O 2) במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם במים מזוקקים. אז הם היו אופים ליבשים ומצופים בtriethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא ואקום בתצהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטם סיליקון נחתך באמצעות כלי חיתוך SD צללית. זה אפשר לנו היטב לשלוט בממדים הקאמריים הזרימה לשליטה על קצב הזרימה ומאמץ גזירה בגדילת תאים. בדרך כלל, ערוץ נחתך 6.4 מ&quot;מ רחב של 19 מ&quot;מ ארוך מגיליון של סיליקון מ&quot;מ 0.4. קצב הזרימה ההכרחי לסוגיםטה מאמץ גזירה של 1.0 Pa (10 dyn / סנטימטר 2) מחושב בהנחה שהזרימה למינרית בערוץ מלבני עם המשוואה: </li></ol><img alt="משוואה 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> בי Q הוא קצב הזרימה, τ הוא מאמץ הגזירה, μ הוא הצמיגות הבינונית, מניח כאן להיות 1.0 MPA (0.01 dyn * שניות / סנטימטר 2), h הוא הגובה והרוחב הוא הרוחב של תא הזרימה . <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטע העליון של תא הזרימה היה מתואם עם האטם בצלחת תרבית תאים ומאובטחים עם טבעת מגנטית. ההרכבה הייתה מלאה באיזופרופיל אלכוהול (IPA) לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת הזרימה המלאה הורכבה. יציאות הזרימה בצלחת תרבית התאים הייתם מחוברות לשסתומים משולשים. השסתומים היו קשורים לפתיחת מזרק מ&quot;ל 30s. IPA היה סמוק דרך המערכת, אז שנשטפה עם 30 מ&quot;ל של מדיום של מקוי עם 4% עגל סרום עוברי (FCS). אז המערכת הייתה מלאה ב20 מ&quot;ל של מדיום גידול תאי טכנולוגיות Vec. כיסויים הונחו על צמרות המזרקים. כובע מזרק המאגר לתפוס לו מחט במקום לזוז בינוני בחזרה למאגר ההזנה. 0.2 מסנני מיקרומטר סטריליים צורפו לפתחי כניסת האוויר בשמיכות כדי למנוע זיהום של המערכת. תא הזרימה היה אז מוכן לזריעת תאים. </li></ol> תא תרבות 1.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים אנושיים טבור וריד האנדותל (HUVEC של) ובינוני צמיחה נרכשו מטכנולוגיות Vec (Rensselaer, ניו יורק) וגדלו למפגש בT25 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום הגידול הוסר מהבקבוקון וmonolayer של תאים משתחררים עם 2 מ&quot;ל של טריפסין 2.5%. ברגע שהתאים היו בתמיסה, trypsinization היה רווה עם תוספת של 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות תא לבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעית תא דואר הייתה centrifuged למשך 5 דקות וsupernatant הוסר. התאים היו resuspended ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים (המכיל סרום) להזרקה לתוך תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית התא (0.5 מ&quot;ל, ~ 50,000 תאים) הוכנסה למזרק והזריקה לתוך תא הזרימה דרך שסתום שלוש דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הורשו להתיישב ולדבוק במצע הזכוכית ל2 שעות לפני הזרימה החלה. את התאים גודל תחת זרימה בחממה ב 37 ° C עבור 1 עד 5 ימים עד confluent. </li></ol> הכנת Cantilever 1.3 וכניסה סלולרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cantilevers AFM Tipless (NanoWorld, שוויץ) נוקו בחומצה חנקתית למשך 5 דקות ופונקציונליות עם triethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא שיקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לפי משקל NHS-sulfo-LC-ביוטין בתמיסת מלח Buffered של האנק (HBSS) היה מוכן. את cantilevers היה שקוע בפתרון במשך 15 דקות לconjuשער silane עם N-Hydroxysuccinimide כימיה (NHS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של מדיום חופשי ביוטין נעשה על ידי דוגר 20 מ&quot;ל של מדיום Vec טכנולוגיות תא התרבות (כולל סרום) עם 200 μl של חרוזי streptavadin עבור 12 שעות. החרוזים הוסרו מהמדיום עם מגנט והבינוני היה מסונן דרך מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הזרימה הוסר מצלחת תרבית התאים והתאים נשטפו 37 ° C הבינוני ביוטין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מניות של μl 1 מתוך 2.4 מיקרומטר חרוזים מצופים בstreptavidin 1 מ&quot;ל של מדיום חופשי ביוטין היה מוכן, ו100 μl של המניות נוספת לצלחת תרבית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזי streptavidin נאספו בשלוחה על ידי נחיתת טיפ על משטח הזכוכית לצד, לחזור בו חרוז, מיצוב השיא של השלוחה מעל החרוז, ולאחר מכן לחיצה על השלוחה למטה, אל כמה שניות החרוזות ומנוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרגישות של השלוחה הייתה מידהד ידי indenting על אזור של זכוכית חשופה ובאמצעות השיפוע העקום להגדיר סטיית הקצה כפונקציה של מתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוע הקפיץ של השלוחה חושב אזי מכיול תרמי בתוכנת MFP3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלוחה המכוילת שמשה אז לשנן את הדגימות, כפי שמוצגת באיור 2. 2.4 מיקרומטר חרוזים אלו מציעים שטח מגע גדול יותר עם תא השטח, כך שהתכונות המכאניות של שכבת glycocalyx הרכה ניתן לאתר. השלוחה הוצבה מעל תא ליד גרעין התא וגישה רכה של הקצה אל התא היה בשימוש כדי לקבוע את גובה השלוחה כ 3 מיקרומטר מעל פני שטח התא. התוכנה הוקמה במשך 20 חריצים חוזרים ונשנים בשיעור של 1 מיקרומטר / שנייה לכוח מקסימאלי של 7 NN. כ 6 שניות שחלפו בין אנשי קשר רצופים. ניתן להשתמש בתעריפים שונים של כניסה לבדיקת תכונות תלויות הזמן glycocalyx, אם כי באלה ראשוניים<html> ניסויים, רק שיעור כניסה יחידה (מיקרומטר 1 / שני) היה בשימוש. </li></ol> 2. תאורית הזחה כניסה למחצית שטח אלסטי עם מרחב של R רדיוס ניתן לתאר באמצעות תאורית הרץ שבו הכח של כניסה, F, נתונה על ידי המשוואה: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> איפה δ הוא עומק ההזחה ו* E הוא מודולוס המופחת של החומר נבדק (איור 3). במקרה של indenter אינסוף נוקשה לפגוע חצי מרחב אלסטי אחיד, * דואר ניתן על ידי המשוואה: <html> 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; כאשר E היא מודולוס האלסטיות וν הוא יחס פואסון של החומר. העבודה האחרונה עם פולימר סרטים נתנה השראה לפיתוח מודל שתי שכבה לקביעת מודולוס והעובי של שכבות דקות 1. אנו מיישמים את המודל הזה לביולוגיה של תא על ידי טיפול glycocalyx כסרט רך דק אחיד על פני השטח של גוף התא. שימוש במודל זה, מודולוס המופחת של המערכת הופך להיות: <img alt="משוואה 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> כאשר E GC הוא מודולוס של glycocalyx, תא הדואר הוא מודולוס של גוף התא, P, Q ו n הם קבועים אשר נקבעו באופן אמפירי מהפולימר המתאים, וZ זה נתונה על ידי המשוואה: -Together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="משוואה 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> כאשר t הוא עובי שכבת glycocalyx. סכמטי של פרמטרים אלה מוצג באיור 3. המודל הוכח להיות דרך מדויקת של קביעת מודולוס והעובי של סרט דק על מצע 1 נוקשה. משוואה זו יכולה לשמש כדי להתאים את העקומות המתקבלות מכניסה לתוך תאים כדי לקבוע מודולוס והעובי של glycocalyx האנדותל, כפי שמוצגת באיור 4.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנחנו השתמשנו ערכים מחושבים מהמודל דו שכבתי ותאורית הרץ למודל האינטראקציה של יקוציט במחזור הדם עם קיר אנדותל. אנו כי יש לחשב את microvillus על יקוציט בקוטר של 50 ננומטר בעומס 10 PN הייתי כניסה כ 150 ננומטר לglycocalyx, רק חלק קטן מהעובי הכולל. זה מצביע על כך glycocalyx, עם מאפיינים כפי שנמדד בניסוי זה, הוא מכשול משמעותי לאינטראקצית תאי תאים ויכול להיות הפרעה סטרית גדולה שהתאים חייבים להתגבר במהלך מפל ההידבקות במהלך הידבקות יקוציט. <p class="jove_content" style=";text-align:rig...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> הבינוני של מקוי </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני צמיחת תאי אנדותל </td><td> טכנולוגיות Vec </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> תאי אדם אספו טבורי וריד אנדותל </td><td> טכנולוגיות Vec </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> JT בייקר </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> מי חמצן </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilane </td><td> אולדריץ </td><td> 440140-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> איזופרופיל אלכוהול </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח Buffered של האנק </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-ביוטין </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> מקלט מחקר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers Tipless </td><td> Nanoworld </td><td> חץ TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> הצללית SD </td><td> Quickutz </td><td> צללית-SD </td><td></td></tr><tr><td> גומי סיליקון </td><td> סטוקוול Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 מיליליטר מזרקים </td&gt; <td> בנטון דיקינסון </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 מחטי מד </td><td> בנטון דיקינסון </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> סטים מאריכים </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> שסתומי 4 דרך </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Caps נמלי זכר / נקבה </td><td> סמית של הרפואה </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> משאבת peristaltic </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> אבובי peristaltic </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים סטריליים </td><td> מדעי חי Pall </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

כימות תכונות המכאניות של glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

ההבנה של האינטראקציה של לויקוציטים ודופן כלי הדם במהלך לכידת יקוציט מוגבל על ידי הבנה חלקית של התכונות המכאניות של שכבת פני השטח האנדותל. זה ידוע כי מולקולות דבקות על תאי דם לבנים מופצות לא אחידה ביחס למשטח 3 טופוגרפיה, הטופוגרפיה שמגבילה היווצרות קשרים עם דבק משטחים אחרים 9, וכי כוחות המגע פיסיולוגיים (≈ 5.0-10.0 PN לmicrovillus) יכולים לדחוס את microvilli כל קטן כשליש מאורך המנוחה שלהם, להגדיל את הנגישות של מולקולות על פני השטח היריב 3, 7. אנו רואים האנדותל כמבנה דו שכבתי, גוף התא הקשיח יחסית, בתוספת glycocalyx, ציפוי סוכר מגן רך על פני שטח luminal 6. הוכח שglycocalyx יכול לפעול כמחסום להפחתת הידבקות של לויקוציטים לאנדותל 4 משטח.בדו&quot;ח זה אנו מתחילים להתייחס deformability של משטחי אנדותל להבין כיצד הקשיחות המכאנית האנדותל עשויה להשפיע על היווצרות קשרים. תאי האנדותל הגדלים בתרבית סטטית אינם מבטאים glycocalyx חזק, אבל תאים שגודלו בתנאי זרימה פיסיולוגיות מתחילים המשוער glycocalyx נצפה בvivo 2. מודולוס של גוף התא האנדותל כבר נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כדי להיות כ 5-20 kPa 5. עובי המבנה של glycocalyx נחקרו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 8, ומודול של glycocalyx כבר מקורב תוך שימוש בשיטות עקיפות, אבל למיטב ידיעתנו, לא חל כל דו&quot;חות רשמיים של מדידה ישירה של מודולוס glycocalyx בתאים חיים . במחקר זה, אנו מציגים ניסויים שנעשו עם הזחת רומן AFM בדיקה על תאים שכבר בתרבית בתנאים למקסם ביטוי glycocalyx למאמדידה ישירה של ke מודולוס והעובי של glycocalyx אנדותל.

<html> בניסוי טיפוסי, 20 עקומות כוח לעומת מרחקים התקבלו מאזור נתון של התא, בדרך כלל באזור perinuclear, קרוב, אבל לא על, הגרעין (בתוך ~ 2 מיקרומטר). העקומות היו מיושרות לחשבון לכל סחף מדגם על משך הזמן של המדידה ולאחר מכן בממוצע להסרת רעש שלוחה, כפי שמוצגות באיור 4. העקומות נותחו ולהשתלב עם מודל שתי השכבה שפותח לקביעת מודולוס והעובי של פולימר 1 סרטים דקים. מהתקפים של את הקימורים של 25 תאים, שקבענו שמודולוס של שכבת luminal הוא 0.7 ± 0.5 kPa והעובי הוא 380 ±...

המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את התכונות המכניות של הגליקוקליקס האנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או FM. זה מושג על ידי תרבית ראשונה, חד-שכבה של תאי אנדותל תחת זרימה פיזיולוגית בביו-ריאקטור על מנת לבנות את שכבת הגליקוקליקס כשלב שני. חרוזים בגודל מיקרון מחוברים לשלוחה FM ומשמשים כבדיקה למדידת כוח ההתנגדות של גוף התא והגליקוקליקס במהלך הזחה. לאחר מכן, עקומות הכניסה מתאימות למודל דו-שכבתי על מנת לקבוע את מודול הגליקוקליקס ומתקבלות תוצאות עובי המראות כי לגליקוקליקס האנדותל יש מודול של 0.7 קילו פסקל ועובי של 380 ננומטר על סמך ניתוח שתי השכבות.היי, אני ריק ווא.אני יו"ר ההנדסה הביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. בשנים האחרונות התקיים דיון רב על התפקיד האפשרי של הגליקוקליקס האנדותל בדלקת, במיוחד בשאלה האם הוא עשוי לשמש כמחסום מגן למניעת הידבקות תאים לא רצויה במהלך דלקת. אחד המפתחות לפתרון השאלות הסובבות סוגיה זו הוא היכולת למדוד את התכונות הפיזיקליות, כלומר את העובי והנוקשות של שכבה זו, הן בתנאים רגילים והן במהלך התגובה הדלקתית.אני גרהם מארש. אני סטודנטית לתואר שני במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. הבעיה הגדולה באפיון הגליקוקליקס האנדותל היא שהוא רך להפליא.הגישה שהגענו אליה היא להצמיד חרוז גדול לקצה שלוחת A ו-A FM כך שהכוחות הנמדדים יהיו ניתנים לפתרון עם ה-A FM.To להתחיל בהליך זה, לבנות תא זרימה כמו זה שמוצג כאן, המסוגל לגדל תאים תחת מתח גזירה של 1.0 פסקל. הכן את תא הזרימה לניסוי על ידי ניקוי תחילה של שקופיות הזכוכית בתמיסת פיראנה למשך 15 דקות. שוטפים אותם שלוש פעמים במים מזוקקים ומייבשים אותם בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר מכן, צפו את השקופיות באמינו פרופיל טריקסי, cy lane או apte על ידי שקיעת אדים. הוסף מיליליטר אחד של apte לבקבוק המחובר לתא הוואקום עם הדגימה. ואז מכסה את הבקבוק ומשוך ואקום של 0.7 בר למשך שעה.במהלך תקופה זו, רענן את הוואקום שלוש פעמים. לאחר מכן, חותכים אטם תא זרימה חדש מגיליון סיליקון בעובי 0.4 מילימטר באמצעות כלי חיתוך SD צללית. רוחב התעלה 6.4 מילימטרים ואורכה 19 מילימטרים, והקוטר החיצוני נחתך ל-35 מילימטרים על מנת שיתאים לצלחת תרבות המקלט.באמצעות ממדים אלה, חשב את קצב הזרימה הדרוש ליצירת מתח מוחלט של פסקל אחד עם המשוואה המוצגת כאן. Q מייצג את קצב הזרימה. טאו הוא המתח הצרוף.Mu היא הצמיגות של המדיום. H הוא גובה הערוץ, ו-W הוא רוחב תא הזרימה. השלב הבא הוא ליישר את החלק העליון של תא הזרימה עם האטם בצלחת תרבית התאים ולאבטח אותו באמצעות טבעת מגנטית.חבר את יציאות הזרימה בצלחת תרבית התאים לשלושה שסתומי גל עם קווים למזרקי 30 מיליליטר. לאחר מכן יש לעקר את כל המכלול על ידי שטיפה באלכוהול איזופרופיל למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את האלכוהול ואפשר לו להתייבש באוויר ברקמה.מכסה המנוע מחמם מראש 4% סרום עגל עוברי ב-McCoy בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהשאירו לייבוש במשך חמש עד 10 דקות, שטפו את כל האלכוהול שנותר עם 30 מיליליטר מסרום העגל העוברי שהתחמם מראש. לאחר מכן מלאו את המזרקים ב -20 מיליליטר מדיום גידול MCDB 1 31.לאחר מכן, כסו את המזרקים כדי למנוע זיהום. בעת הוצאת המערכת מהמכסה המנוע הסטרילי, התקן את המכסה של מאגר התפיסה עם המחט שמגיעה לתוך הנוזל כדי למשוך את המדיום בחזרה למאגר במעלה הזרם. לבסוף, חבר מסננים סטריליים של 0.2 מיקרון לכניסות האוויר על הכובעים הבא לקצור את וריד הטבור האנושי.תאי אנדותל גדלו למפגש בבקבוק T 25. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100,000 תאים למיליליטר במדיום ומשכו את התמיסה למעלה למזרק. לאחר מכן הזרקו את המתלה לתא הזרימה דרך השסתום התלת-כיווני.אפשר לתאים להתיישב ולהיצמד למצע הזכוכית למשך שעתיים. לפני תחילת הזרימה, העבירו את הביוריאקטור והתאים לאינקובטור שבו מותר לתאים להתיישב ולהיצמד למשך שעתיים. צינורות המחברים את המאגרים למשאבה פריסטלטית עוברים דרך החלק האחורי של החממה לאחר שהתאים נדבקו, הגדר את המשאבה הפריסטלטית לקצב הזרימה הרצוי.מדיה נעה בין המאגרים, ויוצרת ראש לחץ וזרימה דרך הביוריאקטור המייצר מתח גזירה של קיר של פסקל אחד. אפשר לתאים לדגור בזרימה רציפה ב-37 מעלות צלזיוס למשך יום עד חמישה ימים עד שהתא מתכנס. כדי להתחיל בהכנת שלוחה יש לנקות קצה בתוספת שלוחה FM בחומצה חנקתית למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטיפה במים מזוקקים.לאחר הייבוש, תפעל את השלוחה עם apdi בתא שקיעת אדים כפי שהוצג קודם לכן עבור שקופיות הזכוכית. לאחר מכן הכינו תמיסה של חמישה מיליגרם למיליליטר לפי משקל NHS Sulf O lc, ביוטין בתמיסת המלח המבודדת של האנק. טבלו את השלוחים בתמיסה למשך 15 דקות.תגובה זו מצמידה את ה-CY ואת תחמוצת ההידרוקסי הסופית ומציגה מולקולות ביוטין על פני השטח של השלוחות. ביום שלפני, התחל להכין תמיסה של מדיום נטול ביוטין על ידי שילוב של 20 מיליליטר של מדיום תרבית vexcel המכיל 20% סרום עם 200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים סטרפט ENC, ודגירה למשך 12 שעות תוך כדי סיבוב. ביום הניסוי.משוך את החרוזים המגנטיים לתחתית הצינור עם מגנט למשך שתי דקות והעביר את הסופרנטנט המכיל מדיום נטול ביוטין לצינור חדש. עקר את המדיה על ידי העברתה דרך פילטר של 0.22 מיקרומטר והכניס אותה לצינור חדש. השלב הבא הוא להסיר את תא הזרימה מכלי תרבית התאים ולאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום נטול ביוטין.לאחר מכן הוסיפו מיקרוגרם אחד בקוטר 2.4 מיקרומטר, חרוזים מצופים עדן. מוסיפים ריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכלי תרבית התאים ומערבבים אותו בעדינות. לאחר מכן, כייל את ה-A FM tib על ידי הצמדתו לחרוז חשפנית ולחיצתו למשטח זכוכית רגיל.על מנת להשיג זאת, הנחית את הקצה על משטח הזכוכית ליד חרוז, משוך את הקצה, ואז מקם את קודקוד השלוחה מעל החרוז ולחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. לבסוף, השתמש בשלוחה המכוילת כדי להכניס את הדגימות. החרוזים בגודל 2.4 מיקרומטר מציעים שטח מגע גדול יותר עם פני התא כך שניתן לזהות ביתר קלות את התכונות המכניות של שכבת הגליקוקליקס הרכה.כדי להשיג עמדה זו, השלוחה מעל תא ליד גרעין התא, השתמש בגישה רכה של הקצה על התא כדי להגדיר את גובה השלוחה כשלושה מיקרומטרים מעל פני התא. לאחר מכן הכניסו את פני השטח 20 פעמים בקצב של מיקרומטר אחד לשנייה לכוח מרבי של שבעה. ננו ניוטון מאפשר לחלוף שש שניות של זמן בין מגעים עוקבים.לחשב את עובי שכבת הגליקוקליקס באמצעות משוואות הקשורות לתורת הרץ. כוח הכניסה F מתואר על ידי משוואה זו כאשר דלתא היא עומק הכניסה. R הוא רדיוס הכדור, ו-estar הוא המודול המשולב של החומרים הנמצאים בלחץ.על מנת להפריד את המודול האלסטי המשולב estar לרכיבים תאיים וגליקוקליקס, התייחס לשכבת הגליקוקליקס כסרט רך אחיד ודק על פני גוף התא והשתמש במודל הדו-שכבתי של קליפורד C.In משוואה זו, PQ ו-N נקבעים באופן אמפירי קבוע מהתאמות פולימריות. M הוא קבוע ממודל הפולימר, ו-Z קשור לעובי הסרט הדק או שכבת הגליקוקליקס על ידי המשוואה המוצגת כאן. הכוח הנמדד על ידי A FM הנמדד בננו ניוטון מתחיל לעלות לאחר מגע עם פני השטח ונשלט בתחילה על ידי רכיב שכבת הגליקוקליקס.ברגע ששכבת הגליקוקליקס נדחסת, גוף התא הופך למרכיב העיקרי של דפורמציה. קו ההתאמה הכחול של שתי השכבות חושב על ידי התאמת ארבעה פרמטרים חופשיים כדי שיתאים לנתוני הכניסה המוצגים באדום מהמשוואה המשמשת ניתן לקבוע את מודול התא, גליקוקליקס, מודול השכבה ועובי שכבת הגליקוקליקס. המאפיינים מ-25 תאים נאספו להיסטוגרמה המוצגת כאן.מודול שכבת הגליקוקליקס הממוצע נקבע כ-0.7 פלוס או מינוס 0.5 קיפה-קל, ועובי שכבת הגליקוקליקס נקבע כ-380 פלוס מינוס 50 ננומטר. גישה זו נותנת לנו את הכלי שהיינו צריכים כדי לענות על שאלות בסיסיות לגבי תפקיד הגליקוקליקס בוויסות הידבקות התאים במהלך דלקת. כעת אנו יכולים לענות על שאלות לגבי האופן שבו תכונות הגליקוקליקס משתנות במהלך דלקת.באילו אמצעים השינויים הללו מושגים. ניתן להרחיב גישה זו במספר דרכים. לדוגמה, אפשר להשתמש בו כדי לבחון תיאורים תיאורטיים חדשים ומתוחכמים יותר של תכונות הגליקוקליקס.או ברמה מעשית יותר, אפשר להשתמש בזה כדי לבחון ציפויי משטח בהשראת ביו, שנועדו להגן על מכשירים מושתלים מפני תגובה חיסונית במארח. תודה רבה על התעניינותך בעבודה שלנו.

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד אבי העורקים מעכבר ומדידת המודול האלסטי שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

הפרוטוקול מציג זרימת עבודה מלאה לניסויים בננו-אינדנציה של חומרים רכים, כולל הידרוג'לים ותאים. ראשית, מפורטים הצעדים הניסיוניים לרכישת נתוני ספקטרוסקופיית כוח; לאחר מכן, הניתוח של נתונים כאלה מפורט באמצעות תוכנת Python קוד פתוח שפותחה לאחרונה, אשר ניתן להוריד בחינם מ- GitHub.

זרימת עבודה ניסיונית וניתוח נתונים עבור ננו-אינדנציה של חומר רך

כימות שטח המגע והכוח המופעל על ידי קצה גשושית כוח אטומי (AFM) על משטח הדגימה מאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות. נדונות שיטות עבודה מומלצות ליישום ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות למדידת מודולוס אלסטי או תכונות ננו-מכניות אחרות.

מיקרוסקופ כוח אטומי ננו-הזחה מבוססת Cantilever: מדידות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי באוויר ובנוזל

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מדמיין כיצד להכין חתכים קריוגרפיים של רקמת ריאה של עכברים, לבצע ניסויים במפת כוח במיקרוסקופ כוח אטומי ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את המודול של יאנג של קרום הבסיס הריאתי המקומי של העכבר.

חילוץ מודול הצעירים של ממברנות הבסיס הריאתיות של עכברים מקומיים ממפות כוח הנגזרות ממיקרוסקופ כוח אטומי

למדו לכמת את תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. השיטה מודדת ישירות מודולוס של 0.7 קילופסקל ועובי של 380 ננומטר בתאים חיים.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים