כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את התכונות המכניות של הגליקוקליקס האנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או FM. זה מושג על ידי תרבית ראשונה, חד-שכבה של תאי אנדותל תחת זרימה פיזיולוגית בביו-ריאקטור על מנת לבנות את שכבת הגליקוקליקס כשלב שני. חרוזים בגודל מיקרון מחוברים לשלוחה FM ומשמשים כבדיקה למדידת כוח ההתנגדות של גוף התא והגליקוקליקס במהלך הזחה. לאחר מכן, עקומות הכניסה מתאימות למודל דו-שכבתי על מנת לקבוע את מודול הגליקוקליקס ומתקבלות תוצאות עובי המראות כי לגליקוקליקס האנדותל יש מודול של 0.7 קילו פסקל ועובי של 380 ננומטר על סמך ניתוח שתי השכבות.

היי, אני ריק ווא.אני יו"ר ההנדסה הביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. בשנים האחרונות התקיים דיון רב על התפקיד האפשרי של הגליקוקליקס האנדותל בדלקת, במיוחד בשאלה האם הוא עשוי לשמש כמחסום מגן למניעת הידבקות תאים לא רצויה במהלך דלקת. אחד המפתחות לפתרון השאלות הסובבות סוגיה זו הוא היכולת למדוד את התכונות הפיזיקליות, כלומר את העובי והנוקשות של שכבה זו, הן בתנאים רגילים והן במהלך התגובה הדלקתית.

אני גרהם מארש. אני סטודנטית לתואר שני במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. הבעיה הגדולה באפיון הגליקוקליקס האנדותל היא שהוא רך להפליא.

הגישה שהגענו אליה היא להצמיד חרוז גדול לקצה שלוחת A ו-A FM כך שהכוחות הנמדדים יהיו ניתנים לפתרון עם ה-A FM.To להתחיל בהליך זה, לבנות תא זרימה כמו זה שמוצג כאן, המסוגל לגדל תאים תחת מתח גזירה של 1.0 פסקל. הכן את תא הזרימה לניסוי על ידי ניקוי תחילה של שקופיות הזכוכית בתמיסת פיראנה למשך 15 דקות. שוטפים אותם שלוש פעמים במים מזוקקים ומייבשים אותם בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, צפו את השקופיות באמינו פרופיל טריקסי, cy lane או apte על ידי שקיעת אדים. הוסף מיליליטר אחד של apte לבקבוק המחובר לתא הוואקום עם הדגימה. ואז מכסה את הבקבוק ומשוך ואקום של 0.7 בר למשך שעה.

במהלך תקופה זו, רענן את הוואקום שלוש פעמים. לאחר מכן, חותכים אטם תא זרימה חדש מגיליון סיליקון בעובי 0.4 מילימטר באמצעות כלי חיתוך SD צללית. רוחב התעלה 6.4 מילימטרים ואורכה 19 מילימטרים, והקוטר החיצוני נחתך ל-35 מילימטרים על מנת שיתאים לצלחת תרבות המקלט.

באמצעות ממדים אלה, חשב את קצב הזרימה הדרוש ליצירת מתח מוחלט של פסקל אחד עם המשוואה המוצגת כאן. Q מייצג את קצב הזרימה. טאו הוא המתח הצרוף.

Mu היא הצמיגות של המדיום. H הוא גובה הערוץ, ו-W הוא רוחב תא הזרימה. השלב הבא הוא ליישר את החלק העליון של תא הזרימה עם האטם בצלחת תרבית התאים ולאבטח אותו באמצעות טבעת מגנטית.

חבר את יציאות הזרימה בצלחת תרבית התאים לשלושה שסתומי גל עם קווים למזרקי 30 מיליליטר. לאחר מכן יש לעקר את כל המכלול על ידי שטיפה באלכוהול איזופרופיל למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את האלכוהול ואפשר לו להתייבש באוויר ברקמה.

מכסה המנוע מחמם מראש 4% סרום עגל עוברי ב-McCoy בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהשאירו לייבוש במשך חמש עד 10 דקות, שטפו את כל האלכוהול שנותר עם 30 מיליליטר מסרום העגל העוברי שהתחמם מראש. לאחר מכן מלאו את המזרקים ב -20 מיליליטר מדיום גידול MCDB 1 31.

לאחר מכן, כסו את המזרקים כדי למנוע זיהום. בעת הוצאת המערכת מהמכסה המנוע הסטרילי, התקן את המכסה של מאגר התפיסה עם המחט שמגיעה לתוך הנוזל כדי למשוך את המדיום בחזרה למאגר במעלה הזרם. לבסוף, חבר מסננים סטריליים של 0.2 מיקרון לכניסות האוויר על הכובעים הבא לקצור את וריד הטבור האנושי.

תאי אנדותל גדלו למפגש בבקבוק T 25. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100,000 תאים למיליליטר במדיום ומשכו את התמיסה למעלה למזרק. לאחר מכן הזרקו את המתלה לתא הזרימה דרך השסתום התלת-כיווני.

אפשר לתאים להתיישב ולהיצמד למצע הזכוכית למשך שעתיים. לפני תחילת הזרימה, העבירו את הביוריאקטור והתאים לאינקובטור שבו מותר לתאים להתיישב ולהיצמד למשך שעתיים. צינורות המחברים את המאגרים למשאבה פריסטלטית עוברים דרך החלק האחורי של החממה לאחר שהתאים נדבקו, הגדר את המשאבה הפריסטלטית לקצב הזרימה הרצוי.

מדיה נעה בין המאגרים, ויוצרת ראש לחץ וזרימה דרך הביוריאקטור המייצר מתח גזירה של קיר של פסקל אחד. אפשר לתאים לדגור בזרימה רציפה ב-37 מעלות צלזיוס למשך יום עד חמישה ימים עד שהתא מתכנס. כדי להתחיל בהכנת שלוחה יש לנקות קצה בתוספת שלוחה FM בחומצה חנקתית למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטיפה במים מזוקקים.

לאחר הייבוש, תפעל את השלוחה עם apdi בתא שקיעת אדים כפי שהוצג קודם לכן עבור שקופיות הזכוכית. לאחר מכן הכינו תמיסה של חמישה מיליגרם למיליליטר לפי משקל NHS Sulf O lc, ביוטין בתמיסת המלח המבודדת של האנק. טבלו את השלוחים בתמיסה למשך 15 דקות.

תגובה זו מצמידה את ה-CY ואת תחמוצת ההידרוקסי הסופית ומציגה מולקולות ביוטין על פני השטח של השלוחות. ביום שלפני, התחל להכין תמיסה של מדיום נטול ביוטין על ידי שילוב של 20 מיליליטר של מדיום תרבית vexcel המכיל 20% סרום עם 200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים סטרפט ENC, ודגירה למשך 12 שעות תוך כדי סיבוב. ביום הניסוי.

משוך את החרוזים המגנטיים לתחתית הצינור עם מגנט למשך שתי דקות והעביר את הסופרנטנט המכיל מדיום נטול ביוטין לצינור חדש. עקר את המדיה על ידי העברתה דרך פילטר של 0.22 מיקרומטר והכניס אותה לצינור חדש. השלב הבא הוא להסיר את תא הזרימה מכלי תרבית התאים ולאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום נטול ביוטין.

לאחר מכן הוסיפו מיקרוגרם אחד בקוטר 2.4 מיקרומטר, חרוזים מצופים עדן. מוסיפים ריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכלי תרבית התאים ומערבבים אותו בעדינות. לאחר מכן, כייל את ה-A FM tib על ידי הצמדתו לחרוז חשפנית ולחיצתו למשטח זכוכית רגיל.

על מנת להשיג זאת, הנחית את הקצה על משטח הזכוכית ליד חרוז, משוך את הקצה, ואז מקם את קודקוד השלוחה מעל החרוז ולחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. לבסוף, השתמש בשלוחה המכוילת כדי להכניס את הדגימות. החרוזים בגודל 2.4 מיקרומטר מציעים שטח מגע גדול יותר עם פני התא כך שניתן לזהות ביתר קלות את התכונות המכניות של שכבת הגליקוקליקס הרכה.

כדי להשיג עמדה זו, השלוחה מעל תא ליד גרעין התא, השתמש בגישה רכה של הקצה על התא כדי להגדיר את גובה השלוחה כשלושה מיקרומטרים מעל פני התא. לאחר מכן הכניסו את פני השטח 20 פעמים בקצב של מיקרומטר אחד לשנייה לכוח מרבי של שבעה. ננו ניוטון מאפשר לחלוף שש שניות של זמן בין מגעים עוקבים.

לחשב את עובי שכבת הגליקוקליקס באמצעות משוואות הקשורות לתורת הרץ. כוח הכניסה F מתואר על ידי משוואה זו כאשר דלתא היא עומק הכניסה. R הוא רדיוס הכדור, ו-estar הוא המודול המשולב של החומרים הנמצאים בלחץ.

על מנת להפריד את המודול האלסטי המשולב estar לרכיבים תאיים וגליקוקליקס, התייחס לשכבת הגליקוקליקס כסרט רך אחיד ודק על פני גוף התא והשתמש במודל הדו-שכבתי של קליפורד C.In משוואה זו, PQ ו-N נקבעים באופן אמפירי קבוע מהתאמות פולימריות. M הוא קבוע ממודל הפולימר, ו-Z קשור לעובי הסרט הדק או שכבת הגליקוקליקס על ידי המשוואה המוצגת כאן. הכוח הנמדד על ידי A FM הנמדד בננו ניוטון מתחיל לעלות לאחר מגע עם פני השטח ונשלט בתחילה על ידי רכיב שכבת הגליקוקליקס.

ברגע ששכבת הגליקוקליקס נדחסת, גוף התא הופך למרכיב העיקרי של דפורמציה. קו ההתאמה הכחול של שתי השכבות חושב על ידי התאמת ארבעה פרמטרים חופשיים כדי שיתאים לנתוני הכניסה המוצגים באדום מהמשוואה המשמשת ניתן לקבוע את מודול התא, גליקוקליקס, מודול השכבה ועובי שכבת הגליקוקליקס. המאפיינים מ-25 תאים נאספו להיסטוגרמה המוצגת כאן.

מודול שכבת הגליקוקליקס הממוצע נקבע כ-0.7 פלוס או מינוס 0.5 קיפה-קל, ועובי שכבת הגליקוקליקס נקבע כ-380 פלוס מינוס 50 ננומטר. גישה זו נותנת לנו את הכלי שהיינו צריכים כדי לענות על שאלות בסיסיות לגבי תפקיד הגליקוקליקס בוויסות הידבקות התאים במהלך דלקת. כעת אנו יכולים לענות על שאלות לגבי האופן שבו תכונות הגליקוקליקס משתנות במהלך דלקת.

באילו אמצעים השינויים הללו מושגים. ניתן להרחיב גישה זו במספר דרכים. לדוגמה, אפשר להשתמש בו כדי לבחון תיאורים תיאורטיים חדשים ומתוחכמים יותר של תכונות הגליקוקליקס.

או ברמה מעשית יותר, אפשר להשתמש בזה כדי לבחון ציפויי משטח בהשראת ביו, שנועדו להגן על מכשירים מושתלים מפני תגובה חיסונית במארח. תודה רבה על התעניינותך בעבודה שלנו.