הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפעיל נוירונים סומטוסנסוריים בודדים בדגי זברה זחלים. זה מושג על ידי הכנת כבל אופטי וחיבורו ללייזר כחול A-D-P-S-S. השלב השני הוא הזרקת הטרנסגן לעוברים בשלב תא אחד עד שניים.

לאחר מכן מסננים עוברי שומן המבטאים עגבנייה C-H-E-F-T-D בנוירונים סומטוסנסוריים ומרכיבים אותם פנימה. השלב האחרון הוא לספק פולס קצר של אור כחול להפעלת תא עצב בודד ולתעד את ההתנהגות המתקבלת. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות המשתמשות בשורש ערוץ אפשרות שנייה הוא שניתן להשתמש בגישה זו כדי לעורר תגובות התנהגותיות מנוירונים בודדים המופעלים עד ארבעה ימים לפחות לאחר האשפוז.

למרות ששיטה זו משמשת כדי לספק תובנה לגבי תפקודם של נוירונים סומטוסנסוריים ספציפיים בדג זברה זחל. גישה זו יכולה להיות מותאמת גם לחקר התנהגויות שמעוררת כל אוכלוסיית נוירונים של דג זברה כגון נוירונים פנימיים או נוירונים מוטוריים. גישה גנטית זו יכולה לשמש להפעלת נוירונים ספציפיים in vivo, לאפיין התפתחות תפקודית, להעריך את ההשפעות של מוטציות או חסימה פנומנולוגית של חלבונים ספציפיים על התנהגות ולמפות רשתות עצביות במורד הזרם המובילות לתגובות התנהגותיות מובהקות.

כדי להתחיל בהליך זה, צור יחידת אחסון לכבל האופטי על ידי המסת הצוואר המחודד של. פיפטת פסטה מעל חבטות ומבער ליצירת זווית של 150 מעלות. לאחר מכן, בעזרת חותך תיל או סכין גילוח, חתוך בזהירות את הכבל האופטי לשני חלקים.

לכל חלק צריך להיות קצה חשוף אחד וקצה אחד עם מתאם FC PC. לאחר מכן הפשיטו את הכבל האופטי עד לחיפוי על ידי הסרת מעטפת הסיבים, חיזוק הסיבים והציפוי מ -5.0 סנטימטרים מהקצה החתוך של הכבל. לאחר מכן, הכנס את הכבל האופטי לתוך פיפטת הפסטה המוכנה.

ודא שהכבל יכול לנוע בקלות פנימה והחוצה מקצה הפיפטה באמצעות חותך זכוכית יהלום או מלקחיים בעלי קצה עדין. חתכו את סיבי הזכוכית ושברו את הקצה כדי ליצור חתך נקי בקצה הסיב. לאחר מכן, החזר את הכבל האופטי לתוך פיפטת הפסטה.

לאחר מכן מקם את הכבל האופטי בפיפטה הפסטה באמצעות מניפולטור מיקרו מתחת למיקרוסקופ באופן ידני COATE 24 עד 48 עוברי HPF באמצעות זוג מלקחיים לאחר מכן, הרדם את הזחלים באמצעות 0.02% trica באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. זיהוי הזחלים עם ביטוי נוירון בירד או נוירון טריגמינלי עוברים עם ביטוי דליל בתאים הניתנים לזיהוי בקלות הם אופטימליים, אך נוירונים בודדים יכוונו להפעלה באמצעות כבל סיב אופטי, כך שמגוון רחב של צפיפות ביטוי מקובל. העבירו את הזחלים לכלי חדש עם מי עובר כחולים טריים של PTU.

יש לאחסן את העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס בחושך עד לשלב הניסוי הרצוי. בחלק זה, הכינו מלטאז נמוך ב-1.5% ומים מזוקקים כפולים ואחסנו בגוש חום של 42 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהם להתמצק. בעזרת פיפטת פסטה מזכוכית העבירו את אחד הזחלים לפני המסך לתוך צינור של 1.5% אגרוז נמס נמוך עם כמה שפחות מי עובר כחולים.

לאחר מכן מעבירים את הזחל בטיפת אגרוז לצלחת פטרי קטנה. תחת מיקום מיקרוסקופ מנתח הצד הגבי של הלבה כלפי מעלה כאשר ה-aros מתמצק. השתמש בסכין גילוח דק כדי לחתוך ארוסים משני צידי הלבה.

מלאו את האזור המקיף את הארוס במים כחולים עובריים. לאחר מכן, ערכו שני חתכים אלכסוניים משני צידי החלמון, והקפידו לא לחתוך את הלבה. לאחר מכן, משוך את האגרו הרחק מהגזע ומזנב הלבה.

כעת הרכיב את המצלמה המהירה על טווח החיתוך וחבר את המצלמה למחשב. לאחר מכן הפעל את המחשב ואת המצלמה המהירה. פתח את תוכנת הדמיית הווידאו והתאם את הגדרות המצלמה.

לאחר מכן, חבר את הכבל האופטי, הלייזר והסטימולטור יחד. לאחר מכן הפעל את הממריץ והגדר אותו למקסימום של חמישה וולט ומשך הדופק של חמש אלפיות השנייה. לאחר מכן הפעל את הלייזר.

לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ הניתוח הפלואורסצנטי כדי למקם את קצה הכבל האופטי ליד גוף תא עצב עם ביטוי עגבניות C-H-E-F-T-D. העבירו פולס של אור כחול כדי להפעיל את הנוירון החושי. לאחר מכן הקלט את התגובות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה.

קבעו 500 או 1000 פריימים לשנייה, וחזרו על הניסוי לפחות דקה אחת בין הפעלה להפעלה כדי למנוע התרגלות, כדי לשחרר את החלק הקודם של הלבה, את האריס עם מלקחיים, ולהיזהר לא להכניס את החיה. לאחר מכן העבירו אותו למי עובר כחולים טריים. ניתן לאפשר לבעלי החיים להתפתח עוד יותר וניתן לחזור על ההליך בשלבים ישנים יותר.

ניתן גם להרכיב מחדש את העובר להדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של התא המופעל על מנת לתאם את ההתנהגות עם מבנה התא. הלבה של דג הזברה המוצגת כאן מותקנת בחלקה ב-1.5% מאלט דל אריס המיוצג על ידי קווי המקף המקיפים את החלק הרוסטרלי שלו. נוירון טריגמינלי ותא עצב זקן רוהאן מתוארים בתאי פה אדום המתוארים על ידי קווי המקף באיור.

הנה סרטון המראה כי הפעלה של נוירון זקן רוהאן יחיד המבטא עגבנייה C-H-E-F-T-D בלבה של כ-35 HPF מעוררת תגובה התנהגותית. הסרט הזה מראה את ההפעלה של עגבניות C-H-E-F-T-D המבטאות נוירונים של זקן רוהאן בלבה של 60 HPF, והסרט הזה מראה את ההפעלה של ביטוי עגבניות C-H-E-F-T-D נוירונים של זקן רוהאן בלבה של ארבעה DPF פעם ששולטים בהם. ניתן לבצע גישה גנית זו תוך פחות משעה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפעיל נוירונים בודדים ודגי מאזניים זחלים בנקודות זמן שונות. אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות נאותים בעת ביצוע הליך זה.