Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את התנהגות התאורה המולדת והצירקדית של זחלי דרוזופילה באמצעות מבחן העדפה לאור וחושך. זאת מושג תחילה על ידי גידול הזחלים הניסיוניים תחת תנאי אור וחושך מוגדרים כדי לבסס שעון צירקדי ראשוני בזחלים. לאחר מכן, הזחלים מועברים למצב של חושך קבוע, המאפשר לשעון הצירקדי של הזחלים לפעול באופן חופשי.

בשלב ההזנה L3, הזחלים ממוינים לקבוצות כדי לבחון את העדפתם לאור בנקודות זמן שונות במחזור הצירקדי. התוצאות המתקבלות מראות העדפה מולדת וצירקדית לאור, המבוססת על חישוב מדד העדפה והשוואה בין נקודות זמן ובין קבוצות ניסוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבקרה המולדת והצירקדית של חישה של אור ועיבוד התנהגות פוטוית, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים כגון חוש ריח, טקסיס, כימוטקסיס ותרמותקסיס.

באופן דומה, ניתן להתאימו עבור מבחני למידה וזיכרון. את הפרוצדורה יעגילו אלינה ו-BMA עבור סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי לאסוף ביצים, יש לאפשר לזבובים בוגרים שהזדווגו להטיל ביצים במשך 12 שעות על מצע טרי, ולאחר מכן להעבירם לבקבוקוני זכוכית חדשים. יש להמשיך להעביר את הבוגרים בכל 12 שעות, במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך.

יש לשמור את איסופי הביצים של 12 השעות באינקובטור. עבור הניסוי, יש לגדל את בעלי החיים עד לשלב הלרווה L3 המוקדם. אלו הן לרוות ניזונות הזמינות בין 84 ל-108 שעות מההבקה.

קביעת שלב התפתחותי מדויק של LAE היא קריטית להצלחת הניסוי. החל משלב L3 המאוחר, ה-LAE שינה את ההתנהגות הפוטו-סנסורית. כדי לבחון רכיבים צירקדיים של התנהגות חזותית, 48 שעות לפני הבדיקה ורגע לפני השחר הסובייקטיבי של הלרוה, העבירו את הלרוה שנאספו לקופסת קרטון.

לאחר מכן, העבירו את הקופסה לאנקובטור בחושך קבוע למשך 48 שעות; עד לסיום הניסוי, על הזחלים להישאר ללא הפרעה במרחב הייעודי שלהם. הכינו את המכסה של צלחת פטרי בקוטר 9 cm באמצעות ריבוע של 20 cm המחולק לארבעה רבעים, שישמש כמדריך.

הדביקו ריבועי רדיד אלומיניום בגודל 10 סנטימטר בכל אחד משני רבעים נגדיים וכסו אותם בסרט דביק שחור. ודאו שאתם מכסים את שולי המכסה. לאחר מכן, הדביקו ריבוע בגודל 20 סנטימטר המחולק לארבעה רבעים מתחת למקור האור שעל השולחן.

סמנו את היקפה של צלחת הבדיקה על גבי הדף כדי שישמש כמדריך להעתקה עקבית. התקינו מנורת LED מעל צלחת הפטרי באמצעות מעמד תמיכה מברזל. כווננו את הגובה כך שכל צלחת הבדיקה תומאר באופן הומוגני.

כווננו את עוצמת התאורה באתר הבדיקה לטווח שבין 350 ל-760 luxe, על ידי כיוון נוסף של גובה המנורה או באמצעות ספק כוח מתכוונן. חדר הניסוי דורש תאורה באור אדום וחייב להיות בטמפרטורה זהה לזו שבה גודלו בעלי החיים. המבחנות גודלו במשך יומיים בתנאי חשיכה קבועים.

אספו את הלבה מתוך המזון באמצעות שפכטל משכבת חמשת המילימטרים העליונה של המזון. פזרו את המזון על הצד החיצוני של מכסה צלחת פטרי. הוסיפו מעט מים למזון וערבבו אותו בעדינות עם השפכטל.

הוסיפו טיפה של מי ברז לצלחית חדשה בעזרת מכחול. העבירו את הלרואות לטיפת המים כדי לשטוף אותן. לאחר מכן, השתמשו במכחול רטוב כדי לאסוף את הלרואות בעזרת המכחול הרטוב.

בחרו רק את ה larvae משלב L3 בתחילת תקופת ההאכלה והימנעו מ-larvae משלב L3 בשלב הנדודים המאוחר. העבירו את ה larvae שנבחרו למרכז של פלטת בדיקה. ל-larvae משלב L3 בתקופת ההאכלה יש sphericals קדמיים שהם פתוחים ובולטים כלפי חוץ.

בצורה דמוית אצבע. לכדורים האחוריים ישנם שלושה פתחים כל אחד וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק משתרעות עד למקטע הבטן השני.

לאחר שהנחת 30 זחלים במרכז פלטת הבדיקה, כסה אותה עם המכסה שהוכן. הדלק את נורת ה-LED. הפעל טיימר ואפשר לזחלים לנוע בחופשיות על הפלטה במשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסירו במהירות את המכסה וספרו את מספר הזחלים ברבעים החשוכים וברבעים המוארים. סימון המיקום של כל זחל עשוי להקל על הספירה. צילום מהיר יכול לסייע אף הוא. זחלים המראים העדפת אור לא ברורה, כגון זחלים הזוחלים על הדפנות או נקברים בתוך האגר, ייספרו כבעלי העדפה ניטרלית ויתווספו למספר הזחלים הכולל בעת חישוב מדד העדפת האור.

לאחר ספירת הזחלים, השליכו את הצלחת והשתמשו בצלחת בדיקה חדשה עבור הניסוי הבא. לאחר ביצוע 10 עד 15 חזרות עבור כל גנוטיפ, המשיכו בניתוח בהתאם לפרוטוקול. ההעדפה של זחלי Canton ES לאור או לחושך הושוותה בשני זמנים צירקדיים שונים.

ב-CT 0 וב-CT 12, באופן סובייקטיבי, זחלים של שחר ודמדומים גודלו במשך 48 שעות בתנאים סטנדרטיים ולאחר מכן הועברו לחשיכה קבועה למשך שלושה ימים. בדיקת אור-חושך תחת 350 luxe גילתה כי הרגישות הפוטית הייתה גבוהה יותר בזחלים שנבדקו ב-CT 0 בהשוואה לזחלים שנבדקו ב-CT 12. באמצעות נוסחה זו, העדפת החשיכה של זחלי CT 0 הייתה 0.52 לעומת 0.36.

השוואת המדדים של הזחלים ב-CT 12 באמצעות מבחן wilcoxon הניבה ערך P מובהק של 0.023. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון העדפת אור של זחלי troph בנקודות זמן ובמעגלים שונים לצורך מטרה זו. אתם תהיו מסוגלים לבצע סנכרון (entrain) של זחלי oph בשלב F3, לבחון את התנהגותם הפוטופובית ולחשב את מדד העדפת האור לצורך השוואה סטטיסטית.