Name: Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב דרוזופילה זחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: חקור התנהגות פוטית מולדת ומוסדרת מולדת בזחלי Drosophila באמצעות מבחן העדפות אור-חושך. שיטה זו מאפשרת חישוב מדד העדפות לניתוח השפעות קרקדיאניות על עיבוד חושי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לעמיתינו בחוג לביולוגיה, אוניברסיטת פריבורג לדיונים פוריים. אנו מודים למרכז מאגר בלומינגטון למתן מניות לעוף. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הקרן הלאומית למדע שוויצרי (PP00P3_123339) וקרן Velux לSGS

1. גידול הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לטוס זנים או צלבים גנטיים בתרבות המונים של 25 מעלות צלזיוס במדיום קמח תירס תחת אור של 12 שעות מחזור של 12 שעות חשכה בזבוב חממה מצויד באור ושעון עצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל שמרי תומכת במים ליצירת עיסה נוזלית (10 גרם של שמרי תומך מדוללים עם 3-4 מ&quot;ל מזוקק H 2 O). הוסף טיפה קטנה למזון קמח התירס ולכסות את הבקבוקונים. בואו יבש לשעה אחת לפחות, כדי למנוע זבובים בוגרים דבק דבק השמרים. לשים טיפה קטנה של שמרים מדוללים במים על פני השטח של המזון יכול לשפר את ההטלה. לחלופין, ניתן להשתמש בייקר שמרים להדביק, 20% חומצה אצטית (AcOH) (סיגמה אולדריץ, שוויץ A6283-100 מ&quot;ל). לשם כך, טובל את הקצה של Q-טיפ על הפתרון והמרווח על פני שטח מזון קמח התירס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים זבובים בוגרים (לפחות ארבעה ימים, אך לא יותר מעשרה ימים) בבקבוקוני מזון קמח תירס. שים מספיק מבוגרים לכל בקבוקון על מנת לקבל זחלים מספיק כדי לחזור על ההעדפהלבדוק כמה פעמים ולאפשר השוואה סטטיסטית. לצלבים גנטיים, אנו משתמשים בדרך כלל למינימום של 20 נקבות וזכרים 5-10 לכל בקבוקון, אבל כמה קווים דורשים יותר נקבות כדי להשיג צאצאי הזחל מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר למבוגרים להטיל ביצים ל12 שעות ולהעבירם לבקבוקונים חדשים. ניתן להעביר מבוגרים בבוקר ובערב. אנחנו בדרך כלל להעביר את המבוגרים במשך שבעה עד עשרה ימים, ואם נדרשו לקחת מבוגרים חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את אוספי הביצים שנלקחו בכל שעה 12 בחממה ולתת לגדול זחלים של 25 מעלות צלזיוס, חושך מחזור של 12 שעות אור 12 שעות ו 60% לחות. לבדיקת רכיבי היממה של זחלים חזותיים התנהגות מעבר לחשכה מתמדת (DD) 48 שעות לאחר איסוף ביצים (מקביל לשני מחזורי האור כהים). לשם כך, השתמש בחממה נפרדת בלי אור אבל לשמור על כל תנאים אחרים, כגון טמפרטורה ולחות זהה. הקפד להעביר את הבקבוקונים לחממת DD ממש לפני המעבר לשלב הכהה. לפני שעבר את הבקבוקונים לanothאה חממה לשים בקבוקונים בקופסא קרטון או לעטוף את הבקבוקונים עם רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור במהלך ההעברה (אריזה בקופסא קרטון או עטיפה שצריך לעשות בזמן &quot;כיבוי האורות בשלב&quot; לפני המשמרת בין חממות). למנוע את בעלי חיים מכל חשיפה לאור לאחר נקודה זו ועד תחילת ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים (84-108 שעות מהטלה) לאסוף מוקדם L3 (זחלי האכלה) בנקודות הזמן שנבדקה (ראה 4. אור העדפת בדיקה, נקודה. 4.4.). </li></ol> 2. התקנת מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים בחדר חשוך עם טמפרטורה קבועה ותנאי לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על שני רביעים של צלחת פטרי בחושך, לכסות את המכסה עם סרט שחור ורדיד אלומיניום. כדי לעשות זאת, סמן את מרכז היקף המכסה. גם לסמן ארבע נקודות בגבול של המכסה עם 90 מעלות של הפרדה ביניהם. כדי לעשות את זה קל יותר, לצייר ריבוע 20 ס&quot;מ מחולק לארבעה רבעים באורך 10 ס&quot;מ עלגיליון נייר או בעזרתו של מחשב. לחתוך 10 ס&quot;מ ריבועים של נייר אלומיניום וסרט שחור (איור 1 א). לכסות שני רביעים ההפך על ידי הדבקה של רדיד אלומיניום רבוע, כשכבה ראשונה וסרט שחור מכסה אותו, יש להיזהר גם כדי לכסות את הגבול של המכסה. בעבר שתי צורות מעט שונות של מבחני זה היו בשימוש. אנחנו כאן שימוש assay &quot;רבע הצלחת&quot;, שבו צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים שווים 10. ב assay האלטרנטיבי &quot;חצי הצלחת&quot; צלחת פטרי מחולקת חצי (חצי נחשף לאור, בחשכה) 1,7,8. עד היום לא נמצא הבדלים משמעותיים בין שני מבחני כבר פורסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק גיליון רבע כגון זה המשמש לסימון את המכסים ממש מתחת למקור האור על השולחן. סמן היקף של צלחת פטרי התרכזה בצומת הרביעים. השתמש בסימנים כהתייחסות למקום את צלחת המבחן תמיד באותה התנוחה מתחת למקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקןמנורה, או הנורה פשוט אור לבן (פיליפס, Softtone 5W) או מנורת LED (מנורת LED, 80012 הלבנה, Osram) מעל צלחת פטרי עם העזרה של דוכן תמיכת ברזל (פישר סיינטיפיק, S47808). התאם את הגובה באופן שכל מבחן הצלחת מוארת homogenously. אנו ממליצים בחום על השימוש בנורות LED שכן הם פולטים אורכי גל מסוימים יותר מנורות רגילות. יתר על כן נוריות פולטות פחות חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת אור בעזרת פוטומטר (סביבת מד PCE EM882). כדי להשיג את עוצמת האור הנדרשת של 350-760 לוקס, להזיז את המנורה כלפי מעלה או מטה בהתאם לצורך. חיבור המנורה לאספקת חשמל מתכווננת נותן יותר גמישות לשנות את העוצמות מבלי להזיז את המנורה (איור 1). </li></ol> 3. הכנת צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 200 מ&quot;ל של 2.5% אגר (סיגמא אולדריץ, שוויץ A5093-500G) עם מים מזוקקים פעמיים (Millipore). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות פטרי על שולחן (90 מ&quot;מ קוטר;גריינר ביו אחד GmbH, 4550 Kremsmeinster, אוסטריה) בשורות כדי לאפשר לשפוך חם agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את agarose במיקרוגל עד שהפתרון הוא שקוף לחלוטין ונוזלים. ודא שתמיסה נוזלית אינו מכילה בועות. זהירות: תחבורה בזהירות לשולחן מאז הפתרון יכול להיות חם מאוד! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חם agarose לתוך צלחות פטרי עד שכל המשטח מכוסה homogenously עם שכבה דקה של הפתרון, על שתיים או שלושה מילימטרים הם מספיק. להיות מהיר כדי למנוע agarose חיזוק לפני הציפוי את כל הצלחות. בואו הצלחות להתקרר. אחסן את הצלחות בטמפרטורת חדר ולהשתמש בם רק באותו היום של הכנה. </li></ol> 4. מבחן זיקה לאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בתנאי אור אדומים בחדר הניסוי כדי למנוע השפעת האור לפני המבחן מאז תסיסנית אינו מסוגל לחוש אורכי גל של אור אדום. השתמש בנורה אדומה (פיליפס, PFE712E * 8) עלתה במנורה כדי להאיר לאהוא מקום העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורה בכל הניסויים של 25 ° C. טמפרטורת חדר בקרה באמצעות מכשיר חימום או קירור במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קצת אוכל מהבקבוקונים שגדלו לשני מחזורי יום תחת חשכה מתמדת (מסעיף 1). מאז זחלים בדרך כלל חופרים על פני השטח של המזון, לקחת את השכבה העליונה (כ -5 מ&quot;מ עמוק) עם עזרה של מרית (פישר סיינטיפיק, 14-373-25A). מורחים את האוכל בצד החיצוני של המכסה צלחת פטרי, להוסיף קצת מים ומערבבים בעדינות בעזרת המרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף האכלת זחלי L3 ממזון. כהעדפת אור תיבחן, בחירה רק בתחילת / האכלת זחלי L3 הוא קריטי מאז Phototaxis השלילי מובטח. מאוחר / נדודי זחלי L3 או זחל גדול זוחלים על האוכל כנראה כבר עבר photobehavior שלהם. יכולים להיות מוכרים זחלי L3 האכלה (phototactic השלילי) כי spiracles הקדמי שלהם הם פתוח ובלט החוצה בצורה דמוית אצבע. Spiracle האחורייש שלושה פתחים של כל אחד, וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק להאריך למגזר השני 11 הבטן. Staging זחל תחת מיקרוסקופ הוא נוח ואילו אמור לשמש לא אור לבן. מנורת אור אדומה היא הכרחית כדי להאיר את הזחלים אם זמני תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לפני נדרשים ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף זחלים בקצרה במים ברז ולאסוף זחלים שלישי instar-האכלה המוקדמת (עדיין באור אדום). לפני העברת הזחלים לצלחת הבדיקה, לקחת את הזחלים עם מכחול רטוב ולספוג עודפי מים בזהירות במגבת נייר או נייר סינון. לא לייבש יתר על המידה זחלים מדי שכן הוא עלול לפגוע בבעלי החיים ולהשפיע על התנהגותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המכחול הרטוב להעביר את הזחלים בזהירות לצלחות. הנח קבוצה של כ 30 זחלים במרכז הצלחת. מכסה את הצלחת עם המכסה כבר מוכן עם הרבעים והניח את הצלחת מתחת למקור האור מוכן לניסוי (ראה שניותtion 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את מנורת האור הלבנה ולהתחיל את הטיימר. תן את הזחל לנוע בחופשיות על הצלחת למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר במהירות את המכסה ולספור את מספר הזחלים בחושך ובאור הרביעים. סימון המיקום של כל זחל עם סמן יכול להקל על הספירה. לחלופין לקחת תמונה של הצלחת ולספור בדיעבד. זחלים מראים העדפה ברורה אור, כמו זחלים זוחלים על הקירות או מתחפרים לתוך אגר צריכים להיחשב כהעדפה ניטראלית ופשוט להיכלל במספר הכולל של זחלים כאשר מדד העדפת האור מחושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספירה, לבטל את הצלחת עם זחלים ולהחליף עם צלחת בדיקה חדשה לניסוי הבא. לאסוף צלחות בשימוש בשקית פלסטיק חיטוי לטיפול וסילוק מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבצעת מספר מספיק של ניסויים ניתן נבדקו גנוטיפ חדש. 10-15 ניסויים לגנוטיפ מספיקים לניתוח. </li></ol> 5. ניתוח נתוניםשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוחיותך להעביר את הנתונים לגיליון נתונים כמו אקסל (Microsoft) או מקור (מעבדה מקור) במחשב לניתוח סטטיסטי נוסף. סדר בעמודה אחת את מספר בעלי החיים בחשכה, בעמודה שנייה את מספר בעלי החיים ברביעי אור ובשלישי הכולל של בעלי חיים בצלחת (כולל זחלים &quot;ניטראלי&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מדד ההעדפה (PREF) לחושך עבור כל ניסוי תוך שימוש בנוסחה הבאה: PREF (חושך) = (כמות זחלים בחושך - מספר הזחלים באור) / מספר כולל של זחלים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות סטטיסטי קבוצה של נתונים עם ניתוח מתאים לקבוצות. כאן, אנו משתמשים במבחן Wilcoxon להשוות סטטיסטי בין שתי קבוצות. מבחן ANOVA מרובה עם ההשוואה של טיוקי בדיעבד ניתן לעשות בדיקה, אם הנחת התפלגות נורמלית מתקיימת בהשוואת קבוצת סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הגרפים שמראים באופן ברור השוואות בין קווים ונקודות זמן לאורך מחזור היום. Wתוכנת מקור שימוש בדואר (מעבדת מקור) כדי לבדוק את המובהקות סטטיסטיות וליצור גרפים מתאימים, אבל בכל תוכנה סטטיסטית אחרת יכולה להיות מועילה. </li></ol>

<ol><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li>
<li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors%3A+unconventional+ways+of+seeing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li>
<li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li>
<li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li>
<li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smellblind%3A+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li>
<li>Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodenstein%2C+D+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPittendrigh%2C+CS+%22Biological+Rhythms%22">Biological Rhythms</a>. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).</li>
<li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+Activity+between+LN%28v%29s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בדיקת העדפת האור תאר מנצלת photobehavior מולדת הזחל. Assay קל להקים, מאפשר חזרות רבות בעלות נמוכה ומספק מידע רב ערך על חישת אור ועיבוד. פרדיגמה הניסויית מאפשרת כימות מהירה יחסית של כמה אנשים מעדיפים אור או חושך. העדפה כזו יכולה להיות מוצגת כאחוזים גולמיים או לחלופין כמדד העדפות (PREF). PREF מתבטא בהבדל של בעלי חיים שאור מועדף ובעלי החיים שחושך מועדף מחולק בסכום הכולל של בעלי חיים. נקודה מכרעת למבחן העדפת האור היא...

כאן אנו מתארים assay התנהגותית המבוסס על העדפת הזחל לכהה (או בהיר). זחלים להגיב עם תגובת photonegative חזקה וסטריאוטיפית בשלבי ליקוט (L1 לתחילת L3) 1. Assay נועד להעריך את התנהגות photophobic של הזחל ומשווה את ההעדפה בהירה או כהה של קבוצה של זחלים לנוע בחופשיות בצלחת פטרי מצופה באגר. assay התנהגותי זה מספק מידע על רגישות, אינטגרציה וזמן הפלסטיות של מערכת הראייה לא רק, זה עוד יותר מספק רמזים על איך רגישות לאור והתהליך שלה נשלט על ידי מערכת היממה. עין הזחל דרוזופילה (Bowlig איברים מכונים גם: BO), היא האיבר העיקרי לתפיסת אור. כל עין מורכבת מקולטנית אור 12 (PR), שמונה הפורטוריקנים להביע rhodopsin6 הירוק רגיש (RH6) וארבעה הפורטוריקנים להביע rhodopsin5 הכחול הרגישים (rh5) 2,3. בנוסף לPRS, alsנוירונים o Class IV multidendritic, אשר מכסים את קיר גוף הזחל, זוהו להגיב לעוצמות אור רעילים 4,5. כמו כן, ידוע כי נוירונים קוצבים לב הנמצאים במוח הזחל המרכזי להביע רגיש חלבון Cryptochrome האור (Cry) שפועל כחיישן אור כחול שעון פנימי בתוך המוח 6,7. מסקרן photophobicity של בעלי חיים מסוג בר מציג מרכיב ביולוגי בנקודות זמן שונות במהלך היום ובלילה בעת בדיקה עם assay זה. תגובות לאור של זחל L3 ליקוט הראו photophobicity החזק עם שחר וphotophobicity נמוך יותר בשעה בין הערביים, כאשר נבדקו על העדפת אור בחושך 7. מעניין רק Rh5-הפורטוריקנים נדרשים להימנעות אור, ואילו RH6-הפורטוריקנים הם מיותר. שניהם, Rh5-הפורטוריקנים וRH6-הפורטוריקנים מעורבים באיפוס השעון המולקולרי על ידי אור 8. מסלול Cry חייב להיות מתואם עם מסלולי אור חישה-האחרים לתזמר פלט התנהגותי מתאים בבמהלך היום. אצטילכולין בהפורטוריקנים ממלא תפקיד חיוני בהתנהגות הימנעות אור, כמו גם מחדירה של השעון המולקולרי. חסימה עצבית אצטילכולין מהפורטוריקנים לנוירונים קוצב היממה מפחיתה את תגובת photophobic בassay העדפת אור החושך 8. העסקתו assay, שני זוגות סימטריים של נוירונים שזוהו לאחרונה כדי לעבור את העדפת האור של הזחל instar השלישי של דרוזופילה 9. שני זוגות אלו של נוירונים ניתן לתפקד בשלבי זחל מאוחרים, כאשר בעלי חיים להשאיר את האוכל למצוא אתר מתאים pupariation ככל הנראה. עם זאת, השאלה של איך את מסלולי ויזואליים אינטראקציה ולשלוט בהתנהגות חזותית הזחל באופן היממה נותרה במידה רבה ללא מענה. Assay העדפת האור מאפשר השוואות בין נקודות זמן היממה, לטוס קווים ומדינת היממה תחת איכויות אור שונות. Assay הוא קלות מוכן ולא יקר וכבר שימושי בעבר אניn כמה מעבדות לתאר וללמוד את ההתנהגות נגזרת אור בזחל.

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5093-500G</td><td>2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, שוויץ </td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>קוטר 90 מ"מ; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, אוסטריה</td></tr><tr><td>מנורת LED</td><td>OSARAM</td><td>80012 מנורת LED לבנה</td><td>, 80012</td></tr><tr><td>מד סביבה</td> לבן <td>PCE PCE</td><td>EM882</td><td>Lux, Temp, RH%</td></tr> <tr><td>ארון תרמוסטטי</td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td> <td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>טיימר טיימר אור</td><td>T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (בדוק מפרט עבור המדינה שלך)</td></tr> <tr><td>אוניברסלי תרמוסטט</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אדים</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balck קלטת</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 ס"מ </td></tr><tr><td>דבק</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנורת חממה</td><td>פיליפס</td><td>Softtone</td><td>5W</td></tr><tr><td>שעון טיימר</td><td>זיליס זיליס,</td><td></td><td>שוויץ</td></tr><tr><td>תוכנת אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>אקסל</td></tr><tr><td>מקור תוכנה 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer שמרים</td><td>Migros שוויץ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעמד תמיכת ברזל 17X28CM</td><td>פישר מדעי</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A6283-100 מ"ל</td><td>20% חומצה אצטית מדוללת ב<תת>2O</td></tr><tr><td>מנורת אור אדום</td><td>פיליפס</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>מרית </td><td>פישר מדעי</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>אופציונלי</td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>Prix לול</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דוד</td><td>GOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגל תנור</td><td>אינטרטרוניק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קמח תירס סטנדרטי מזון</td><td></td><td></td><td></td>זבוב</tr><tr><td>מים </td><td>מזוקקים</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay העדפות אור לחקר photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

מעשי אור כאות סביבתית לשלוט בהתנהגות בעלי חיים ברמות שונות. מערכת העצבים תסיסנית הזחל משמשת כמודל ייחודי כדי לענות על שאלות בסיסיות על האופן בו מידע מעובד ואור משותף בין התנהגויות מהירות ויממה. זחלים תסיסנית להציג התנהגות הימנעות סטריאוטיפית בעת חשיפה לאור. כדי לחקור התנהגויות האור תלויות יכולות להיות מיושמות בדיקות בכורה אור כהות comparably פשוטות. בבעלי חוליות ופרוקי רגלי המסלולים העצביים המעורבים בחישה ועיבוד תשומות חזותיות חופפים באופן חלקי עם מידע היממה photic אלה עיבוד. השאלה המרתקת של איך מערכת חישת האור ומערכת היממה אינטראקציה כדי לשמור על תפוקות התנהגות מתואמות נשארה במידה רבה שלא נחקר. דרוזופילה היא מודל משפיע ביולוגי לגשת לשאלות אלה, בשל מספר קטן של תאי עצב במוח ובזמינות של כלים גנטיים לmanipul העצביation. Assay העדפת אור האפל הציג מאפשר החקירה של מגוון רחב של התנהגויות חזותיות כולל בקרה ביולוגי של Phototaxis.

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, בדקנו העדפת אור בחושך באצטדיון הזחל שלישי המוקדם של סוג בר קנטון-S טסה בשתי פעמים Ct0 וCT12 שונות היממה. מבוגרים גודלו 12 שעות אור 12 שעות חושך והשאירו להטיל ביצים עבור 12 שעות. זחלים לגדול ביומיים הראשונים תחת אותו משטר אור בחושך. מכיוון שאנו רוצים לבדוק אפנון היממה בתנאים קבועים (ריצה ללא שעון הביולוגי), זחלים שלאחר מכן הועברו לחשכה מתמדת במשך שלושת הימים הבאים עד לביצוע בדיקה (איור 3 א). <p class="jove_content" style=";text-alig...

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את התנהגות התאורה המולדת והצירקדית של זחלי דרוזופילה באמצעות מבחן העדפה לאור וחושך. זאת מושג תחילה על ידי גידול הזחלים הניסיוניים תחת תנאי אור וחושך מוגדרים כדי לבסס שעון צירקדי ראשוני בזחלים. לאחר מכן, הזחלים מועברים למצב של חושך קבוע, המאפשר לשעון הצירקדי של הזחלים לפעול באופן חופשי.בשלב ההזנה L3, הזחלים ממוינים לקבוצות כדי לבחון את העדפתם לאור בנקודות זמן שונות במחזור הצירקדי. התוצאות המתקבלות מראות העדפה מולדת וצירקדית לאור, המבוססת על חישוב מדד העדפה והשוואה בין נקודות זמן ובין קבוצות ניסוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבקרה המולדת והצירקדית של חישה של אור ועיבוד התנהגות פוטוית, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים כגון חוש ריח, טקסיס, כימוטקסיס ותרמותקסיס.באופן דומה, ניתן להתאימו עבור מבחני למידה וזיכרון. את הפרוצדורה יעגילו אלינה ו-BMA עבור סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי לאסוף ביצים, יש לאפשר לזבובים בוגרים שהזדווגו להטיל ביצים במשך 12 שעות על מצע טרי, ולאחר מכן להעבירם לבקבוקוני זכוכית חדשים. יש להמשיך להעביר את הבוגרים בכל 12 שעות, במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך.יש לשמור את איסופי הביצים של 12 השעות באינקובטור. עבור הניסוי, יש לגדל את בעלי החיים עד לשלב הלרווה L3 המוקדם. אלו הן לרוות ניזונות הזמינות בין 84 ל-108 שעות מההבקה.קביעת שלב התפתחותי מדויק של LAE היא קריטית להצלחת הניסוי. החל משלב L3 המאוחר, ה-LAE שינה את ההתנהגות הפוטו-סנסורית. כדי לבחון רכיבים צירקדיים של התנהגות חזותית, 48 שעות לפני הבדיקה ורגע לפני השחר הסובייקטיבי של הלרוה, העבירו את הלרוה שנאספו לקופסת קרטון.לאחר מכן, העבירו את הקופסה לאנקובטור בחושך קבוע למשך 48 שעות; עד לסיום הניסוי, על הזחלים להישאר ללא הפרעה במרחב הייעודי שלהם. הכינו את המכסה של צלחת פטרי בקוטר 9 cm באמצעות ריבוע של 20 cm המחולק לארבעה רבעים, שישמש כמדריך.הדביקו ריבועי רדיד אלומיניום בגודל 10 סנטימטר בכל אחד משני רבעים נגדיים וכסו אותם בסרט דביק שחור. ודאו שאתם מכסים את שולי המכסה. לאחר מכן, הדביקו ריבוע בגודל 20 סנטימטר המחולק לארבעה רבעים מתחת למקור האור שעל השולחן.סמנו את היקפה של צלחת הבדיקה על גבי הדף כדי שישמש כמדריך להעתקה עקבית. התקינו מנורת LED מעל צלחת הפטרי באמצעות מעמד תמיכה מברזל. כווננו את הגובה כך שכל צלחת הבדיקה תומאר באופן הומוגני.כווננו את עוצמת התאורה באתר הבדיקה לטווח שבין 350 ל-760 luxe, על ידי כיוון נוסף של גובה המנורה או באמצעות ספק כוח מתכוונן. חדר הניסוי דורש תאורה באור אדום וחייב להיות בטמפרטורה זהה לזו שבה גודלו בעלי החיים. המבחנות גודלו במשך יומיים בתנאי חשיכה קבועים.אספו את הלבה מתוך המזון באמצעות שפכטל משכבת חמשת המילימטרים העליונה של המזון. פזרו את המזון על הצד החיצוני של מכסה צלחת פטרי. הוסיפו מעט מים למזון וערבבו אותו בעדינות עם השפכטל.הוסיפו טיפה של מי ברז לצלחית חדשה בעזרת מכחול. העבירו את הלרואות לטיפת המים כדי לשטוף אותן. לאחר מכן, השתמשו במכחול רטוב כדי לאסוף את הלרואות בעזרת המכחול הרטוב.בחרו רק את ה larvae משלב L3 בתחילת תקופת ההאכלה והימנעו מ-larvae משלב L3 בשלב הנדודים המאוחר. העבירו את ה larvae שנבחרו למרכז של פלטת בדיקה. ל-larvae משלב L3 בתקופת ההאכלה יש sphericals קדמיים שהם פתוחים ובולטים כלפי חוץ.בצורה דמוית אצבע. לכדורים האחוריים ישנם שלושה פתחים כל אחד וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק משתרעות עד למקטע הבטן השני.לאחר שהנחת 30 זחלים במרכז פלטת הבדיקה, כסה אותה עם המכסה שהוכן. הדלק את נורת ה-LED. הפעל טיימר ואפשר לזחלים לנוע בחופשיות על הפלטה במשך חמש דקות.לאחר מכן, הסירו במהירות את המכסה וספרו את מספר הזחלים ברבעים החשוכים וברבעים המוארים. סימון המיקום של כל זחל עשוי להקל על הספירה. צילום מהיר יכול לסייע אף הוא. זחלים המראים העדפת אור לא ברורה, כגון זחלים הזוחלים על הדפנות או נקברים בתוך האגר, ייספרו כבעלי העדפה ניטרלית ויתווספו למספר הזחלים הכולל בעת חישוב מדד העדפת האור.לאחר ספירת הזחלים, השליכו את הצלחת והשתמשו בצלחת בדיקה חדשה עבור הניסוי הבא. לאחר ביצוע 10 עד 15 חזרות עבור כל גנוטיפ, המשיכו בניתוח בהתאם לפרוטוקול. ההעדפה של זחלי Canton ES לאור או לחושך הושוותה בשני זמנים צירקדיים שונים.ב-CT 0 וב-CT 12, באופן סובייקטיבי, זחלים של שחר ודמדומים גודלו במשך 48 שעות בתנאים סטנדרטיים ולאחר מכן הועברו לחשיכה קבועה למשך שלושה ימים. בדיקת אור-חושך תחת 350 luxe גילתה כי הרגישות הפוטית הייתה גבוהה יותר בזחלים שנבדקו ב-CT 0 בהשוואה לזחלים שנבדקו ב-CT 12. באמצעות נוסחה זו, העדפת החשיכה של זחלי CT 0 הייתה 0.52 לעומת 0.36.השוואת המדדים של הזחלים ב-CT 12 באמצעות מבחן wilcoxon הניבה ערך P מובהק של 0.023. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון העדפת אור של זחלי troph בנקודות זמן ובמעגלים שונים לצורך מטרה זו. אתם תהיו מסוגלים לבצע סנכרון (entrain) של זחלי oph בשלב F3, לבחון את התנהגותם הפוטופובית ולחשב את מדד העדפת האור לצורך השוואה סטטיסטית.

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים נוהלי רישום פעילות של תנועה יומי של...

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

זחלי דרוזופילה רגישים לאור ומגיבים לשינויים באור שמסביב. סרטון זה מתאר בדיקה הבדוקה את יכולתם להימנע מאור, הנקראת בדיקת נקודת האור. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר את התסעפות עם נורית אור כחול ומראה כיצד לתעד את התנהגות החיה בתגובה למפגש האור.

אור ספוט Assay: שיטה לחקור התנהגות פוטוטאקטית Drosophila

סרטון זה מדגים את גידולו של Drosophila melanogaster בתנאי אור ספציפיים כדי לחקור את תפקידם של חלבוני Bruchpilot בשחרור מוליכים עצביים ואת המודולציה הנובעת מכך של פעילות סינפטית.

אפנון סינפטי בדרוזופילה לאחר חשיפה לאור ממושך

פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת העדפות הטלת ביצים של Drosophila melanogaster ברזולוציה של בעל חיים יחיד.  בדיקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לזיהוי גנים ורכיבי מעגלים השולטים בתהליך קבלת החלטות פשוט.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

כאן, אנו מפרטים כיצד לסנכרן את דרוסופילה ליום ביולוגי. זהו הצעד הראשון והחשוב ביותר הנחוץ ללימוד מקצבים ביולוגיים ותרונוביולוגיה.

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך תא תצפית התנהגות Drosophila מבוגר פשוט, וכיצד לצלם בהבחנה גבוהה / קטעי וידאו של המורפולוגיה או התנהגות של סוגים שונים של זבובי פירות בתא התצפית באמצעות שיטות פשוטות יחסית ובמחיר סביר.

מערכת הדמיה מתכווננת בחדות גבוהה למחקרים התנהגותיים של מבוגרים Drosophila

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

חקור התנהגות פוטית מולדת ומוסדרת מולדת בזחלי Drosophila באמצעות מבחן העדפות אור-חושך. שיטה זו מאפשרת חישוב מדד העדפות לניתוח השפעות קרקדיאניות על עיבוד חושי.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב

גלה סרטונים נוספים