תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע תיוג ImmunoGold כדי לקבוע את הלוקליזציה האולטרה-מבנית של חלבונים סינפטיים בנוירונים פרמטאליים בהיפוקמפוס של חולדות. זה מושג על ידי הסרת ה-CA אזור אחד של הפרוסה האורגנוטיפית, חיתוך הפינה העליונה כדי לזכור את הכיוון הנכון ודגירה שלו בקיבוע נטול אוסמיום על קרח. השלב השני הוא לייבש את הרקמה הקבועה ולאפשר לה להתקשות על ידי חדירה אליה עם שרף.

לאחר מכן, חלקים דקים במיוחד נחתכים מרקמות המוטבעות בשרף, והם מונחים על רשתות ניקל. השלב האחרון הוא ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמות החתך. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני משמש לקביעת לוקליזציה של חלבונים בסינפסה. בסדר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפלסטיות הסינפטית, כגון כיצד לוקליזציה של חלבונים בתוך קוצים דנדריטיים יכולה לעזור להבין את תפקידם בתפקוד הסינפטי. למרות ששיטה זו מותאמת לפרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות, היא יכולה להיות בעלת ערך עצום גם עבור תכשירים עצביים אחרים, כולל פרוסות מוח חריפות ותרביות עצביות ראשוניות. התחל הליך זה על ידי הנחת פרוסת ההיפוקמפוס האורגנוטיפית לתוך צלחת פטרי פוליסטירן המכילה את מאגר הפוספט של סורנסן קר כקרח.

הוסף עוד מיליליטר עד שניים של חיץ קר כקרח ישירות על גבי הפרוסות. על מנת לבודד את תת-השדה של ה-CA אחד של הפרוסה, השתמש באזמל חד פעמי כדי לחתוך בעדינות את הפרוסה ליד הפיתול המשונן, המקביל לשכבת התא האחד של CA. לאחר מכן חתוך את הפרוסה הנותרת אנכית כדי להסיר את תת-השדה CA 3 ואת הסולו.

לאחר מכן, חתכו פינה של פרוסת CA One כדי לסייע בזיהוי המשטח העליון של הרקמה והסירו בזהירות את הרקמה מהממברנה באמצעות הצד האחורי של האזמל. העבירו בעדינות את הרקמה לצלחת של 12 בארות המכילה את המאגר של סורנסן קר כקרח. הסר את המאגר והוסף 0.5 עד מיליליטר אחד של קיבוע קר קרח ב-pH 7.3 מדולל במאגר של סורנסן כך שיכסה כראוי את הדגימה.

לאחר מכן דגרו במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוציאו את הקיבוע מהבאר ושטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך 20 דקות במאגר של סורנסן קר כקרח. לאחר מכן דגרו את הדגימה במשקל חומצה טאנית של 1% לנפח במאגר מלאט מולארי של 0.1 ב-pH של 6.0.

לאחר 40 דקות, שטפו את החומצה הטנית על ידי שטיפת הדגימה פעמיים למשך 20 דקות במאגר המלאט. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 40 דקות ב-1% אצטט שתן במאגר מלאט אצטט משתנה רגיש לאור ורדיואקטיבי. אז טפלו בזהירות והניחו את הדגימה בחושך בארבע מעלות צלזיוס במהלך הדגירה.

לאחר הדגירה, שטפו את הדגימות פעמיים במשך 20 דקות כל אחת במאגר מלאט קר כקרח, ולאחר מכן דגרו במשך 20 דקות ב-0.5% פלטינה כלוריד במאגר אסירים. לבסוף, שטפו את שאריות הפלטינה כלוריד על ידי שטיפה פעמיים למשך 20 דקות. כל מאגר אסיר מאחסן את הדגימות במאגר מלאט בארבע מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להמשך עיבוד.

כדי להתחיל באימונוהיסטוכימיה, אזורי ה-CA one הקבועים מוטבעים תחילה בשרף מיובש ונחתכים כדי לקבל מקטעים דקים במיוחד של 60 ננומטר על רשתות ניקל כמתואר בפרוטוקול הטקסט לסרטון זה. לאחר מכן הניחו טיפה של 1% מאגר פוספט 20 ב-pH 7.5 על פיסת פרפורם נקי. לאחר מכן הרם בעדינות את הרשת בעזרת מלקחיים נקיים וצף אותה על המאגר כשהחלק כלפי מטה דגור כך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, מסנן עודפי נוזלים מהרשת על ידי הנחת החלק כלפי מעלה על נייר סינון.

כמו כן, הסר כל תמיסה הכלואה בין זרועות מלקחיים EM על ידי פתילה עדינה עם רסיס נייר סינון תוך הקפדה על החלקים לא להתייבש לחלוטין. לאחר מכן הניחו טיפה של 50 מילי-מולרי גליצין על סרט הפרה וצפו את קטע הרשת כלפי מטה על תמיסת הגליצין בטמפרטורת החדר. בזמן שהדגימה דוגרת במשך 15 דקות, הוסף 2.5% סרום מהחיה של הנוגדן המשני לתמיסה של 2.5% של BSA והניח טיפה מתערובת זו על סרט הפרה.

לאחר הדגירה של 15 דקות, יבש את הרשת בנייר פילטר וצף על תמיסת החסימה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הכינו את תא הדגירה על ידי הנחת מגבוני קים מגולגלים לאורך החלק הפנימי של צלחת פטרי פלסטיק נקייה. מניחים חתיכת פרם נקי במרכז צלחת הפטרי ולאחר מכן מוסיפים מים מסוננים למגבוני קים.

לאחר מכן, הניחו טיפה מתמיסת הנוגדנים העיקרית על הפרפורם והציפו עליו את הדגימה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, יש לקבוע בניסוי את הזמן והטמפרטורה האופטימליים של הדגירה כמו גם את ריכוז הנוגדנים. לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, שטפו את הרשת שלוש פעמים למשך שתי דקות כל אחת עם מאגר פוספט של 1%. לאחר מכן דגרו עם נוגדן משני באמצעות 1 עד 20 אנטי ארנב או אנטי US, יחד עם זהב של 10 ננומטר לאחר שעה.

בטמפרטורת החדר יש לשטוף שלוש פעמים במשך שתי דקות כל אחת עם 1% מאגר פוספט 1%. לאחר מכן יש לתקן את הדגימה ב-2% גלוטרלדהיד חוצץ למשך חמש דקות. הסר עודפי אלדהיד גלואר על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 1% טווין, 20 מאגר פוספט, ולאחר מכן שלוש פעמים עם שטיפה במים מסוננים במשך שתי דקות בכל פעם.

לאחר השטיפה, יש לדגור על הרשת באצטט משתנה של 2% למשך 10 דקות. במהלך הדגירה, הכינו תא נטול CO2 על ידי הנחת חתיכת פרפורם במרכז צלחת פטרי מזכוכית. לאחר מכן הניחו 10 עד 15 כדורים של נתרן הידרוקסיד בצלחת סביב הפרפורם כדי לספוג CO2 באוויר.

שמור את החלק העליון סגור למספר דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה מרעה והעביר במהירות נפח קטן של תמיסת ציטראט עופרת ריינולדס שהוכנה לאחרונה לפרפורם. פתח את החלק העליון מספיק כדי להכניס את פיפטת המרעה כדי למזער את החדרת ה-CO2 מחדש לתא.

בשלוש כוסות קטנות, הכינו מים חמים טריים נטולי יונים, שטפו את אצטט המשתנה על ידי טבילת הרשת במקור הראשון וסובבו אותה בעדינות למשך 30 שניות. חזור על שלב זה בשתי הכוסות האחרות. לאחר השטיפה, פתח את החלק העליון של צלחת פטרי הזכוכית מספיק כדי להניח את הרשת על טיפת תמיסת ציטראט העופרת של ריינולדס.

במידת האפשר, חבשו מסכה בזמן שאתם עושים זאת כדי להימנע מנשימה על ציטראט עופרת וכדי למנוע היווצרות משקעים. לאחר 10 דקות, פתח מעט את החלק העליון והסר את הרשת. שטפו אותו שלוש פעמים על ידי טבילתו ברצף בשלוש כוסות טריות של מים מזוקקים חמים.

לאחר מכן הניחו לרשת להתייבש על פיסת נייר סינון למעלה. הדגימה מוכנה כעת לצפייה במיקרוסקופ אלקטרונים קטעי רקמה דקים במיוחד של האזור האחד של ההיפוקמפוס המוצגים כאן כמיקרוגרף אלקטרונים שידור מכילים דנדריטים ועמודי שדרה הניתנים להבחנה בקלות של נוירונים פרמטאליים. זיהוי סינפסות אסימטריות בין מסוף אקסונלי המסומן ב-T לבין קוצים דנדריטיים המסומנים ב-S מקל על ידי נוכחות של צפיפות פוסט-סינפטית וממברנת פלזמה מוגדרת היטב.

ניתן לראות את התפלגות הנוירו-גרנדין בקוצים דנדריטיים בעזרת תיוג ImmunoGold EM ומודגשת בתמונות TEM אלה על ידי החצים. ניתן למדוד את המרחק הרדיאלי של נוירוגרנדין ממרכז עמוד השדרה לקרום הפלזמה של עמוד השדרה כמרחק הרדיאלי המנורמל. מרחק של אפס מתאים לחלקיק המונח על הממברנה, וערך מרחק של אחד מייצג חלקיק במרכז עמוד השדרה.

לאחר מכן ניתן להציג את המרחק של נוירו-גרנדין לעמוד השדרה הדנדריטי בצורה גרפית. כאן ההתפלגות שלו כמרחק רדיאלי מנורמל מוצגת בכחול, ובהשוואה להתפלגות אקראית המוצגת בוורוד, גרף זה מראה כי נוירו-גרנדין ממוקם קרוב לקרום הפלזמה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים החוקרים את מערכת העצבים לחקור לוקליזציה והפצה של קולטנים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים, טרנספורטרים ותעלות יונים, ורבים אחרים ברקמות מוח שונות, כולל קליפת המוח, התלמוס, פקעת הריח והמוח הקטן.

אל תשכח שעבודה עם מקבעים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה וטיפול בקיבעים במכסה המנוע בעת ביצוע הליך זה.