שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים בvivo

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפעיל או להשתיק במהירות אוכלוסיות עצביות מוגדרות גנטית בטווח זמן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. זה מושג על ידי העברת וקטור ויראלי הנושא טרנסגנים המקודדים את נוירון האור הכחול המפעיל את אופסין הערוץ או נוירון אור ירוק משתיק אופסין הול לנוירונים מוגדרים גנטית. כשלב שני, נבנה כביש פולט אור המורכב מסיב אופטי המוצמד לאלקטרודה הקלטה, המאפשר העברת אור והקלטה חשמלית בו זמנית.

לאחר מכן, ה-TRO ממוקם ומוריד לאזור המוח המומר של Opsin. על מנת לעורר תגובות מתווכות של ערוץ אופסין והא אופסין, מתקבלות תוצאות המראות הפעלה ועיכוב המושרה על ידי אור של נוירונים מתמרים של ערוץ אדום והאלין בהתבסס על טכניקת הקלטת יחידה אחת המאפשרת הקלטה של נוירונים בודדים. שיטה זו עונה על צורך בסיסי במדעי המוח בכך שהיא מאפשרת לנו לקבוע בדיוק עד כמה אור יכול להיות יעיל בהנעת פעילות עצבית ברזולוציה של אלפית שנייה ובתת-סוגים עצביים ספציפיים ולהדגים זאת יהיה צ'ין נקמורה.

פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי מבטיח כי נהלי הבטיחות הביולוגית ברמה 1 מבוצעים בעת ההכנה והטיפול בנגיף, וכי כל ההנחיות המקומיות והממשלתיות הנוגעות לבעלי חיים נשמרות. לפני הזרקה סטריאוטקטית, אפשר לחלק מהנגיף להפשיר על קרח ואז להסתובב לזמן קצר. בצנטריפוגה ספסלית, מלאו לאט מזרק זכוכית ומחט של המילטון בכמות קטנה של סיליקון או שמן מינרלי.

ודא שאין בועות אוויר גלויות בחבית המזרק. הכנס את המזרק למשאבת מיקרו מזרק והצמד את המשאבה ישירות לזרוע הסטריאוטקסית האנכית. לאחר הכנסת צינור האליקוט של הנגיף למצב יציב, הורד את הזרוע הסטריאוטקסית עד שקצה המחט נוגע בתחתית צינור האליקוט של הנגיף.

השתמש בבקר של משאבת הזרקת המיקרו כדי למשוך את נפח הנגיף הרצוי. לאחר הרדמת חולדה עם קטמין וקסילזין, בדוק את תגובת הרפלקס לצביטה בבוהן כדי להבטיח עומק הרדמה הולם בשיטות אספטיות סטנדרטיות. הנח את החיה במנגנון סטריאוטקסי לאחר ביצוע חתך בקו האמצע דרך העור על גבי גולגולת החיה בעזרת מספריים כירורגיים קטנים או אזמל.

הפרד בעדינות את רקמת החיבור ונקה את החלק העליון של הגולגולת בעזרת מגרד עצם קטן. הורד את המחט וודא שקואורדינטות ה-Z עבור bgma ו-lambda שוות כדי לקבוע שהראש ישר. לאחר מכן הזיזו את הזרוע הסטריאוטקסית לקואורדינטות המתאימות למבנה המוח המעניין.

סמן את מקום ההזרקה המיועד בעט כירורגי. השתמש במקדחה ידנית כדי לדלל בזהירות את הגולגולת מעל אזור המטרה. עצור כאשר המקדח מגיע לתחתית הגולגולת והשתמש בזוג מלקחיים עדינים במיוחד כדי להסיר את העצם הדלילה.

לאחר חשיפת הדורה יש למקם את מחט המזרק מעל אזור המטרה ולהוריד את המחט עד שהיא נוגעת בדורה. והשתמש בנקודה זו כדי לחשב את ה-z. קואורדינטות עכשיו לאט מאוד הורידו את מחט ההזרקה לתוך המוח עד שתגיעו למיקום ה-Z הנכון.

בפרוטוקול זה, האזור הקדם-לימבי של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ממוקד. להזריק את הנגיף בקצב של 0.1 מיקרוליטר לדקה. לאחר השלמת ההזרקה, המתן 10 דקות לפני הוצאת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת של הנגיף אל פני המוח.

לאחר שימוש בתפר תפירה עם מחט מחוברת לאיטום העור, מרחו אנטיביוטיקה על הפצע. ראשית, חבר אלקטרודת טונגסטן של 1 עד 1.5 מגה אוהם לצינור נימי זכוכית באמצעות דבק-על. לאחר מכן השתמש בכלי הפשטת סיבים כדי לחשוף את הקצה החשוף של סיב אופטי רב-מצבי ולנקות את קצה הסיבים באתנול קלות מאוד.

קלעו את קצה הסיבים בעזרת סכין יהלום בצורת טריז והשתמשו במלקחיים עדינים כדי להסיר בזהירות את עודפי הסיבים. הסיב אמור להיבקע בקלות בציון. השתמש במד כוח אופטי כדי למדוד את עוצמת הלייזר בקצה הסיב האופטי.

עבור הקלטות in vivo, עוצמת אור של 20 עד 100 מילי-וואט למילימטר רבוע יכולה לעורר באופן אמין הפעלה או השתקה בתיווך ערוץ אדום או האלין בהתאמה של פעילות עצבית. לאחר מכן, הכנס את הסיב האופטי לצינור הנימים. מקם את קצה הסיב כ -500 מיקרון מעל קצה אלקטרודת הטונגסטן וקשר חוט תפר דק פעמיים בכמה נקודות ליד הקצה כך שהאלקטרודה והסיב יהיו ישרים.

ודא שהמרחק בין קצה האלקטרודה לקשר הקרוב ביותר ארוך מספיק להכנסה לאזור המטרה כפי שניתן לראות כאן. הכינו את החיה לניתוח כמו קודם. לאחר מכן השתמש בגולגולת הראשונית כמדריך ליצירת חלון חדש, נקי וקטן בגולגולת.

למיקום הטרו. השתמש במחט דקה כדי לבצע חתך קטן על הדורה. הורד בזהירות את ה-TRO דרך חלון הגולגולת לתוך המוח לאזור המומר באמצעות מניפולטור מיקרום.

לאחר מכן התקדמו בשטח לאט בצעדים של 10 עד 50 מיקרון עד להופעתו של תא מגיב לאור. כאן, ממשק משתמש תוכנה מותאם אישית שנכתב בתצוגת מעבדה משמש לשליטה בלייזר דיודה בודדת ולהמחשה ורישום של פעילות עצבית מתמשכת. אותות מוקלטים נלכדים עם מעבר פס מגבר לשעבר AMP 20 K מסונן ב-0.3 עד שמונה קילו-הרץ ולוח אנלוגי לדיגיטלי של מכשיר לאומי.

ממשק המשתמש neuro lux Pro מאפשר בחירה בין כניסות אנלוגיות ופלט דיגיטלי. בחר שני ערוצים אנלוגיים עבור לוגיקת הטרנזיסטור העצבי והטרנזיסטור או אות TTL. הגדר את קצב הדגימה ל-20 קילו-הרץ, את תקופת האור הבסיסית לשתי שניות ואת תקופת האור שלאחר האור לשתי שניות.

לאחר מכן הגדר את רוחב הדופק, התדר ותקופת הגירוי של גירוי לייזר TTL. כאן התדר הוא 20 הרץ ותקופת הגירוי היא 500 אלפיות השנייה, מה שאומר שמועברים 10 פולסי לייזר עם רוחב פולס מוגדר. המשתמש יכול לבחור בין אספקת אור רציפה או להקלטות חוזרות.

הם יכולים לבחור את המרווח בין הפולסים למספר זני הדופק. ניתן לרכוש נתונים עם או בלי הקלטה לדיסק לאחר ההקלטה. החיה מוקרבת על פי נהלים מאושרים ורקמת המוח מעובדת כדי לוודא מיקום שחיקה וביטוי אופסין כפי שמוצג כאן.

צילום מסך זה של ממשק התוכנה Neuro LX Pro שהוגדר לאספקת אור בו זמנית והקלטה אלקטרופיזיולוגית מראה את הול רוד דובסון גרם להשתקה של פעילות ספונטנית של תא פרה-מתכתי פרה-לימבי ראפ בתגובה ל-10 שניות של אספקת אור רציפה של 532 ננומטר. תמונה זו מציגה את הביטוי הייצוגי של הלו אדום באולו הגב. הסכימה מימין מייצגת את המיקום שבו צולמה התמונה.

ראש החץ מציין את מיקום אלקטרודת הטונגסטן והחץ מציין את מיקום הסיב האופטי. תמונה זו מציגה ביטוי מייצג של אופסין בערוץ בקליפת המוח הקדם-לימבית. שוב, הסכימה מימין מייצגת את המיקום שבו צולמה התמונה.

ראש החץ מציין את מיקום אלקטרודת הטונגסטן והחץ מציין את מיקום הסיב האופטי. עקבה לדוגמה זו שתועדה מקליפת המוח הקדם-לימבית של חולדה מראה ערוץ אדום שני פוטנציאל פעולה מופעל בתגובה למסירה של 20 הרץ של 473 ננומטר כחול, פולסי אור למשך 10 אלפיות שנייה כל אחד כפי שמצוין על ידי הפס הכחול. מתחת. תרשים הרסטר מראה זינוק המושרה על ידי אדום ערוץ בשישה נוירונים מייצגים.

כל פעילות יחידה משורטטת כנקודה. עקבה לדוגמה זו מראה דיכוי המושרה על ידי אופסין הול של פעילות ספונטנית במהלך תאורת אור ירוקה מתמשכת של 532 ננומטר למשך 10 שניות כפי שמצוין על ידי הפס הירוק באותו אזור במוח. תרשים הרסטר מראה השתקה המושרה על ידי דוזין בשישה נוירונים מייצגים.

כל פעילות יחידה משורטטת כנקודה. תמונה זו מציגה זינוק חוזר ונשנה של ערוץ 20 הרץ מונע אופסין של נוירון פרמטאל טרום לימפיק של חולדה במתח חי עקבות מתח של האור שעורר, זינוק, שנרכש בנקודות הזמן 0, 30, 60, 90 ו-120 דקות לאחר תחילת ההקלטות מוצגות בצד שמאל. בצד ימין, תרשים הרסטר מציג את כל 61 החזרות של ההפעלה המושרה על ידי האור.

כל פעילות יחידה משורטטת כנקודה. כאן in vivo, רישומים אלקטרופיזיולוגיים מסיקים גביים של חולדה שהתמרו בהלר דוסין מוצגים בחלק העליון. המעקב לדוגמה מדגים כי 10 שניות רצופות של תאורה של 532 ננומטר המסומנות על ידי הפס הירוק של המשנה הגבית המבטאת את הול דובסון מבטלת פעילות ספונטנית.

להלן צורות הגל הממוצעות של שתי היחידות המתועדות מהעקבות לעיל. סף המשרעת שימש לזיהוי שני נוירונים נפרדים. לבסוף, תרשים הרסטר מראה חמש חזרות על השתקה המושרה על ידי האלר דוסין של יחידות אלה.

כל פעילות יחידה משורטטת כנקודה. לבסוף, תמונה זו מציגה זינוק חוזר ונשנה של 20 הרץ מונע על ידי אופסין של נוירון תת-גבי של חולדה עקבות מתח in vivo של האור שעורר, זינוק, שנרכש בנקודות הזמן 0, 30, 60, 90 ו-120 דקות. לאחר שתחילת ההקלטות מוצגות משמאל, הכניסה למטה מציגה את פעילות ההתפרצות האופיינית של תא זה.

תרשים הרסטר מימין מציג את כל 61 החזרות של ההפעלה המושרה על ידי האור. כל פעילות יחידה משורטטת כנקודה. טכניקה זו חשובה מכיוון שהיא מדגימה שניתן להפעיל או להשתיק תת-סוגים עצביים ספציפיים לפרקי זמן ארוכים.

למעשה, הוכחנו שאנו יכולים להפעיל נוירונים במשך יותר משעתיים וליישם עליהם. בסופו של דבר המטרה תהיה ליישם את זה על החיה המתנהגת בבעלי חיים שמבצעים משימות קשב או זיכרון, כך שנוכל להפעיל מעגלים ספציפיים ולראות כיצד הם שולטים בתפקודי זיכרון שונים.