פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות
25 במרץ 2013
תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגדל פרוסות של עובר עוף כדי לשמר התפתחות עצבית תקינה, ובמיוחד של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה של עובר העוף להסרת האיברים הפנימיים. השלב השני הוא הכנה וחיתוך של העובר כשהוא טבול בבלוק אגרקה.
בשלב הבא, פרוסת העובר מוסרת בזהירות מהאגרו. השלב האחרון הוא העברת פרוסת העובר לתוך תוצר תרבית, המודגרה במשך 24 שעות ב-37 degrees Celsius. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה על חתכים דקים של פרוסת העובר כדי להראות את נוכחותם ומיקומם של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה לאחר תקופת התרבית.
לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית. לדוגמה, המנגנונים והמולקולות המעורבים בנדידת נוירונים מוטוריים של חוט השדרה. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקושי, כיוון שנדרשת זהירות רבה במהלך שלבי הדיסקציה של הפרוטוקול.
הניחו 10 ביצים מופריות, כאשר הצד הארוך פונה אופקית, באינקובטור עם זרימת אוויר כפויה בטמפרטורה של 38 °C עד שהן יתפתחו לשלבי hamburger ו-Hamilton stage 24. תהליך זה דורש בדרך כלל כארבעה ימי דגירה. ביום השני של הדגירה, סטריליזו את קליפת הביצה על ידי ניגוב עם נייר סופג טבול ב-70% Ethanol; נקבו בזהירות את הקצה השטוח של קליפת הביצה באמצעות מחט במידה 21 gauge המחוברת למזרק של 5 mL, והוציאו 5 mL של אלבומין.
פעולה זו מורידה את העובר הרחק מהקליפה כדי שהעובר לא ייפגע בעת פתיחת הקליפה. החזירו את הביצים לדגירה והדגירו אותן למשך יומיים נוספים. לאחר שחלפו היומיים, השתמשו בפינצטה קהה.
בצעו פעולות נוספות. שלב חמישה, השתמשו בפינצטה כדי לנקב בזהירות את החלק העליון ומרכז הקליפה, והסירו שטח של כ-9 סמ"ר מהקליפה. גזרו מסביב לעובר, הוציאו אותו בזהירות והניחו אותו ב-HBSS.
עבור נתיחה. כל העוברים שנעשה בהם שימוש צריכים להיות קרובים לשלב 24. יש להשליך כל עובר המראה סימנים כלשהם של חריגה.
הנח את הצלחת המכילה את העובר תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמש בשני פינצטות מסוג dual number five כדי להסיר את קרום השליה (amnion membrane). הסר את קרום הכוריון (chorioallantoic membrane), את השליה (allantois) ואת הראש. לאחר מכן, בצע ריקון של העובר (eviscerate) כדי להסיר את כל האיברים הפנימיים, באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה כדי לגזור את קו האמצע הגחוני של העובר.
לאחר מכן, החזיקו את העובר באזור הגו של הקצה הרוסטרלי באמצעות זוג פינצטות. תפסו את החלק הרוסטרלי של מערכת העיכול ואת הלב ומשכו אותם בעדינות. כעת תוכלו לראות את הסומריטים של העובר בבירור.
כעת גזמו את דופן הגוף של בית החזה באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה. לאחר מכן, חתכו את העובר לשני חצאים באופן רוחבי בין ניצני הגפיים העליונות לתחתונות. הסירו בעדינות את החצי המותני של העובר המנותח באמצעות שתי פינצטות כדי להוציא את העובר מתמיסת הדיסקציה, והניחו אותו בצלחת פטרי יבשה באמצעות פיפטת פסטור חד-פעמית באורך של כחמישה סנטימטרים.
חתכו מהחלק התחתון ושאבו כ-2 milliliters של 4%weight per volume מומס. בעזרת פיפטה של Aros ב-PBS, טפטפו כ-0.5 milliliters של aros מעל העובר ולאחר מכן שאבו את פיסת העובר לתוך הפיפטה. העבירו את העובר ואת ה-aros לתבנית פלסטיק נשלפת ללא הכנסת בועות לתוך ה-aros.
הנח בעדינות את העובר לתחתית ה-aros בתוך התבנית הפלסטית, כאשר החלק התורסו פונה כלפי מטה, והשתמש במחט במידה 25 gauge כדי לוודא שהעובר נמצא במנח ישר. ה-aros יכיל גם חלק מהגפה המתפתחת, וחשוב שהעוברים ימוקמו באופן אנכי בתוך ה-aros כדי לאפשר זאת; לצורך כך, הנח את התבנית הפלסטית על קרח למשך כשתי דקות. בעת קיבוע ה-aros, הקפד שהעובר לא ישנה את כיוונו במהלך תקופה זו.
הקימו מערך הדומה ל-VT 1000 S כך שהתא יהיה מלא ב-HBSS ומוקף בקרח או במים קרים. השתמשו בדבק מהיר (super glue) כדי לקבע את בלוק ה-agarose לפלטפורמת ה-Vibram, ולאחר מכן גזרו את הבלוק בעזרת להב תער כך שהעובר יישאר מוקף ב-1 עד 3 מילימטרים של agarose.
הפעילו את הוibrato והתחילו בחיתוך העובר. הפרוסות הכוללות מקטעים של ניצן הגפה עם רכס אקטודרמלי אפקלי (apical electrodermal ridge) ברור נבחרות ולאחר מכן מועברות לצלוחית עם HBSS. בדרך כלל, ישנן רק אחת עד שתיים פרוסות מתאימות לכל עובר.
הסר בעדינות את האגרוז מסביב לפרוסות הרקמה באמצעות שתי מחטים. חיוני לבצע זאת באופן יסודי וזהיר. הוסף 500 microliters של תמיסת תרבית למספר הבארות הדרוש בפלטה של 24 בארות בעלת הידבקות נמוכה מאוד (ultra low attachment) לתרביות רקמה.
העבירו בזהירות את הפרוסות מתמיס ה-HBSS אל תוך הבארות, תוך הנחת שתיים או שלוש פרוסות בכל בארה, ולאחר מכן הניחו את פלטת 24 הבארות באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות. לאחר תקופת התרבית, הוסיפו 500 µL של מקבע לא מובחן (unbuffered fix) לכל בארה של פרוסות עובריות והשאירו על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן, שאבו בזהירות את כל התמיסה ושטפו שלוש פעמים ב-PBS במרווחים של חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו לבארות 30% sucrose ב-PBS והניחו את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C למשך כשש שעות או יותר, עד שהפרוסות שוקעות.
לאחר שהפרוסות שקעו, העבירו אותן לצלחת פטרי נקייה בקוטר 10 סנטימטרים וספגו תמיסת סוכרוז עודפת. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של OCT והמתינו חמש דקות להשגת שיווי משקל בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. הצמידו כל פרוסה באופן שטוח לתבנית פלסטיק נשלפת ממולאת ב-OCT, והסירו את הפלסטיק לאחר ההצמדה.
הניחו את התבניות בצורה אנכית על קרח יבש כדי להקפיא, הצמידו את בלוקי ה-OCT לקריוסטט והמתינו עד להשגת שיווי משקל של הבלוקים בטמפרטורה של minus 24 degrees Celsius למשך כ-20 דקות. לאחר מכן, חתכו כל פרוסה לחתכים בעובי 15 micron והעבירו אותם לשקופיות super frosts plus. ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד השימוש בהן לצביעה אימונופלורסצנטית כפי שמתואר בחלק הטקסטואלי של הפרוטוקול; תמונה זו מציגה את מצב ההיווצרות של העמוד המוטורי הלטרלי (lateral motor column) בשלב 24 לפי hamburger and Hamilton.
החלוקה הלטרלית של העמוד המוטורי הלטרלי מוצגת באמצעות צביעת LH X one בלוח השמאלי. העמוד המוטורי הלטרלי מוצג באמצעות צביעה עם Fox P one בלוח המרכזי, והלוח הימני הוא מיזוג של שני הערוצים. קו האמצע מוצג כקו מקווקו, ו-DV מסמן כאן את הציר הדורסלי-ונטרלי.
מצב החלוקה הלטרלית של עמודת התנועה הלטרלית מוצג שוב על ידי צביעת LH X one בפאנל השמאלי, ועמודת התנועה הלטרלית על ידי צביעת Fox P one בפאנל האמצעי, כאשר התמונה המאוחדת מופיעה מימין. תמונות אלו מראות התפתחות בשלב 27. תמונות אלו מראות ביטוי של LH X one בשמאלה וביטוי של Fox P one בפאנל האמצעי בחתכים של פרוסה שגודלה בתרבית במדיום התומך בהישרדות של תאי נוירונים מוטוריים קראניאליים מופרדים.
LH X one אינו מבוטא יותר בנוירונים מוטוריים, למרות שקיימת הישרדות מסוימת של תאי LMC כפי שמעידה ביטוי של Fox P one. DV מייצג את הכיוון של הציר הגבי-בטני (dorsal ventral) של חוט השדרה, ו-ML מייצג את הכיוון של הציר המדיאלי-לטרלי (media lateral) של העמוד המוטורי הלטרלי (lateral motor column) של חוט השדרה. תאי החלוקה הלטרלית, ששוב נצבעו ל-LH X one בקרן הבטנית (ventral horn) בפאנל השמאלי, וה-LMC באופן כללי שנצבעו ל-Fox P one בפאנל המרכזי, ניתנים לצפייה בחתכים שגודלו במצע המכיל 4% סרום של אפרוח ו-100 nanograms per milliliter CNTF.
שימו לב כי חלק מהתאים של החלוקה הלטראלית בעמוד המנועי הלטראלי נמצאים במיקום לטראלי בקרן הוונטרלית, כפי שמתindicated על ידי החץ בפאנל השמאלי. תמונה זו מציגה את מצב הביטוי של LHX1 ו-FoxP1 בחתכים של עובר שנשמר ב-OVO במהלך תרבית הפרוסות של העובר שהוצג קודם לכן. היסטוגרמה זו מציגה את התוצאות מכמתור של אחוז התאים של החלוקה הלטראלית בעמוד המנועי הלטראלי, הנצבעים כחיוביים ל-FOXP1 וחיוביים ל-LHX1, לעומת תאי עמוד מנועי לטראלי, הנצבעים כחיוביים ל-FOXP1 וחיוביים ל-LHX1.
נתונים שליליים מוצגים עבור תאים שנמצאו בתרביות פרוסות בתנאים שונים בהשוואה לעוברי ביקורת שנשמרו in ovo, המייצגים 100%; הנתונים נותחו באמצעות מבחן t של Student. שלושה כוכביות מייצגים רמת מובהקות של פחות מ-0.01. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לנקוט זהירות בעת דיסקציה של העובר ובעת הסרת הגרנות מהפרוסות, שכן חשוב לשמור על שלמותם של האקסונים המוטוריים בניצן הגפה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את גידולם של פרוסות עוברי עוף לתמיכה בפיתוח תקין של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה. השיטה מבטיחה שההתפתחות הנוירונלית תוכל להימשך ביעילות בתוך סביבה מבוקרת למשך 24 שעות לפחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- נוירוביולוגיה התפתחותית
- מדעי המוח
- אמבריולוגיה
רקע
- פרוסות של עוברי תרנגולת משמשות לחקר התפתחות נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.
- התפתחות תקינה דורשת מניפולציה קפדנית של תנאי התרבית.
- מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה משמשת להדמיה של מבנים נוירונליים.
- הבנת נדידת נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה היא קריטית למחקרים התפתחותיים.
מטרת המחקר
- לשמירה על התפתחות נוירונלית תקינה בחתכים של עוברי תרנגולת.
- לחקירת המנגנונים המעורבים בנדידה של נוירוני מוטוריקה בעמוד השדרה.
- לספק פרוטוקול מהימן עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של עוברי תרנגולת להסרת איברים פנימיים.
- הטמעה וחיתוך של העובר באגרוז.
- דגירה של הפרוסות במצע תרבית בטמפרטורה של 37 °C.
- מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית להדמיה של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.
תוצאות עיקריות
- תחזוקה מוצלחת של התפתחות נוירונים מוטוריים של חוט השדרה למשך 24 שעות.
- זיהוי של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה באמצעות אימונופלואורסצנציה.
- ביסוס של פרוטוקול מהימן למחקרים עתידיים.
- תובנות לגבי המנגנונים של נדידת נוירונים מוטוריים של חוט השדרה.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של התפתחות נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.
- דיסקציה מדויקת ותנאי תרבית קריטיים להצלחה.
- שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוירוביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר מחקר מבוקר של התפתחות נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה במערכת מצומצמת, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי תיקוף מוקדמים של מטרות בביולוגיה של מערכת העצבים. על ידי שמירה על הישרדות ונדידה נוירונלית למשך 24 שעות, הוא מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת התלות בגורמים נוירוטרופיים ובמיקום תאי. הגישה מסייעת בשיפור מודלים פרה-קליניים על ידי בידוד משתנים המשפיעים על הישרדות נוירונים מוטוריים ועל שלמות אקסונלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דרישות לגורמים נוירוטרופיים עבור הישרדות והגירה של נוירוני מוטוריקה בעמוד השדרה.
- ערך תפעולי: מפחית משתנים מתבלבלים הנובעים מחשיפה סיסטמית לתרופות על ידי שימוש בחתכי עוברים מבודדים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית להערכה כמותית של ביטוי סמני נוירונים מוטוריים (LHX1, FOXP1) תחת תנאי תרבית מוגדרים.
- ערך תפעולי: תומך בחזרתיות של הבדיקה באמצעות הכנה עקבית של פרוסות וקריאות אימונופלואורסצנציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רצף התפתחותי באמצעות שימור מיקום של נוירונים מוטוריים ושל שלמות אקסונלית בניצני גפיים באופן הדומה למצב in vivo.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה מותאמת-סיכונים של תנאי תרבית התומכים בהתפתחות נוירונלית ללא גרימת מוות תאי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם תיקוף המטרה דורש אישור פנוטיפי של התפתחות נוירונלית במודל נגיש.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מנגנונים מולקולריים של נדידה והישרדות של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.
- סריקה: מספקת תוצרי אימונופלואורסצנציה כמותיים להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של אחוזי תאים חיוביים לסמנים בין תנאי תרבית באמצעות מבחן t של student.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי שמירה על ארגון אקסוני גבי-בטני ומדיאלי-לטרלי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחיתוך ותרבית לצורך סריקת נוירוטוקסיות התפתחותית או נוירו-רגנרציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי לגבי תלות בגורמים נוירוטרופיים ומנגנוני נדידה.
- ערך תפעולי: פרוצדורות סטנדרטיות של דיסקציה, הטמעה וחיתוך מפחיתות את השונות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go לגבי מטרות המשפיעות על מסלולי הישרדות של נוירונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות או גנים בהתבסס על השפעות על ביטוי משותף של סמני נוירונים מוטוריים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה מיקרו-כירורגית וטיפול בעובריות כדי לשמר את השלמות האקסונלית.
- תשתית לחיתוך ב-Vibratome והטמעה באגרוז חיונית להשגת איכות פרוסות עקבית.
- הסטנדרטיזציה בין צוותים תלויה בתזמון דגירה מדויק, בסוג הסרום ובמינון הגורמים הנוירוטרופיים.
- התאמה למערכות מודל אחרות מחייבת תיקוף של שלבי התפתחות מקבילים וביטוי סמנים (markers).
- מגבלות מעשיות כוללות את חלון התרבית של 24 שעות ותלות בסיווג מדויק של שלב העובר (Hamburger-Hamilton stage 24).
