Name: איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למד טכניקת מיקרו-חיתוך וזריקת צבע פלואורסצנטי לתוך גנגליון השמיעה בעוברי עופות מוקדמים. שיטה זו מאפשרת מעקב סלקטיבי אחר סיבי עצב שמיעה בנוירולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר קנדיס היישה להצעות וסיוע בטכניקות הדמיה ודוריס ד&quot;ר וו במומחיות על האנטומיה של אוזן פנימית אפרוח במהלך ההתפתחות עוברת מוקדם. עבודה זו נתמכה על ידי NSF IOS-0642346, NIH-T32 DC010775, NIH-T32 GM008620, NIH R01-DC010796, וDOE GAANN P200A120165.

1. הכן את כלי הנתיחה בעקבות ריאגנטים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; 130 המ&quot;מ NaCl, 3 המ&quot;מ KCl, 1.2 mM KH 2 4 ת.ד., 20 המ&quot;מ 3 NaHCO, 3 HEPES מ&quot;מ, גלוקוז 10 מ&quot;מימ, 2 המ&quot;מ CaCl 2, 1.3 המ&quot;מ 4 MgSO) חדור ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2 בטמפרטורת חדר. לעירוי, למלא כדי 2/3 צנצנת 500 מ&quot;ל Nalgene פה רחב עם חור במכסה. טנק יצורף בצינור לזכוכית גזע bubbler, החודר את aCSF דרך החור במכסת הצנצנת. התאם לחץ להשגת זרם בלתי פוסק של בועות שמגיעות כ 1/3 מכמות הנוזלים, אבל הם לא חזקים מספיק כדי לגרום להתזה מעל לשפה. הצף 5 בקבוקוני זכוכית מ&quot;ל (עד 6) לצנצנת Nalgene להפריד דגימות בודדות אחד מהשני וממערבולות זרימת הגז. ACSF יש חמצן במשך לפחות 20 דקות לפני כל דגירת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנת נתיחת סיליקון קטנה (35 x 10 מ&quot;ממצופה מ&quot;מ פטרי באמצעות Sylgard Elastomere קיט) עם שתי סיכות נתיחה להציב לתוך קלקר משושה קטן (47 מ&quot;מ תחתון) שוקל סירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מלקחיים-מחט דקה, אחד קצה מעוגל מלקחיים, כוס מ&quot;ל 50, ומכל לפסולת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך הזכוכית micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) נשבר לכ 20-50 מיקרומטר פתיחה בקצה ומלא בrhodamine dextran אמין (RDA, MW = 3000, Invitrogen) בפתרון 6.25% עם 0.4% Triton X-100 ב PBS . צרף ידי צינור דק לpicospritzer ולייצב לmicromanipulator. </li></ul> 2. מייקרו נתיחה כדי לחשוף פטמית basilar בE8 4,5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים מעוקלים, לחתוך E8 עובר מתחת לגזע המוח, מניח את הראש ישירות על גבי צלחת נתיחת סיליקון מצופה במשקל סירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסיכות נתיחה, למקם את הראש עם נוף גחון כך האוזן בצד של עניין היא מעט גלויה, הראש מוטה מעט dorsally ומצביע מרחק 10-30 מעלות מcenter (איור 2 א). מייד לאבטח את הראש עם סיכות. אם הבילטרלי מעקב הוא רצוי, מרכז הראש ב0 מעלות, או נוף גחון מלא, כך ששני הצדדים יכול להיות נגיש. בדומה לכך, להזרקת צד שמאל, לאבטח את הראש ב-10 מעלות ל-30 ממרכז כך בצד השמאל הוא נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכוס המ&quot;ל 50, להעביר 30 מ&quot;ל של aCSF חומץ לתוך התבשיל, משקע את הרקמה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות לתפוס ולקלף את הלסת התחתונה באמצעות מלקחיים-מחט דקה, ואז להסיר את העפעף התחתון בצד של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמת כלי הדם שמעליו, לרבות כל חיך וושט שנותר. רקמות רכות אלה צריכות לקלף חושפות את משטח החלק של פיתוח chondrocranium עם עורקי החוליות הייחודיים בשטח שלו. בשלב זה, מסת otoconial הלבנה האופיינית צריכה להיות גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את העור סביב meatus החיצוני, הסחוס של מפרק הלסת, והאוזן התיכונה תוך השארה באוזן נר שלמה. השתמש במלקחיים בעדינות כדי לחתוך מבני סחוס אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עורקי חוליות ודם וריכוז באמצעות תנועה גורפת עדינה עם טיפי מלקחיים העדינים. דם יכול לטשטש נוף וקרישה עשויה לסתום את פתח פיפטה הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור השבלול עם האפיתל סמוך חושי (basilar פטמית) וגנגליון אקוסטית נמצא ישירות מתחת chondrocranium 6 ויכול להיות דמיינו כמו הקרנת אצבע דמוית מוארכת המשתרעת מהאוזן הפנימית ventrally, עם הדיסטלי ביותר טיפ (שיא) ליד הקדמי קו אמצע 5. אולי יש איגום קטן של דם (אדום) מהנתיחה ו / או הסתיידויות otolithic (לבן) בקודקודו של צינור השבלול (איור 2 ב &#39;) שיכול לסייע בהדמיה. בשיא היא המקולה lagenar, תיקון חושי חשב להיות פונקציה של שיווי משקל 7,8. </li></ol> 3. תיוג סלקטיבי של סיבים שמיעתיים שמיניים CN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; הנח את הפיפטה ההזרקה הקרובה לפני שטח העובר באזור פטמית הדביקה וbasilar השבלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את micropipette לנקב 1 הגולגולת. אזור גולגולת זו הוא דק יותר מאזורים סמוכים ודורש פחות כוח לחדור. Micropipette צריך עכשיו להיות בתוך צינור השבלול. אופציונלי: זריקה קטנה של העתקת צבע יכולה להתבצע כאן כדי לסייע בהמחשת פטמית הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי למקם מחדש את micropipette, להמשיך ולהוריד עד שהוא רק פרות הגבול העמוק של צינור השבלול (איור 1). לבצע הזרקה כאן ולחזור בכמה אזורים לאורך basilar פטמית (התרשימים 2C, 2D), למעט הקצה הפרוקסימלי ביותר בי lagena שיווי המשקל הוא ממוקם. עם picospritzer נקבע בין 10-30 psi, כמה זריקות נעשות. נפחיו של נוזל צבע מוזרק משתנים, ותלויים במידה של תיוג רצוי. כל זריקה אמורה לגרום פלורסנט לצבוע להנקודת beled של כ 200-400 קוטר מיקרומטר (האיור 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה היא מוחלטת, להשתמש במלקחיים ויחצו המדגם מעל גזע המוח ולהשתמש פיפטה העברה למקום חלק הזנב לתוך צנצנת קטנה בתוך המכל של aCSF הרף perfused עם 95% O 2/5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל עוברים, לאפשר 20-30 דקות להעברת צבע, בהתאם למרחק ממרכז המעקב הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמה ולהתכונן לחתך היסטולוגי. בדוגמא שמוצגת כאן, רקמה היא שקועה בparaformaldehyde 4% (ב1X PBS) סוכרוז הלילה, 30% (ב1X PBS) למשך הלילה. </li></ol> 4. Counterstaining וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstaining שימושי שיעזרו לכוון את הצופה למיקום האנטומי כמו גם לזהות אזורים מסוימים של עניין. Counterstain יעיל בהכנה הזאת היא immunolabeling neurofilament (איורים 1, 3B, 3E), אשר בתוקף labels אקסונים ומאפשר לתיחום של שטחי axonal במערכת העצבים המרכזיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח צריך להתבצע בכל האזור שכותרתו, כמו את התחזיות יכולות להאריך כמה מאה מיקרונים או יותר לאורך ציר rostrocaudal. להלן כמה דוגמאות לניתוחים בסיסיים הן: שיעורי שגיאת מיקוד, עיתוי ו / או שינויים בסטייה של דפוסי הקרנה. אקסונים RDA כותרת-הם דמיינו במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית ברזולוציה גבוהה (3A דמויות, 3D). </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים מוכרזים.

מחקרים על ההתפתחות המוקדמת של עצב המחנה השמיני היו מוגבלים בחלקו בשל הקושי בזיהוי האקסונים עובריים הנובעים מגרעינים מובחנים מרובים. מספר מחקרים בחנו את האותות המולקולריים המנחים שמיעתי ותא חושי שיווי משקל וגורל תאי הגנגליון במהלך ההתפתחות המוקדמת, אבל 5,11,12 התהליכים ויסות עצבוב מרכזי עדיין לא נקבעו. דיווחים על תחזיות תא גנגליון אקוסטיים בדרך כלל מתארים את התהליכים היקפיים לאפיתל חושי 13-15, ואילו פחות ידוע על התהליכים המרכזיים מקרינים לגרעין ראשוני. מחקרים ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פוליסטירן לשקול דיש </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי, 35 10 מ&quot;מ X </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 50820644 </td><td> השתמש כדי להפוך את המנה לנתיחת סיליקון </td></tr><tr><td> ערכת סיליקון אלסטומר Sylgard </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> SYLG184 </td><td> מעייל פטרי כדי להפוך את מנה לנתיחה </td></tr><tr><td> סיכות נתיחה </td><td> שונה </td><td></td><td> מחזיק עובר במקום במהלך הנתיחה </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> 3 NaHCO </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> שונה </td><td></td><td> חלק ממתכון aCSF </td></tr><tr><td> מכל לaCSF. הצע פה רחב Nalgene צנצנת שקופה, 500 מ&quot;ל (16 מ&quot;ל) עם מכסה. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> פתיחה לקדוח חור בחלק העליון של מכסה לגזע הזכוכית bubling לחדור נוזל </td></tr><tr><td> בקבוקון ריק 5 מיליליטר זכוכית או בקבוקון שקוף להשוות </td><td> תרופות אמריקניות שותפים, Inc </td><td> 6332300105 </td><tד&gt; שימוש במהלך דגירת aCSF לשמור דגימות נפרדות זה מזה ומן הזרם המבעבע </td></tr><tr><td> טנק של carbogen (95% O 2/5% CO 2) מחובר בצינור לbubbler </td><td> שונה </td><td></td><td> צרף בצינור לbubbler גזע הזכוכית לעירוי לתוך aCSF </td></tr><tr><td> זכוכית הגזע bubbler </td><td> שונה </td><td></td><td> להחדיר לתוך carbogen aCSF </td></tr><tr><td> מלקחיים מעוקלים בקצה </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 501008 </td><td> כדי להסיר את ראש עובר מביצה </td></tr><tr><td> שני מלקחיים עדין קצה </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 501985 </td><td> למייקרו נתיחה </td></tr><tr><td> 50 מיליליטר כוס </td><td> שונה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine dextran אמין (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> שונה </td><td> פלורסנט האקסון נותב </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Biomedicals ICN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט נאגר מלוח, (1X PBS) </td><td> שונה </td><td></td><td> ריאגנט מעבדה הרגיל </td></tr><tr><td> קיר דק זכוכית נימים, 1.2 OD, .9 ID 4 &quot;(100 מ&quot;מ) אורך </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> TW120F-4 </td><td> טען עם RDA. כל נימים עושות שתי micropipettes זכוכית </td></tr><tr><td> מחט / פיפטה חולץ </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> דגם 720 </td><td> הגדרות בשימוש: חום 16.4, 2.2 סולנואיד </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> פארקר מכשור </td><td> שונה </td><td> צרף ידי צינור דק לזכוכית micropipette </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> שונה </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם Dissection </td><td> שונה </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4% Paraformaldehyde </td><td> שונה </td><td></td><td> ריאגנט מעבדה הרגיל </td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Neurofilament, אופציונלי </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> עקוב פרוטוקול היסטולוגית מומלצים על ידי יצרן </td></tr><tr><td> Cryostat וחומרים הקשורים לחתך </td><td> ליקה </td><td> שונה </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescent להדמיה </td><td> Zeiss, שונה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בvestibulocochlear העוברי העופות

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

האפרוח העוברי הוא מודל שימוש נרחב למחקר של תחזיות תא גנגליון היקפיות ומרכזיות. במערכת השמיעה, תיוג סלקטיבית של אקסונים שמיעתיים בתוך עצב גולגולת המחנה השמיני היה לשפר את המחקר של התפתחות מעגל שמיעתי המרכזית. גישה זו מאתגרת, כי אברי חישה מרובים של האוזן הפנימית לתרום לעצב המחנה השמיני 1. יתרה מזאת, סמנים שמבדילים אמין שמיעתי לעומת קבוצות שיווי משקל של אקסונים בתוך עצב המחנה השמיני עופות עדיין לא זוהו. מסלולים שמיעתיים ושיווי משקל לא ניתן להבדיל באופן פונקציונלי בעוברים מוקדמים, כתגובה חושית מעוררת אינן נוכחת לפני המעגלים נוצרים. אקסונים עצב מחנה שמיניים מרכזי מקרינים אותרו בחלק מהמחקרים, אבל תיוג האקסון השמיעתי לווה על ידי תיוג ממרכיבי עצב מחנה שמיני אחרים 2,3. כאן, אנו מתארים שיטה למעקב האנטרוגרד מגנגליון אקוסטי לסלקטיבי Labeאקסונים שמיעתיים הליטר בתוך המחנה השמיני העצבים המתפתחים. ראשית, לאחר נתיחה חלקית של אזור cephalic הקדמי של עובר אפרוח 8-יום שקוע בנוזל השדרתי מלאכותי חומץ, את צינור השבלול מזוהה על ידי ציוני דרך אנטומיים. בשלב בא, micropipette זכוכית משך קנס ממוקם להזריק כמות קטנה של rhodamine dextran אמין לאזור העמוק הדביק וצמוד בו תאי גנגליון אקוסטיים נמצאים. בתוך שלושים דקות לאחר ההזרקה, אקסונים שמיעתיים הם נעוצים מרכזיים למוח האחורי, ומאוחר יותר ניתן דמיינו לאחר הכנה היסטולוגית. שיטה זו מספקת כלים שימושיים למחקרים התפתחותיים של ציוד היקפי להיווצרות מעגל שמיעתי מרכזית.

המרכיבים של עצב המחנה השמיני ואת האנטומיה של העצב עצמו מורכבים ומפותלים (איורים 1, 3). על ידי התחקות סיבים הנובעים מתאי הגנגליון אקוסטיים סלקטיבי, קטעים של עצב המחנה השמיני, כמו גם afferents השמיעתי העיקרי בתוך גזע המוח ניתן לייחס באופן נקי ונבדלים ממקביליהם שיווי משקל (איורים 2, 3). כמו כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור תחזיות היקפיות של תאי הגנגליון אקוסטיים (איור 3G), או שונה ללמוד תחזיות נובעות מאיברי שיווי משקל בודדים. בגלל ...

כאן אנו מתארים טכניקת microdissection אחרי הזרקת הצבע פלואורסצנטי לגנגליון אקוסטית של עוברי חומוס מוקדמים לאיתור סלקטיבי של סיבים שמיעתיים האקסון בעצבים והמוח האחורי.

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

מטרת הליך זה היא לסמן באופן סלקטיבי סיבים שמיעתיים ממערכת העצבים ההיקפית למערכת העצבים המרכזית בעובר. דבר זה מושג תחילה באמצעות ביצוע חיתוך במינון מיקרוסקופי כדי לחשוף את גולגולת הסחוס הגחונית (ventral chondro cranium) ולזהות את התעלת השבלול של העוף. השלב השני הוא ביצוע הזרקה מיקרוסקופית לתאי הגנגליון האקוסטי שמתחתיהם ולסיבים העצביים (axons) שלהם.לאחר מכן, הדגימה מדגרה ב-CSF מלאכותי מחומצן למשך 20 דקות כדי לאפשר מעבר של ה-DIA. לבסוף, הכנה היסטולוגית וחיתוך של הרקמה מאפשרים ויזואליזציה מיקרוסקופית של ההקרנות המרכזיות של הגנגליון האקוסטית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הם שהיא מאפשרת מעקב סלקטיבי של העצב השמיני.סיבים שמיעתיים בעלי רזולוציה גבוהה מאפשרים העברה מהירה של צבע ברקמה חיה ומתירות ניסויים בשלב התפתחותי מוקדם. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחקר השמיעה. לדוגמה, מהם המולקולות המכוונות את האקסון אל יעדיו המרכזיים?או כיצד מגיבים המעגלים לפגיעה או לחשיפה לאוטוטוקסיות? ראשית, הוסיפו נוזל חניכה מוחי מלאכותי לצנצנת Nalgene עם פיה רחבה בנפח 500 milliliter עד שהצנצנת תהיה מלאה בשני שלישים. החזירו את המכסה, שבו נקדח חור, על הצנצנת.הכנסו מבובנר (bubbler) המחובר למכל של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide דרך החור במכסה ואל תוך ה-A CSF. הפעילו את הגז וכווננו את הלחץ כדי להשיג זרם קבוע של בועות המגיעות לכשליש מהנוזל, אך אינן חזקות מספיק כדי לגרום להתזה מעל השפה. טבלו עד שישה מבחנות זכוכית בנפח 5 mL בתוך הצנצנת כדי להפריד בין הדגימות הבודדות זו מזו.ובשל טורבולנציה בזרימת הגז. אפשרו ל-A CSF לעבור חמצון למשך 20 דקות לפחות; בזמן שה-A CSF עובר חמצון, משכו מיקרו-פיפטות זכוכית ומלאו אותן שוב בפתרון 6.25%rodine Dexter ו-am immune ב-PBS המכיל 0.4%Triton XX. חברו את המיקרו-פיפטה למיקרו-מניפולטור ושברו את הקצה בעזרת פינצטה עדינה כדי ליצור פתח של 20 עד 50 מיקרון. השתמשו בצינורית דקה כדי לחבר את המיקרו-מניפולטור המיוצב למרסס הפיקו (pico spritzer).כוון את ה-pico spritzer ללחץ של 10 עד 30 PSI כדי להתחיל ולהשלים את שאר ההגדרות. ודא שקיימת צלחת ניתוח קטנה מסיליקון עם שני סיכות ניתוח המוצבות במבנה משושה קטן. השתמש בשתי פינצטות בעלות קצה דק.פינצטה בעלת קצה מעוקל, כוס כימית של 50 מיליליטר ומיכל לפסולת רקמות באזור הנתיחה. לאחר הוצאת עובר האפרוח מהביצה, הנח את הראש על צלחת נתיחה מצופה סיליקון. בתוך תבנית הנתיחה, מקם את הראש במבט ונטרלי כך שהאוזן בצד הרלוונטי, במקרה זה הצד הימני, תהיה גלויה.לאחר שהרקמה נמצאת במיקום הנכון, ייצב אותה באמצעות סיכות דיסקציה, תוך הימנעות מאזור המוח האחורי. השתמש בכלי כימי של 50 milliliter כדי להעביר 30 milliliter של A CSF מחומצן אל הצלחת, כך שהרקמה תהיה טבולה לחלוטין. לאחר מכן, השתמש בפינצטה בעלת קצה דק כדי לתפוס בעדינות ולקלף מטה את הלסת התחתונה.לאחר מכן, הסירו את העפעף התחתון בצד הרלוונטי. בשלב הבא, הסירו את הרקמות הרכות ואת כלי הדם העלונים, כולל שאריות של החיך והלוע. לאחר הסרת רקמות אלו, המשטח החלק של הגולגולת הגחונית (ventral cranium) והעורקים הוורטברליים המובחנים אמורים להיחשוף.בצעו דיסקציה זהירה של העור סביב ה-mitos החיצוני, סחוס מפרק הלסת והאוזן התיכונה, תוך השארת האוזן הפנימית שלמה. השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות את מבני הסחפון של הלסת והאוזן התיכונה. כעת, השתמשו בתנועת ניקוי עדינה עם קצות הפינצטה הדקה כדי להסיר את העורקים הוורטברליים ודם שהצטבר.דבר זה חשוב מכיוון שדם עלול להסתיר את השטח וקרישה עשויה לסתום את פתח פיפטת ההזרקה. בשלב זה, המסה הלבנה האופיינית צריכה להיות גלויה. החץ באיור זה מצביע על התעלת השבלול (cochlear duct) עם האפיתל החושי הסמוך וגנגליון השמיעה.הוא ממוקם ישירות מתחת לגומולת הסחוס של הגולגולת (chondra cranium), וכפי שניתן לראות כאן, הוא נראה כבליטה מוארכת דמוית אצבע הנמתחת מהאוזן הפנימית לכיוון הגבי, כאשר הקודקוד נמצא סמוך לקו האמצע הקדמי לסימון סיבים שמיעתיים. ראשית, מקמו את פיפטת ההזרקה סמוך לפני השטח שלו של העובר באזור תעלת השבלול (cochlear duct) ואזור ה-baula papular; הורידו באיטיות את המיקרו-פיפטה כדי לנקב תחילה את הגולגולת. אזור זה של הגולגולת דק יותר מהאזורים הסובבים אותו ודורש פחות כוח כדי לחדור דרכו.המיקרו-פיפט צריכה להיות כעת בתוך התעלת השבלול (cochlear duct). במידת הצורך, ניתן לבצע הזרקה קטנה של צבע מעקב כדי לסייע בוויזואליזציה של ה-basilar per pillar. ללא שינוי מיקום המיקרו-פיפט, המשיכו להנמיך אותה עד שתחדור רק את הגבול העמוק של התעלת השבלול.תמונה זו מראה את המיקום האידיאלי של הפפייט באזור המתאים של הגנגליון האקוסטי. בצעו הזרקה בנקודה זו ולאחר מכן חזרו על הפעולה באזורים מרובים לאורך הבסלה פפילה (basala papilla). הדבר תלוי בהיקף הסימון הרצוי, תוך החרגת הקצה הפרוקסימלי ביותר שבו ממוקמת הבלסטרי לגינה (vestibular legina).כאשר ה-pico spritzer מכוון ללחץ של 10 עד 30 PSI, כל הזרקה צריכה להביא לנקודה מסומנת ב-DIA פלורסצנטית שקוטרה כ-200 עד 400 מיקרון, כפי שנראה כאן. עם השלמת ההזרקה, השתמשו בפינצטה כדי לחתוך את הדגימה מעל גזע המוח כפי שמוצג כאן, והשתמשו בפיפטה להעברה כדי להניח את חלק חוט השדרה באחד הצנברים הקטנים בתוך מיכל ה-perfused CSF.עבור כל עובר, יש להמתין 20 עד 30 דקות להעברת הצבע, בהתאם למרחק השקיפות המרכזית הרצוי. לאחר תום זמן הדגירה, יש להוציא את הרקמה ולהכינה לחיתוך היסטולוגי. בשלב זה, טובלים את הרקמה ב-4%paraldehyde ב-one XPBS למשך לילה, ולאחר מכן מבצעים דהידרטציה למשך לילה ב-30%sucrose ב-one XPBS.לאחר שהרקמה הושקעת למשך לילה בסוכרוז 30%, היא נחתכה בשיטת קריו-סגמנטציה במישור הקורונלי. לאחר החיתוך, סימון אימונו-היסטוכימי עם נוגדנים מתאימים יכול להכווין את הצופה למיקום האנטומי וכן לזהות אזורי עניין ספציפיים. תמונה זו מציגה מבט קורונלי של גזע המוח של E six עם גנגליונים אקוסטים דו-צדדיים שלמים.הפיפטה האדומה הסכמטית מדגימה תכנון מדויק של תאי גנגליון אקוסטיים מנקודת כניסה לטרלית-גבית. החתכים סומנו אימונולוגית עם anti neurofilament כדי להדגיש בליטות אקסונליות. האיברים הווסטיבולריים נמצאים רוסטרלית לחתך המוצג.העצב הוסטבולו-קוכלארי מסומן, כגון הגנגליון האקוסטי והגנגליון הוסטבולרי. הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה, סרגל המقياس שווה ל-300 microns. להלן תמונות מייצגות בהגדלה נמוכה וגבוהה של מעקב סלקטיבי אחר סיבים שמיעתיים בעובר E8 מ-25 micron.חתכים קורונליים שנאספו מאותו עובר מציגים מישורים שונים כפי שנראה כאן. ניתן לעקוב אחר אקסונים המסומנים ב-RDA מאתר ההזרקה המודגש על ידי ראש החץ, דרך העצב הגולגולתי המודגש על ידי החץ, ובאופן רבעוני לעבר הגרעינים השמיעתיים הראשוניים המודגשים על ידי ראש חץ כפול; סרגל הקנה שווה ל-300 microns. סימון אימונוהיסטוכימי עם נוגדן anti-neurofilament מדגיש את כל הבליטות האקסוניות, והסיבים שעוקב אחריהם ה-RDA בתמונה הקודמת נמצאים בתוך נתיב ההקרנה השמיעתי.AP ו-VP מציינים את הרכיבים השמיעתיים והווסטיבולריים בהתאמה, השוכנים פריפריאלית לנקודת הכניסה של העצב. תמונת הצבע הממוזגת מראה כיצד האקסונים המסומנים ב-RDA משתלבים באנטומיה המקומית. תמונת הגבהרה של אותו עובר במיקום קורדאלי יותר מדגימה את הרזולוציה הגבוהה של הסיבים בנקודת הכניסה של העצב המסומנת על ידי חץ, ולאורך הנתיב המרכזי המסומן על ידי ראש חץ כפול.צביעת נוירופילמנט של כל האקסונים מאפשרת את סימון ה-P-N-S-C-N-S, כמו גם את ההבחנה בין השליחות השמיעתיות למשוערות לשליחות הווסטיבולריות. שוב, AP ו-VP מצביעים על הרכיבים השמיעתיים והווסטיבולריים בהתאמה, הממוקמים פריפריאלית לנקודת כניסת העצב, בעוד ש-AC ו-VC מצביעים על השליחות השמיעתיות והווסטיבולריות בהתאמה, הממוקמות מרכזית לנקודת כניסת העצב. שוב, החפיפה של ערוצים נפרדים מוצגת כמיזוג צבעים.בדיקה היסטולוגית של הגנגליון האקוסטי חושפת את מיקומם של תאי הגנגליון האקוסטי שסומנו בעקבה הקודמת ואת השלוחות הפריפריאליות שלהם המסומנות בכוכבית, כאשר העקבה רטרוגרדית הגיעה עד לפפיפולה הבזילרית. כאן AG מציין את הגנגליון האקוסטי, bp את הפפיפולה הבזילרית, ו-lm את ה-Laina macular. סרגל המقياس שווה ל-100 microns.לבסוף, איור זה מציג נתיב מעקב של 700 מיקרון הצפוי עם סימון של העצב השמיני הספציפי לשמיעה ביום העברי E8. אתר ההזרקה, המסומן בעיגול אדום, נמצא כורדלית לנקודת הכניסה של העצב, וההשלכות המרכזיות נעות באופן רוסטרלי וקוורטרלי. ברגע שהן מגיעות למוח האחורי כאן, סרגל הקנה שווה ל-300 מיקרון.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, התאימו את ההזרקות כך שיתאימו בצורה מיטבית לקריטריוני הניתוח שלכם. וזכרו, תהיה שונות מסוימת במספר המדויק ובמיקום של anons עקיבה בין הדגימות.

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את התהליך של הכנת פרוסות מוח בצורת טריז בסביבת מעבדה. באמצעות ויברטום, פרוסה בצורת טריז ממוחו של עכבר מעוצבת בעובי משתנה. פרוסה זו מכילה את שורש עצב השמיעה הממוקם בקצה העבה יותר, בעוד שהנוירונים הקשורים לשמיעה ממוקמים בקצה הדק יותר.

הכנת פרוסות טריז במוח כדי להמחיש נוירונים שמיעתיים

ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת פרוסות גזע מוח שמיעתיות שאינן קורונליות של עובר העוף לחקר תכונות טונוטופיות ומסלולים התפתחותיים בתוך פרוסת גזע מוח אחת. פרוסות אלה כוללות מקטעים סגיטליים, אופקיים ואופקיים/רוחביים המקיפים אזורים טונוטופיים גדולים יותר בתוך מישור פרוסה בודד שהמקטעים הקורונליים המסורתיים.

חיתוך גזע המוח השמיעתי של העוף העוברי להערכת שיפועים טונוטופיים ומיקרו-מעגלים

השתמשנו בטכניקות סטנדרטיות של תגובה לגזע מוחי שמיעתי (ABR) ויישמנו אותן על תרנגולות בוקעות, מודל עופות מקדים לתפקוד שמיעתי. הפרוטוקול מתווה בפירוט את הכנת בעלי החיים ואת טכניקות רכישת ABR, עם שלבים שיכולים להיות מתורגמים למודלים אחרים של עופות או מכרסמים.

הערכה של תגובת גזע המוח השמיעתי באבקועים עופות

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

למד טכניקת מיקרו-חיתוך וזריקת צבע פלואורסצנטי לתוך גנגליון השמיעה בעוברי עופות מוקדמים. שיטה זו מאפשרת מעקב סלקטיבי אחר סיבי עצב שמיעה בנוירולוגיה התפתחותית.

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

גלה סרטונים נוספים