Name: הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: חקור הקלטת פעילות חשמלית מנוירונים מזוהים במוח שלם של דג מהונדס באמצעות טכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת ניתוח מעגלים עצביים שלמים ותובנות לנוירואנדוקרינולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר מנג-צ&#39;ין לין וגב &#39;דונג יואן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות HD053767 (קבלנות משנה לNLW), ועל ידי קרנות מהמחלקה לפיסיולוגיה ומשרד המשנה לנגיד למחקר, אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (NLW).

1. נתיחה של מוח מהמבוגרים Medaka <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי מבוגר זכר או נקבה (איור 1 א) על ידי טבילה ב5 מיליליטר MS-222 (150 מ&quot;ג / ל &#39;, pH 7.4); לחכות כמה דקות אחרי תנועות זימים הפסיקו לפני עריפת הראש. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את הדגים במלח דגים בסוף הזנב של operculum עם מספריים בצלחת פטרי בקוטר של 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ראש דג לצלחת פטרי בקוטר 35 מ&quot;מ, חצי מלא בדגים מלוחים ומרופד בSylgard שיש לו דיכאון בזה כדי למקם ולאבטח את הראש לנתיחה המוח. עמדה ולאבטח את הגב בצד הראש עם סיכות חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת מסביב שלה עם מספריים עדינים ובעדינות להסיר אותו עם מלקחיים, חושף חלק הגבי של המוח כולל את החלק הקדמי של חוט השדרה לחלוטין. </li> &lt;li&gt; הרם את חוט השדרה בעדינות עם מלקחיים עדין קצה ולנתק את עצבי חיבור בין שתי המדינות במספריים קנס שקצהו: עצבים גולגולת, עצבים בעמוד השדרה, ואת עצבים ראייה בצד הגחוני של המוח, ואת עצבי חוש הריח בחלק הקדמי של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח גזור באופן מלא בצלחת פטרי טרי מלאה מלוח דגים, ולבדוק בזהירות מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את המוח כולו הוא ללא פגע (כולל בלוטת יותרת המוח), ללא חתכים או נקבים. מוח שנפגע אינם משמש לניסויים. </li></ol> 2. ההרכבה המוח בתא הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של cyanoacrylate או דבק מהיר משחק אחר עם מחט לתוך מרכז חדר ההקלטה ולהפיץ את הדבק על 1 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר להעביר את המוח ואותו הדבק בעמדה עד הגחון בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח דגים, כך שהוא ממלא את חדר ההקלטה ומכסה את המוח. ברציפות perfuseהמוח עם מי מלח דגי מוגזים בשיעור של לפחות 200 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה מלקחיים עדין להסיר את קרומי המוח בזהירות מעל פני השטח של אזור ההקלטה של ​​המוח. </li></ol> 3. Electrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת תיקון רופפת של ירי פוטנציאל פעולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microelectrodes הזכוכית (6-10 MΩ) בנויים מpipettes זכוכית ורוסיליקט (1B150F-4, מכשירי עולם Precision) באמצעות חולץ אלקטרודה (למשל סאטר P-87), ומילא חזרה עם פתרון ההקלטה רופף-התיקון בחץ הדרך למעלה האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם מכשיר תשלום מצמיד מקורר (CCD) מצלמה, למצוא את ה-GFP-לבטא TN-GnRH3 הנוירונים באמצעות 10x (איור 1), ולאחר מכן מטרות טבילה במים 40X (איור 1 ג). הם ממוקמים ליד או על פני השטח הגחון של נורות חוש הריח, רק הקדמיים לtelencephalon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לצג וידאו שמספקתמונות בזמן אמת ממיקרוסקופ כדי לאתר את TN-GnRH3 נוירון האשכול (איור 1 ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את microelectrode לאמבטיה, כך שהקצה של האלקטרודה הוא מעל ליעד נוירון. להפעיל לחץ חיובי קל מתמיד microelectrode כך שזה לא ייסתם, ומתקרב בעדינות נוירון היעד עם הקצה של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק באמצעות תוכנת AxoGraph ומגבר Axoclamp 200B עם תוכנת Axograph (אקסון מכשירים). כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומתצוגת AxoGraph שההתנגדות משתנה במקצת, שחרר את הלחץ החיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל אם יש צורך לעשות חותם על התנגדות נמוכה נוירון (&lt;100 MΩ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידהשל מתח וקצב ההקלטה במידת צורך. הנתונים שנאספו ונותחו על ידי תוכנת Powerlab (ADInstruments Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעילות שיא הבסיס חשמלית בתמיסת מלח דגים רגיל לכ -5 דקות לפני כל טיפול (איור 2 א). זלוף אמבט של תרופות, הורמונים, פפטידים, וכו &#39;. הוסיף מלח לדגים ממשיך בשיעור של 200 μl / דקות, ואחרי תקופה בכישלון רגיל דגים מלוחים 5, 6, 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת תא שלמה של פוטנציאל הממברנה ההליך כולו מהדק תיקון תא electrophysiology הוא זהה לזה של הליך ההקלטה רופף-תיקון תאי שתואר לעיל, משלבים 3.1.1 - 3.1.4. ואז את ההליכים לסטות בהתאם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק. כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומאוסצילוסקופ כי שינויי ההתנגדות מעט, שחררו את חיובייםלחץ ולהחיל לחץ שלילי קטן כדי להפוך את חותם עמידות גבוהה בנוירון (~ 3 גיגה Ω). החל שאיבה עדינה דרך פה לקרע קרום הטלאים, אתה תראה ירידה פתאומית של ההתנגדות לכ 120-250 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידה של מתח וקצב ההקלטה במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעילות חשמלית בסיסית בשיא מלוח דגים רגילים לכ -5 דקות לפני כל טיפול, כפי שתוארה לעיל ב3.1.7 (איור 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrophin-releasing+hormone+%28GnRH%29+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom.</a> J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).</li>
<li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li>
<li>Abe, H., Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuromodulation+by+a+nonhypophysiotropic+GnRH+system+controlling+motivation+of+reproductive+behavior+in+the+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost.</a> 57 (6), 665-674 (2011).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin-resistant+persistent+Na%2B+current+underlying+pacemaker+potentials+of+fish+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones.</a> J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).</li>
<li>Zhao, Y., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Kisspeptin1+on+Electrical+Activity+of+an+Extrahypothalamic+Population+of+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Neurons+in+Medaka%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka.</a> PLoS One. 7 (5), e37909(2012).</li>
<li>Wayne, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+electrophysiology+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+that+express+green+fluorescent+protein+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gonadotropin-releasing+hormone+neuronal+development%3A+insights+from+transgenic+medaka+and+the+relevance+to+X-linked+Kallmann+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome.</a> Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+gonadotropin-releasing+hormone+in+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).</li>
<li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+spontaneous+electrical+activity+during+embryonic+development+of+gonadotropin-releasing+hormone-3+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish%3A+effects+on+neurogenesis%2C+neuronal+migration%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li>
<li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+%28Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , Wiley & Sons. England. (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

GnRH 3: דגים מהונדסים GFP לספק מודלים ייחודיים כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס neurophysiological אינטגרציה ורגולציה בשליטה מרכזית של התנהגויות שהן גם ישירות ובעקיפין מעורבות ב3 רבייה, 8-10 עצביים. אחד היתרונות המשמעותיים של מערכת מודל זה הוא שהרבה GnRH3 נוירונים להביע GFP קרובים אל פני השטח הגחון של המוח, המאפשרים גישה קלה יחסית לתאי העצב להקלטת אלקטרו מבלי לשבש מעגלים עצביים 6, 9, 11, 12 (איורים 1B ו1C; 3A ו 3 דמויות).</stron...

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>BX50W (זקוף)</td></tr> <tr><td>מגבר</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axoclamp 200B </td></tr><tr><td>ממיר A-D</td> Computer <td>Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>מצלמת CCD מקוררת</td><td>PCO אופטיקה</td><td></td> ממוחשבת <td>Sensicam</td></tr><tr><td>מנורת קסנון</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני GFP</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>Slidebook Software </td></tr><tr><td>Electrophysiology Data Acquisition Software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axograph </td></tr><tr><td>Software Electrophysiology Data Acquisition</td><td>Software AD Instruments Inc.</td><td></td><td>PowerLab </td></tr><tr><td>Headstage לאלקטרופיזיולוגיה</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת תא הקלטה</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>חדר </td></tr><tr><td>הקלטות</td> P1 <td>וורנר אינסטרומנט קורפ</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>מכשירי</td><td></td> סאטר <td>P87 </td></tr><tr><td>נימה לחולץ אלקטרודות</td><td>מכשירי סאטר</td><td>FB330B</td><td>נימה שוקת רחבה 3.0 מ</td></tr><tr><td>"מ 1.5 מ"מ נימי זכוכית</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B150-4</td><td>Micr&#8211; לקטרודה להקלטת</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309586</td><td>3 מ"ל</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט</td></tr> מלח <tr><td>דגים</td><td></td><td></td><td>מ"מ: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 </td></tr><tr><td>תמיסת אלקטרודה HEPES (תיקון רופף) </td><td></td><td></td><td>מ"מ: 150 NaCl; 3.5 ק"ל; 2.5 CaCl<תת>2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 </td></tr><tr><td>תמיסת אלקטרודות גלוקוז (תיקון תא שלם) </td><td></td><td></td><td>מ"מ: 112.5 K-גלוקונאט; NaCl; 17.5 ק"ל; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 מגה-ATP; 1 EGTA; 10 HEPES; יציאת GTP אחת; 0.1 לאופפטין; 10 פוספו-קריאטין </td></tr></tbody></table>

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

הבנת הפיסיולוגיה של התא של מעגלים עצביים המווסתים את ההתנהגויות מורכבות היא מאוד משופרת באמצעות מערכות מודל שבו ניתן לבצע את העבודה הזאת בהכנת מוח שלמה שבו המעגלים העצביים של מערכת העצבים המרכזית נשארים שלמים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי במוח שלם. יש דגי אוכלוסיות מרובות של נוירונים GnRH, והפונקציות שלהם הן ​​תלויות במיקומם במוח ובגן GnRH שהם מביעים 1. יש לנו התמקדנו בהפגנה שלנו GnRH3 נוירונים הממוקמים בעצבי המסוף (TN) בקשר לנורות חוש הריח באמצעות המוח שלם של דגי medaka מהונדס (איור 1B ו-C). מחקרים מראים שנוירונים TN-GnRH3 Medaka הם neuromodulatory, מתנהגים כמו משדר של מידע מהסביבה החיצונית למערכת העצבים המרכזית; לאהיי לא משחק תפקיד ישיר בויסות תפקודי יותרת המוח, האשכים, כפי שעושה נוירונים ההיפותלמוס GnRH1 הידועים 2, 3. דפוס טוניק של ירי פוטנציאל פעולה הספונטני של תאי עצב TN-GnRH3 הוא מאפיין מהותי 4-6, התדירות מתוכם הוא מווסת על ידי רמזים חזותיים מקונספציפים 2 ו kisspeptin 1 5 נוירופפטידים. בסרטון הזה, אנו משתמשים בקו יציב של מהונדס medaka בי נוירונים TN-GnRH3 להביע transgene המכיל את האזור המקדם של Gnrh3 קשור לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר 7 להראות לך איך לזהות ולעקוב אחר פעילות נוירונים החשמלית שלהם במוח כולו הכנת 6.

דוגמה של אשכולות בין שתי המדינות של ה-GFP שכותרתו GnRH3-TN נוירונים מהמוח של דגים נכרת medaka מוצגת ב1B 1C ודמויות. כל אשכול מכיל כ 8-10 נוירונים GnRH. את הפעילות העצבית הספונטנית של יעד TN-GnRH3 נרשמה במצב נוכחי מהדק (אני = 0) עם שיעורי ירי טיפוסיים של 0.5-6 הרץ. הדפוס של ירי פוטנציאל פעולה הוא בדרך כלל דפוס טוניק או להכות, עם מרווח interspike קבוע למדי. עקבות לדוגמה מוצגות באיור 2 (2 א: רופף-תיקון; 2B: כל התא). <p class="jove_content" style=...

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקליט פעילות חשמלית מנוירונים בתוך הכנה של מוח דג שלם. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה של דג meca טרנסגני בן ארבעה עד שישה חודשים ב-MS 2 22, ולאחר מכן על ידי הוצאת המוח שלו באמצעות דיסקציה. בשלב הבא, יוצר מגע בין אלקטרודת הקלטה לאחד הנוירונים המבוקשים המסומנים ב-GFP, ופעילותו החשמלית מוקלטת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בשיטת loose patch או whole cell patch clamp.בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים בתדירות הפריקה של פוטנציאלי פעולה או שינויים בפוטנציאל הממברנה בתגובה לטיפולים שונים במוח השלם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה של תאים ובתרביות או בהכנות של פרוסות מוח, הוא היכולת לאפיין את התכונות החשמליות של נוירונים בהכנה של מוח שלם עם מעגלים עצביים שלמים. למרות שמדידה זו מספקת תובנות בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה של הרבייה, ניתן ליישמה גם במערכות נוירולוגיות אחרות על ידי שימוש בדגי רסן (resene fish), כגון נוירונים השולטים במוטיבציה ובהתנהגויות רגשיות.הדגמה זו משתמשת בדגי meca טרנסגניות שבהן נוירוני GnRH three מסומנים גנטית ב-GFP. כדי להתחיל, הרדימו דג maka בוגר על ידי טבילה ב-5 mL של MS 2 22. כעשר דקות לאחר הפסקת תנועות הזימים, העבירו את הדג לצלחת פטרי של 60 מ"מ המכילה תמיסת סלין לדגים. כעת, השתמשו במספריים כדי לנתק את ראש הדג בקצה ה-coddle של ה-alum.העבירו את הראש לצלוחית פטרי בקוטר 35 מילימטר, הממולאת עד מחציתה בתמיסת סלין לדגים ומרופדת ב-yl guard. הצלוחית דורשת שקע מרכזי שבו ניתן למקם ולקבע את הראש כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, באמצעות סיכות לחרקים ומספריים עדינים. גזרו בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת לאורך היקפה.לאחר מכן, הסר בעדינות את הגולגולת באמצעות פינצטה כדי לחשוף את החלק הדורסלי של המוח, כולל החלק האנטרי של חוט השדרה. כעת, הרם בעדינות את חוט השדרה באמצעות פינצטה בעלת קצה דק, ולאחר מכן נתק את העצבים המחברים הדו-צדדיים באמצעות מספריים בעלי קצה דק. פעולה זו כוללת את נתיקת העצבים הגולגולתיים, עצבי השדרה, העצבים האופטיים מהצד הוונטרלי והעצבים האולפקטוריים האנטריים.הנח את המוח המנותח במלואו בתוך צלחת פטרי חדשה מלאה בתמיסת סלין לדגים טרייה תחת מיקרוסקופ. בדוק בקפידה שהמוח כולו ובלוטת הפיתואיטרי שלמים ולא נחתכו או ננקבו. השלכ את כל המוחות הפגומים והתחל מחדש באמצעות מחט.יש להניח טיפה קטנה של דבק מהיר, כגון ציאנואקרילט, במרכז תא ההקלטה. יש למרוח את טיפת הדבק על שטח של סנטימטר רבוע. לאחר מכן, יש להעביר במהירות את המוח אל הדבק.קבע אותו כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה. כעת מלא את תא ההקלטה בכ-1 מיליליטר של סליין לדגים כדי לכסות את המוח. בעזרת פינצטה בעלת קצה עדין, הסר בזהירות את הקרומים (meninges) מעל פני השטח של אזור ההקלטה במוח תוך התקדמות קדימה.בצעו פרפוזיה רציפה של המוח במלח פיזיולוגי לדגים מאוורר בקצב של לפחות 200 µL לדקה. הכינו מספר מיקרו-אלקטרודות זכוכית בהתנגדות של 6 עד 10 MΩ ומלאו אותן עד למחציתן בתמיסת loose patch recording. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אנכי עם מצלמת CCD מקוררת, אתרו את נוירוני ה-terminal nerve gn RH three המבטאים GFP, החל משימוש בעדשה עם הגדלה של 10x.לאחר מכן, עברו לעדשה בעוצמה של 40 x ואתרו את הנוירונים על פני השטח הוונטרליים של הבצולות הריחית או בסמיכות אליהם, ממש לפני הצפאלון. כעת עברו למסך וידאו המציג תמונות בזמן אמת מהמיקרוסקופ. צביר הנוירונים מכיל שמונה עד 10 נוירוני GnRH.מקם את המיקרו-אלקטרודה בתוך אמבט תא ההקלטה, כאשר קצה האלקטרודה נמצא מעל הנוירון המטרה. הפעל לחץ חיובי קל וקבוע כדי למנוע סתימה של המיקרו-אלקטרודה. התקרב בעדינות לנוירון המטרה עם קצה האלקטרודה, ובדוק ונטר את התנגדות האלקטרודה באמצעות תוכנת Axo graft.בעת שימוש במבחן האיטום (seal test) במצב clamp של מתח, כאשר קצה האלקטרודה נמצא על פני השטח של הנוירון, התנגדות האלקטרודה משתנה מעט בנקודה זו. שחררו את הלחץ החיובי כדי ליצור איטום בעל התנגדות נמוכה, ובמידת הצורך הפילו לחץ שלילי קל. השלב הקריטי ביותר להקלטה טובה הוא בחירת זרוע עצבית נקייה, דבר שיסייע לכם ליצור איטום אידיאלי בין האלקטרודות לממברנה.כעת עברו למצב clamp של זרם (current clamp). פתחו את תוכנת PowerLab, Chart, והתחילו להקליט באופן רציף את מתח הממברנה ללא הזנת זרם; התאימו את קנה המידה של המתח ואת קצב ההקלטה במידת הצורך. הקליטו את הפעילות החשמלית הבסיסית בתמיסת סלין רגילה לדגים במשך כחמש דקות לפני יישום טיפולים כלשהם. יש להוסיף לpreparat המוח פרפוזיה של תרופות, הורמונים, פפטידים וכדומה, בזרימה של 200 microliters לדקה.לאחר מכן, השתמשו בתמיסת סלין רגילה לדגים לתקופת שטיפה לאחר איתור תא, ובדקו ונטרו את התנגדות האלקטרודה במצב voltage clamp. כאשר קצה האלקטרודה נמצא על פני הנוירון והתנגדות האלקטרודה משתנה מעט, שחררו את הלחץ החיובי והפעילו מעט לחץ שלילי כדי ליצור seal בעל התנגדות גבוהה על הנוירון.בצעו שאיבה עדינה באמצעות הפה. קרעו את ממברנת התא שעברה טלאי (patch). ההתנגדות תרד באופן מיידי לכ-120 עד 250 mega ohms ברגע שקירוע הממברנה יתרחש.כעת עברו למצב current clamp והקליטו באופן רציף את מתח הממברנה באמצעות ה-chart ללא הזנת זרם. שוב, התאימו את קנה המידה של המתח ואת קצב ההקלטה לפי הצורך. לאחר ביצוע הקלטת בסיס של הפעילות החשמלית במילית דגים רגילה למשך כחמש דקות, החילו את הטיפולים ולאחריהם תקופת שטיפה (washout). הפעילויות החשמליות הספונטניות של נוירוני GNRH three בעצב הטרמינלי של moca הוקלטו במצב current clamp.קצב הפריקה הטיפוסי הוא 0.5 עד שישה hertz. פוטנציאלי פעולה נפרקים בדרך כלל בתבנית טונית או פועמת עם מרווח בין-ספייקי (interspike interval) די סדיר, כאשר פוטנציאל הממברנה הבין-ספייקי עומד בממוצע על כמינוס 48 millivolts. גישה ניסיונית זו מצליחה גם ברישום מנוירוני GNRH המסומנים ב-GFP הממוקמים במוח הקדמי של חיות טרנסגניות בוגרות.פעילות חשמלית של נוירונים בדג זברה במוח שלם שהוצא מבעל דג זברה טרנסגני. ההקלטה בוצעה באופן דומה לזה שתואר עבור DACA באמצעות loose patch. אותן טכניקות אפשרו גם הקלטה של תא שלם (whole cell recording).בניגוד לנוירוני GnRH של העצב הטרמינלי במקה, תבנית הפריקה הספונטנית של פוטנציאל הפעולה של נוירוני GnRH בדגי zebrafish באזור ה-pre-op, הצפאלון הוונטרלי וההיפותלמוס היא לרוב לא סדירה. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בשעה אחת עבור הקלטה של 15 דקות, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בהצלחה.

recording-electrical-activity-from-identified-neurons-intact-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

הפרוטוקול מתאר את ההליך לביצוע אלקטרופיזיולוגיה בדגי זברה בוגרים. שיטה זו יכולה לשמש למדידת פעילות עצבית in vivo.

אלקטרופיזיולוגיה של דגי זברה בוגרים: שיטה למדידת הפעילות החשמלית החוץ-תאית של תאי עצב ב-Vivo

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת...

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

חקור הקלטת פעילות חשמלית מנוירונים מזוהים במוח שלם של דג מהונדס באמצעות טכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת ניתוח מעגלים עצביים שלמים ותובנות לנוירואנדוקרינולוגיה.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

גלה סרטונים נוספים