הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקליט פעילות חשמלית מנוירונים בתוך הכנה של מוח דג שלם. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה של דג meca טרנסגני בן ארבעה עד שישה חודשים ב-MS 2 22, ולאחר מכן על ידי הוצאת המוח שלו באמצעות דיסקציה. בשלב הבא, יוצר מגע בין אלקטרודת הקלטה לאחד הנוירונים המבוקשים המסומנים ב-GFP, ופעילותו החשמלית מוקלטת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בשיטת loose patch או whole cell patch clamp.

בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים בתדירות הפריקה של פוטנציאלי פעולה או שינויים בפוטנציאל הממברנה בתגובה לטיפולים שונים במוח השלם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה של תאים ובתרביות או בהכנות של פרוסות מוח, הוא היכולת לאפיין את התכונות החשמליות של נוירונים בהכנה של מוח שלם עם מעגלים עצביים שלמים. למרות שמדידה זו מספקת תובנות בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה של הרבייה, ניתן ליישמה גם במערכות נוירולוגיות אחרות על ידי שימוש בדגי רסן (resene fish), כגון נוירונים השולטים במוטיבציה ובהתנהגויות רגשיות.

הדגמה זו משתמשת בדגי meca טרנסגניות שבהן נוירוני GnRH three מסומנים גנטית ב-GFP. כדי להתחיל, הרדימו דג maka בוגר על ידי טבילה ב-5 mL של MS 2 22. כעשר דקות לאחר הפסקת תנועות הזימים, העבירו את הדג לצלחת פטרי של 60 מ"מ המכילה תמיסת סלין לדגים. כעת, השתמשו במספריים כדי לנתק את ראש הדג בקצה ה-coddle של ה-alum.

העבירו את הראש לצלוחית פטרי בקוטר 35 מילימטר, הממולאת עד מחציתה בתמיסת סלין לדגים ומרופדת ב-yl guard. הצלוחית דורשת שקע מרכזי שבו ניתן למקם ולקבע את הראש כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, באמצעות סיכות לחרקים ומספריים עדינים. גזרו בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת לאורך היקפה.

לאחר מכן, הסר בעדינות את הגולגולת באמצעות פינצטה כדי לחשוף את החלק הדורסלי של המוח, כולל החלק האנטרי של חוט השדרה. כעת, הרם בעדינות את חוט השדרה באמצעות פינצטה בעלת קצה דק, ולאחר מכן נתק את העצבים המחברים הדו-צדדיים באמצעות מספריים בעלי קצה דק. פעולה זו כוללת את נתיקת העצבים הגולגולתיים, עצבי השדרה, העצבים האופטיים מהצד הוונטרלי והעצבים האולפקטוריים האנטריים.

הנח את המוח המנותח במלואו בתוך צלחת פטרי חדשה מלאה בתמיסת סלין לדגים טרייה תחת מיקרוסקופ. בדוק בקפידה שהמוח כולו ובלוטת הפיתואיטרי שלמים ולא נחתכו או ננקבו. השלכ את כל המוחות הפגומים והתחל מחדש באמצעות מחט.

יש להניח טיפה קטנה של דבק מהיר, כגון ציאנואקרילט, במרכז תא ההקלטה. יש למרוח את טיפת הדבק על שטח של סנטימטר רבוע. לאחר מכן, יש להעביר במהירות את המוח אל הדבק.

קבע אותו כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה. כעת מלא את תא ההקלטה בכ-1 מיליליטר של סליין לדגים כדי לכסות את המוח. בעזרת פינצטה בעלת קצה עדין, הסר בזהירות את הקרומים (meninges) מעל פני השטח של אזור ההקלטה במוח תוך התקדמות קדימה.

בצעו פרפוזיה רציפה של המוח במלח פיזיולוגי לדגים מאוורר בקצב של לפחות 200 µL לדקה. הכינו מספר מיקרו-אלקטרודות זכוכית בהתנגדות של 6 עד 10 MΩ ומלאו אותן עד למחציתן בתמיסת loose patch recording. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אנכי עם מצלמת CCD מקוררת, אתרו את נוירוני ה-terminal nerve gn RH three המבטאים GFP, החל משימוש בעדשה עם הגדלה של 10x.

לאחר מכן, עברו לעדשה בעוצמה של 40 x ואתרו את הנוירונים על פני השטח הוונטרליים של הבצולות הריחית או בסמיכות אליהם, ממש לפני הצפאלון. כעת עברו למסך וידאו המציג תמונות בזמן אמת מהמיקרוסקופ. צביר הנוירונים מכיל שמונה עד 10 נוירוני GnRH.

מקם את המיקרו-אלקטרודה בתוך אמבט תא ההקלטה, כאשר קצה האלקטרודה נמצא מעל הנוירון המטרה. הפעל לחץ חיובי קל וקבוע כדי למנוע סתימה של המיקרו-אלקטרודה. התקרב בעדינות לנוירון המטרה עם קצה האלקטרודה, ובדוק ונטר את התנגדות האלקטרודה באמצעות תוכנת Axo graft.

בעת שימוש במבחן האיטום (seal test) במצב clamp של מתח, כאשר קצה האלקטרודה נמצא על פני השטח של הנוירון, התנגדות האלקטרודה משתנה מעט בנקודה זו. שחררו את הלחץ החיובי כדי ליצור איטום בעל התנגדות נמוכה, ובמידת הצורך הפילו לחץ שלילי קל. השלב הקריטי ביותר להקלטה טובה הוא בחירת זרוע עצבית נקייה, דבר שיסייע לכם ליצור איטום אידיאלי בין האלקטרודות לממברנה.

כעת עברו למצב clamp של זרם (current clamp). פתחו את תוכנת PowerLab, Chart, והתחילו להקליט באופן רציף את מתח הממברנה ללא הזנת זרם; התאימו את קנה המידה של המתח ואת קצב ההקלטה במידת הצורך. הקליטו את הפעילות החשמלית הבסיסית בתמיסת סלין רגילה לדגים במשך כחמש דקות לפני יישום טיפולים כלשהם. יש להוסיף לpreparat המוח פרפוזיה של תרופות, הורמונים, פפטידים וכדומה, בזרימה של 200 microliters לדקה.

לאחר מכן, השתמשו בתמיסת סלין רגילה לדגים לתקופת שטיפה לאחר איתור תא, ובדקו ונטרו את התנגדות האלקטרודה במצב voltage clamp. כאשר קצה האלקטרודה נמצא על פני הנוירון והתנגדות האלקטרודה משתנה מעט, שחררו את הלחץ החיובי והפעילו מעט לחץ שלילי כדי ליצור seal בעל התנגדות גבוהה על הנוירון.

בצעו שאיבה עדינה באמצעות הפה. קרעו את ממברנת התא שעברה טלאי (patch). ההתנגדות תרד באופן מיידי לכ-120 עד 250 mega ohms ברגע שקירוע הממברנה יתרחש.

כעת עברו למצב current clamp והקליטו באופן רציף את מתח הממברנה באמצעות ה-chart ללא הזנת זרם. שוב, התאימו את קנה המידה של המתח ואת קצב ההקלטה לפי הצורך. לאחר ביצוע הקלטת בסיס של הפעילות החשמלית במילית דגים רגילה למשך כחמש דקות, החילו את הטיפולים ולאחריהם תקופת שטיפה (washout). הפעילויות החשמליות הספונטניות של נוירוני GNRH three בעצב הטרמינלי של moca הוקלטו במצב current clamp.

קצב הפריקה הטיפוסי הוא 0.5 עד שישה hertz. פוטנציאלי פעולה נפרקים בדרך כלל בתבנית טונית או פועמת עם מרווח בין-ספייקי (interspike interval) די סדיר, כאשר פוטנציאל הממברנה הבין-ספייקי עומד בממוצע על כמינוס 48 millivolts. גישה ניסיונית זו מצליחה גם ברישום מנוירוני GNRH המסומנים ב-GFP הממוקמים במוח הקדמי של חיות טרנסגניות בוגרות.

פעילות חשמלית של נוירונים בדג זברה במוח שלם שהוצא מבעל דג זברה טרנסגני. ההקלטה בוצעה באופן דומה לזה שתואר עבור DACA באמצעות loose patch. אותן טכניקות אפשרו גם הקלטה של תא שלם (whole cell recording).

בניגוד לנוירוני GnRH של העצב הטרמינלי במקה, תבנית הפריקה הספונטנית של פוטנציאל הפעולה של נוירוני GnRH בדגי zebrafish באזור ה-pre-op, הצפאלון הוונטרלי וההיפותלמוס היא לרוב לא סדירה. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בשעה אחת עבור הקלטה של 15 דקות, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בהצלחה.