הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג ביטוי גנים מוגבל מרחבית בחוט השדרה של העכבר על ידי הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי לקרן הגב המותני. השלב הראשון בהליך הוא איתור וחשיפת החוליה המותנית. השלב השני הוא הסרת החלק הגבי של החוליה על מנת לחשוף את חוט השדרה.

הליך שנקרא למינקטומיה. לאחר מכן, פיפטת זכוכית המחוברת למשאבת מזרק מיקרו ממוקמת מעל קרן הגב ומורידה לחוט השדרה. השלב האחרון הוא הזרקה איטית של מתלה הווקטור.

שבועיים לאחר מכן, טרנספקציה של נוירונים בקרן הגב מודגמת על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק, המאפשר לעקוב אחר התפלגות הנגיף. שיטה זו מסייעת להבהיר את תפקוד הנוירונים בחלק מהמסלול החושי. אנו משתמשים בו במחקרים המתמקדים במיוחד בהתפתחות כאב דלקתי או נוירופתי.

הדגמה חזותית היא קריטית ללימוד כיצד למקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקטית. זה, חיוני להצלחת ההליך שעמוד השדרה יתוקן כראוי מכיוון שכריתת הלמינקטומיה היא טכניקה כל כך עדינה. מרטין מול, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, ידגים את ההליך.

ג'ון וואנג, עוזר מחקר, יעזור לו יום או יומיים לפני ההליך. פיפטות זכוכית פול לקבלת קוטר קצה של 40 מיקרומטר ושיפוע הקצה בזווית של 20 מעלות ביום הניתוח. התחל את ההליך על ידי חיטוי הציוד הניתוחי והכנת כלי הניתוח הסטריליים להקמת המסגרת הסטריאוטקסית.

התקן את מזרק המיקרו מזרק על המניפולטור וחבר את המכשיר לחשמל. חבר את אחת מפיפטות הזכוכית למזרק המיקרו באמצעות אביזר הדחיסה. כעת הסר את הבוכנה ממזרק המיקרו.

מלאו את המזרק בשמן המינרלי, ואז הכניסו מחדש את הבוכנה ודחפו אותה עד הקצה. הימנע בזהירות מיצירת בועות אוויר. לאחר מכן הכנס את מזרק המיקרו למחזיק על המזרק.

לאחר מכן, הוציאו את הנגיף מהמקפיא והכינו את תרחיף חלקיקי הנגיף ממש לפני השימוש על ידי דילול שלו במי מלח סטריליים עם פוספט לריכוז החלקיקים הרצוי. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של תרחיף הנגיף על חתיכת פרם קטנה. לאחר מכן הורד את קצה פיפטת הזכוכית לתוך הטיפה ומשוך את הבוכנה כדי למלא את מזרק המיקרו.

בסוף. צור בועת אוויר קטנה בקצה הפיפטה כדי למנוע את סתימתה. בשלב זה, הכינו את אזור הניתוח על ידי ניגוב הספסל בכרית החימום בחומר חיטוי.

לאחר מכן להרדים את העכבר על ידי שאיפת פלואור. לאחר מכן, מרחו חומר סיכה על כל עין כדי להגן עליהן מפני ייבוש במהלך הניתוח לאחר מכן, גלחו את הפרווה מהגב התחתון ועד צוואר העכבר. יש לחטא את העור במגבונים לסירוגין של חומר חיטוי מקומי, כגון כלורהקסידין או פובידון יוד, ואתנול 70%.

לאחר מכן הסתנן לאתר החתך עם 0.25% בופיבקאין מדולל אחד עד 10 עם מי מלח פיזיולוגיים. לאחר מכן חתך את העור בקצה הקיפוד של כלוב הצלעות, שניים עד שלושה סנטימטרים לאורך קו האמצע והפריד את הפאשיה המכסה את עמוד השדרה. זהה את חוליה L אחת, הממוקמת מחוברת לחוליה, אוחזת בזוג הצלעות האחרון וחשוף אותה על ידי הסרת שרירי עמוד השדרה הקטנים והרצועות המחוברות למשטח הגב שלה.

לאחר מכן הרם מעט והחזק את חוליה L אחת עם זוג תוספות ומלקחיים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ייעודיים לכריתת למינקטומיה כדי להסיר את החלק הגבי של החוליה, כולל התהליך הקוצני והלמינה כדי לחשוף את חוט השדרה. הימנע מפגיעה בדורה מאטר או בחוט השדרה במהלך הליך זה.

לאחר מכן העבירו את העכבר על צלחת חימום במסגרת הסטריאוטקסית ועקבו אחר טמפרטורת העכבר במהלך הפעולה שלאחר מכן. כעת השתמש בקוצים של חריץ V כדי לייצב את עמוד השדרה כך שהחוליה לא תזוז במהלך הנשימה. לאחר מכן, קרבו את מזרק המיקרו כך שקצה הפיפטה יהיה מעל אתר כריתת הלמינקטומיה.

הורד את הבוכנה עד שתראה את תרחיף הנגיף יוצא מהפיפטה. הסר את הטיפה בעזרת גזה סטרילית. לאחר מכן מקם את קצה הפיפטה בחלק הרוסטרלי ביותר של חוט השדרה החשוף.

מרכז את הפיפטה מעל החריץ החציוני האחורי והזיז את הקצה 500 מיקרומטר לרוחב. לאחר מכן, הורד את הקצה אל פני החוט ונקב את הדורה מאטר. לאחר מכן, הורד את קצה הזכוכית, פיפטה 300 מיקרומטר לחוט השדרה.

הזרקו מיקרוליטר אחד של תרחיף וירוסים בקצב של 200 ננוליטר לדקה. בתום ההזרקה, המתן לפחות שתי דקות לפני שתחזיר לאט את הפיפטה. חזור על הליך ההזרקה בחלק המקפל ביותר של חוט השדרה החשוף כדי להשיג פיזור מלא של הווקטור הנגיפי בקטע עמוד השדרה L 4.

שני אתרי ההזרקה ממוקמים רוסטרל וקונדל למקטע L ארבע. כדי למנוע נזק לרקמות באזור המטרה לאחר שחרור ההזרקה, חוליה L אחת מחריץ V מהדקת ומסירה את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. לאחר מכן, תפר את הפאשיה עם חמישה או ויקריל.

הפאשיה הסגורה מספקת כיסוי לאתר כריתת הלמינקטומיה. ואז סגור את העור עם תפרי ניילון או סיכות כירורגיות. ספק משככי כאבים לאחר ניתוח למשך 72 שעות עם זריקות תת עוריות יומיות של קרפרופן בחמישה מיליגרם לקילוגרם.

העבירו את העכבר לכלוב התאוששות עם מצעים רכים ולא מיוחדים. הנח את העכבר בצד לנשימה נוחה. לאחר מכן עקוב אחר החיה עד שהיא ערנית לחלוטין.

אמבולנס ומתחיל לשתות. עקוב אחר ההתאוששות לאחר הניתוח על ידי בדיקה יומית בשלושת הימים הראשונים. ואז כל יומיים או שלושה ימים בשבוע עד להשלמת הניסוי.

שבעה עד 10 ימים לאחר הניתוח כאשר ריפוי הפצע הושלם. הסר את תפרי העור או הסיכות. איור זה מציג את הביטוי של חלבון מדווח פלואורסצנטי ירוק משופר או EGFP בקרן הגב השמאלית של חוט השדרה L 4.

שבועיים לאחר ההזרקה הסטריאוטקסית של נוירונים R-A-A-V-E-G-F-P היו אימונוסטיים עבור חלבון גרעיני עצב המוצג בראש חץ אדום. הצבע על תאי גליה מפוזרים בעמודה הגבית. כ-80% מהנוירונים בקרן הגב האמצעית נדבקו בתרגול.

ניתן להשלים את ההליך תוך 30 עד 40 דקות, ואנא זכרו לשמור על תנאים סטריליים במהלך ההליך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע זריקות צ'ימלים תוך-אורן למינון הו של חוט השדרה של העכבר. אנו משתמשים בטכניקה למניפולציה גנטית, אך אתה יכול להתאים אותה למטרות אחרות כגון יישום תרופות תוך שדרתיות.