Name: הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי לביטוי גני ממוקד בחוט השדרה המאוסי. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית בקרנית הגב הלומברית לחקר תפקוד עצבי ומנגנוני כאב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Bakhos א טנוס, Ph.D., מנהל פיתוח וקטור וההפקה במרכז למדעי מוח בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס, Charlestown, מסצ&#39;וסטס, שספק לנו את וקטור rAAV-eGfp, וג&#39;ון בנג לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 NS050408 (לי.ס.) מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ.

ההליך כירורגי תאר אושר על ידי בעלי החיים וטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת קולומביה. 1. הכנת הציוד והשעית חלקיקי וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ולחטא את הציוד, לעקר את מכשירי ניתוח ואת הקוצים לחרוץ V שישמשו לתיקון החוליה L1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך וpipettes זכוכית פוע. אנו משתמשים pipettes בעלי קוטר קצה של 40 מיקרומטר והם משופעים בזווית של 20 מעלות. לעקר את pipettes הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מסגרת stereotaxic, הר microsyringe המזרק על מניפולטור ולהתחבר למזרק הבקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אחד מpipettes הזכוכית לשימוש בערכת microsyringe הולמת הדחיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבוכנה מmicrosyringe ולמלא את המזרק עם שמן מינרלים. השמן האדום O (1 - (2,5-דימתיל-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-naphthol) ניתן יהיה להוסיף לשמן המינרלים להגדיל visibility. החזר את הבוכנה ולדחוף אותו לכל אורך הדרך עד לקצה. זהירות להימנע מיצירת בועת אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעית חלקיקי הנגיף בארון בטיחות ביולוגי. הפשר את הווירוס הקפוא על קרח, ורגע לפני השימוש, לדלל אותו עם סטרילי שנאגר מלוח פוספט לריכוז החלקיקים הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microsyringe לתוך המחזיק במזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl פיפטה של השעית הווירוס על גבי יריעת פלסטיק קטנה, למשל Parafilm. הנמך את קצה פיפטה זכוכית לירידה ומשוך את הבוכנה למלא microsyringe. יצירת בועת אוויר קטנה בקצה פיפטה כדי למנוע ממנה הסתימה. </li></ol> 2. Laminectomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אזור הניתוח על ידי ניגוב ספסל וכרית חימום עם חומר חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את העכבר. אנו משתמשים בהרדמת משאיפת עם isoflurane (3% במהלך אינדוקציה, 2% -3% במהלך תחזוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חומר סיכה על כל עין כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלךפעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הפרווה מהגב התחתון לצוואר של העכבר ולחטא את העור עם לסירוגין מגבונים של חיטוי אקטואלי כגון כלורהקסידין או povidone-יוד ו70% אתנול. לבודד את האתר נקי מחיידקים, שהוכן עם וילון כירורגית ולחדור אתר החתך עם bupivacaine (0.25%, 1:10 מדוללים עם תמיסת מלח פיזיולוגית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך העור בקצה הזנב של כלוב הצלעות לאורך קו האמצע (2-3 סנטימטר) ולהפריד את fascia מכסה את עמוד שדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כי חוט השדרה מפסיק לגדול מוקדם יותר במהלך התפתחות לאחר לידה מעמוד השדרה, קטע שדרת L4 טמון מתחת לחוליה הראשונה (L1). חולית L1 נמצא זנב לחוליה שמחזיקה את הזוג האחרון של צלעות. לזהות ולחשוף את החוליה L1 ידי הסרה את השרירים והרצועות בעמוד השדרה הקטנים צמודות למשטח הגב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעט להרים ולהחזיק L1 חוליה עם כ מלקחי Adson. השתמש במלקחי Laminectomy ייעודיים להסרת portio הגבהn של החוליה (עמוד שדרה וlamina) ולחשוף את חוט השדרה. להימנע מהפגיעה בחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על גבי צלחת החימום במסגרת stereotaxic. לנטר את הטמפרטורה של העכבר במהלך המבצע הבא. </li></ol> 3. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן החוליה L1 עם קוצים לחרוץ V. את הקוצים חייבים לייצב את עמוד השדרה, כך שהחוליה לא זזה במהלך נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא microsyringe קרוב יותר, כך שקצה פיפטה הוא מעל אתר laminectomy. מנמיך את הבוכנה, עד שאתה רואה את השעית וירוס יציאת פיפטה. הסר את האגל בקצה כותנת סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה פיפטה במקורי ביותר חלק מחוט השדרה החשופה. מרכז פיפטה לעיל מענית החציון האחורית, ואז להעביר את הקצה רוחבי 500 מיקרומטר. הנמך את הקצה אל פני השטח של החוט ולנקב את דורת מאטר, או אם אתה עובד עם כוס טפטפה unbeveled, השתמש צינורית פלדה משופעת לנקב דURA. הנמך את הקצה של 300 מיקרומטר זכוכית פיפטה לתוך חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק μl 1 מתוך השעית וירוס בשיעור של 200 nl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הזריקה, לחכות לפחות 2 דקות לפני לאט חוזר בי פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.3-3.5 בזנב ביותר החלק מחוט השדרה החשופה כדי להשיג הפצה מלאה של וקטור ויראלי בL4 קטע שדרה. שני אתרי ההזרקה נמצאים מקורי וזנב של L4 המגזר, כדי למנוע ניזק לרקמות באזור היעד. </li></ol> 4. סגירת פצעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור החוליה L1 ממהדקי חריץ V ולהסיר את העכבר ממסגרת stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור fascia עם 5.0 vicryl. Fascia הסגור מספק כיסוי לאתר laminectomy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם תפרי ניילון או סיכות ניתוחיות. </li></ol> 5. טיפול לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר לכלוב התאוששות עם מצעים רכים, nonparticular. מניח אותו על לאהוא הצד לנשימה נוחה. פקח את החיה עד שהוא ערני לחלוטין, נודד ומתחיל לשתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מספקים שיכוך כאבים לאחר ניתוח במשך 72 שעות ביום זריקות תת עורית של carprofen (5.0 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקח על התאוששות לאחר ניתוח על ידי בדיקה יומית במשך 3 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר, או 3 ימים בשבוע עד לניסוי הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תפרי העור או סיכות 7 עד 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר ריפוי פצע הוא מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו לאחר השלמת הניסוי. </li></ol>

<ol><li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent%2C+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
<li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li>
<li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li>
<li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li>
<li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li>
<li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li>
<li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).</li>
<li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li>
<li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+%28rAAV2%2F6%29-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pain%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52(2009).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הזרקת הווקטור Stereotaxic מאפשרת מיקוד תאי עצב בחוט שדרה עבור יישומים כגון מיפוי רשת עצבית המבוסס על הנגיף מתפשט transsynaptic 6,7 או נתיחת optogenetic 8, הדרכת האקסון במהלך רגנרציה מפציעת 9,10, או טיפול גנטי למניעה או הטיפול של 11 ניוון מוחיה, 12. וקטורים נגיפיים שמשו במשך מניפולציה גנטית בחוט השדרה ללמוד מסלולים חושיים, מוטוריים ואוטונומי 9,10,13-15. העכבר הוא אורגניזם המודל הנפוץ ביותר במחקרים שכלל זריקת stereota...

טכנולוגיות מתקדמות של מניפולציה גנטית מותנית בעכבר מאפשרות גישות רבות פנים לחקר מסלולים וקשרים סינפטיים תפקודיים במערכת העצבים המרכזית. Transgenes עשוי להיות מוסדר על ידי effectors מולקולה קטנה כגון דוקסיציקלין פועלת על transactivator טטרציקלין מבוקר, אשר יכול להיות מתוכנן לתפקד כמדכא או activator של שעתוק גנים, או טמוקסיפן הכרת תחום מוטצית יגנד מחייב של קולטן אסטרוגן 1 . שינוי בלתי הפיך transgene מושגת בדרך כלל על ידי חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) recombinases. Cre (רקומבינציה סיבות) וFLP (אנזים רקומבינציה flippase) לזרז את הכריתה, היפוך או טרנסלוקציה של מקטעי דנ&quot;א המוקפים loxP (לוקוס של x המעבר מעל, P1) או FRT (יעד ההכרה flippase) אתרים בהתאמה 1. יישומים כוללים הפעלת גן או השתקה וחומצה ריבונוקלאית מושרה (RNA) הפרעות <sup<html> &gt; 2. ביטוי תנאי כתבי ניאון או האנזימטית כגון β-גלקטוזידאז או phosphatase אלקליין ניתן להשתמש כדי לתייג תאי עצב ולבדוק את הארגון וקישוריות 3 האקטואליים שלהם. פרויקטי mutagenesis רחב היקף בצפון אמריקה <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">(http://www.norcomm.org/index.htm)</a> ובאירופה <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">(http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm)</a> מייצרים ספריות של שיבוטי תאי גזע עובריים של עכברים עם יעדים מותנים גנים ומלכודות שסופו של דבר מכסים את כל גנום העכבר. עכברים שנוצרו משיבוטים אלה עשויים להיות חצו עם מספר ההולך וגדל של קווי עכברים שמבטאים recombinases DNA תחת יזמים או לוקוסים ספציפיים לאוכלוסייה מסוימת של תאי עצב למניפולציה גנטית סלקטיבי <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">(http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . Php).</a> = &quot;Jove_content&quot;&gt; עם זאת, הגבלת מניפולציה גנטית לאוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של עניין לא יכולה להיות מושגת על ידי מיקוד גנטי לבד אם אמרגן ספציפי לאוכלוסיית הנוירון של ריבית אינו ידוע או שאינו באו לידי ביטוי בכל תאי העצב באזור של עניין. בחוט השדרה, עיצובים ניסיוניים עשויים לדרוש הגבלה המרחבי של המניפולציה הגנטית לקטע אחד או שתיים craniocaudal. הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי שמבטא Cre או FLP מאפשר הגבלת רקומבינציה גן לאזורים בחוט השדרה של עכברים שבברי DNA הם מוקפים אתרי FRT loxP או, מה שמכונה אללים floxed או flrted. בניגוד לארגון מחדש דנ&quot;א מכונן, אשר יגרום מהכלאת החיות עם עכברים המבטאים recombinase, אסטרטגיה זו גם מספקת שליטה זמנית על הפעלת גן או השתקה. וקטורים ויראליים קידוד floxed או פלירטט transgenes להציע אופציה הפוכה של מניפולציה גנטית בעכברים המבטאות את corresponding מורד recombinase של אמרגן נוירון ספציפי. כמה וקטורים רקומביננטי עם זיקה לנוירונים זמינים 4. קיבולת גבוהה אדנווירוס (פחדן), וירוס adeno-משויך, וירוס הרפס סימפלקס וlentivirus משמשים וקטורי neurotropic. בחירת הווירוס המתאים לשאלת מחקר היא חלק מכריע בעיצוב ניסיוני. גודל transgene, מסלול משלוח, סגולי של הזיהום לנוירונים בניגוד לתאי גליה, יעילות זיהום, תופעות לוואי רעילות דלקתיות וצריכות להילקח בחשבון 4. כאן אנו מתארים את זריקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית של חוט השדרה, טכניקה שאנו נוקטים לויסות גנים מותנות במחקר שלנו על נוירוביולוגיה של כאב. הקרן הגבתה מקבלת קלט מביא מהנוירונים חושיים עיקריים כוללים נוירונים nociceptive. interneurons המקומי לעבד את המידע לפני נוירונים הקרנה להעביר אותו מקרן האחורית למוח 5. אנחנו מדגימים את הזיהום של נוירונים קרן אחורית ברמה מגזרית שדרת L4 עם וירוס neurotropic אדנו-משויך (rAAV) שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGfp) תחת אמרגן ציטומגלווירוס constitutively פעיל.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td></td></tr><tr><td> צלחת בסיס עמוד שדרה </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> מכשיר stereotaxic חיה קטן </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> בעל ראש הרדמת גז מאוס </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> mounts הבסיס מתכוונן </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> קוצי V לחרוץ </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת בקרת טמפרטורת חיה קטנה </td><td> דוד קופף מכשירים </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחי Laminectomy </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (1) עם SYS-Micro4 בקר </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microsyringe, 65RN </td><td> המילטון </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN דחיסה המתאימה, 1 מ&quot;מ </td><td> המילטון </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית נימים </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

הזרקת Intraparenchymal של וקטור ויראלי מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית באוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית. אנחנו מדגימים את טכניקת הזרקת stereotaxic המאפשרת ביטוי ממוקד גן או השתקה בקרן האחורית של חוט שדרת העכבר. הליך הכירורגים קצר. זה דורש laminectomy של חוליה אחת, לספק להתאוששות מהירה של בעל החיים שאינם פגומה ותנועתיות של עמוד השדרה. הזרקה מבוקרת של נפח השעית וקטור קטן במהירות ושימוש נמוך של microsyringe עם צינורית זכוכית משופעת למזער את הפגיעה ברקמות. התגובה החיסונית המקומית לווקטור תלוי במאפיינים הפנימיים של הווירוס מועסק; בניסיון שלנו, זה קל וקצר ימים, כאשר וירוס אדנו הקשורים בשימוש. גן כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאפשר פיזור המרחבי ניטור של הווקטור, ואת היעילות והסלולרי specificity של transfection.

תשואות transfection מוצלחות ביטוי גנים בתאי עצב חזק של קרן האחורית הזרקה (איור 1), שאינו מרבה הקרן האחורית של הצד הנגדי, הקרן הבטנית וגרעיני השורש הגבו. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. Transfection של נוירונים קרן אחורית. () ביטוי של eGfp כתב הניאון (ירוק) בקרן האחורית השמאלית של חוט שדרת L4, שבועות לאחר הזרקת stereotaxic של rAAV-eGfp...

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשיג ביטוי גנים מוגבל מרחבית בחוט השדרה של עכבר, באמצעות הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי לקרן הגב המותנית (lumbar dorsal horn). השלב הראשון של הפרוצדורה הוא איתור וחשיפה של חוליה מותנית. השלב השני הוא הסרת החלק הגבי של החוליה כדי לחשוף את חוט השדרה.הליך המכונה למינקטומיה (laminectomy). לאחר מכן, פיפטת זכוכית המחוברת למשאבת מזריקה מיקרוסקופית ממוקמת מעל הקרן הגבית (dorsal horn) ומונמכת אל תוך חוט השדרה. השלב האחרון הוא הזרקה איטית של תגלי התוכן של הווקטור.שבועיים לאחר מכן, התעברות (transfection) של נוירונים בקרן הגב מודגמת על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק, המאפשר מעקב אחר התפזורות של הווירוס. שיטה זו מסייעת להבהיר את תפקודם של נוירונים בחלק ממסלולי התחושה. אנו משתמשים בה במחקרים המתמקדים ספציפית בפיתוח של כאב דלקתי או נוירופתי.הדגמה חזותית היא קריטית ללמידה כיצד למקם את העכבר בתוך המסגרת הסטראאוטקטיקה. זהו שלב חיוני להצלחת הפרוצדורה, שכן יש לקבע את עמוד השדרה כראוי מכיוון שהלמינקטומיה היא טכניקה עדינה מאוד. מרטין מול, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי, ידגים את הפרוצדורה.ג'ון וואנג, עוזר מחקר, יסייע לו יום או יומיים לפני הפרוצדורה. יש למשוך פיפטות זכוכית כדי להגיע לקוטר קצה של 40 micrometers ולשייף את הקצה בזווית של 20 degrees ביום הניתוח. יש להתחיל את הפרוצדורה בחיטוי הציוד הכירורגי והכנת הכלים הכירורגיים הסטריליים להקמת המסגרת הסטריאוטקסית.התקן את מזרק המיקרו-הזרקה על המניפולטור וחבר את המכשיר לחשמל. חבר אחת מהפיפטות הזכוכית למזרק המיקרו באמצעות מחבר לחיצה. כעת, הוצא את הבוכנה ממזרק המיקרו.מלאו את המזרק בשמן מינרלי, לאחר מכן החזירו את הבוכנה ודחפו אותה עד לקצה. הימנעו בזהירות מיצירת בועות אוויר. לאחר מכן, הכניסו את המיקרו-מזרק למחזיק שבמזרק האוטומטי (injector).בשלב הבא, הוציאו את הווירוס מהמקפיא והכינו את תרחיף חלקיקי הווירוס רגע לפני השימוש על ידי דילולו עם תמיסת סליין פוספטית סטרילית (phosphate buffered saline) עד לריכוז החלקיקים הרצוי. העבירו בעזרת פיפט חמישה µL מתרחיף הווירוס על גבי פיסה קטנה של פראם (param). לאחר מכן, הכניסו את קצה פיפט הזכוכית לתוך הטיפה ומשכו את הבוכנה כדי למלא את המיקרו-מזרק.בסיום, צור בועת אוויר קטנה בקצה הפ pipette כדי למנוע סתימה. בשלב זה, הכן את אזור הניתוח על ידי ניגוב משטח העבודה שעל משטח החימום בחומר חיטוי.לאחר מכן, הרדימו את העכבר באמצעות שאיפת isof fluorine. לאחר מכן, מרחו חומר סיכה על כל עין כדי להגן עליהן מהתייבשות במהלך הפעולה. לאחר מכן, גלחו את הפרווה מהגב התחתון ועד לצוואר של העכבר. חטאו את העור בניגובים לסירוגין של חומר חיטוי מקומי, כגון chlorhexidine או povidone iodine, ו-70% ethanol.לאחר מכן, בצעו חדרת נוזלים (infiltrate) לאתר החתך באמצעות 0.25% bupivacaine המדולל ביחס של 1 ל-10 בסליין פיזיולוגי. לאחר מכן, חתכו את העור בקצה הקודלי של כלוב הצלעות, שני עד שלושה סנטימטרים לאורך קו האמצע, והפרידו את הפסציה המכסה את עמוד השדרה. זהו את חוליה L1, הנמצאת קודלית לחוליה הנושאת את זוג הצלעות האחרון, וחשפו אותה על ידי הסרת שרירי השדרה הקטנים והרצועות המחוברות למשטחה הגבי (dorsal).לאחר מכן, הרם מעט והחזק את חוליה L1 באמצעות פינצטה וצבת. לאחר מכן, השתמש בצבת ייעודית ללמינקטומיה כדי להסיר את החלק הגבי של החוליה, כולל התהליכים הספניאליים והלמינה, כדי לחשוף את חוט השדרה. הימנע מגרימת נזק לקרום העצבי (dura mater) או לחוט השדרה במהלך הליך זה.לאחר מכן, העבירו את העכבר אל לוח חימום בתוך המסגרת הסטריאוטקסית ועקבו אחר טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך הפרוצדורה הבאה. כעת השתמשו במסמרי ה-v notch כדי לייצב את עמוד השדרה, כך שחוליה לא תזוז במהלך הנשימה. לאחר מכן, קרבו את המיקרו-מזרק כך שקצה הפ pipette יהיה מעל אתר הלמינקטומיה.הורד את הבוכנה עד שתראה את תרחיף הנגיף יוצא מהפיפטה. הסר את הטיפה באמצעות גזה סטרילית. לאחר מכן, מקם את קצה הפיפטה בחלק הרוסטרלי ביותר של חוט השדרה החשוף.מרכזו את הפפיטה מעל ה-posterior median sulcus והזיזו את הקצה 500 micrometers לצד. לאחר מכן, הורידו את הקצה אל פני השטח של חוט השדרה ונקבו את ה-dura mater. לאחר מכן, הורידו את קצה הפפיטה מזכוכית 300 micrometers לתוך חוט השדרה.הזריק מיקרוליטר אחד של תמיסת הנגיף בקצב של 200 ננוליטר לדקה. בסיום ההזרקה, המתן לפחות שתי דקות לפני נסיגה איטית של הפ pipette. חזור על הליך ההזרקה בחלקים הכפופים ביותר של חוט השדרה החשוף כדי להשיג פיזור מלא של הווקטור הנגיפי בסגמנט עמוד השדרה L four.שני אתרי ההזרקה ממוקמים בעמדה רוסטרלית וקודאלית למקטע L4. כדי למנוע נזק לרקמה באזור היעד לאחר שחרור ההזרקה, שחרר את חרטומי ה-V notch מחוליה L1 והוצא את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסיות. לאחר מכן, תפר את הפסציה באמצעות 5-0 Vicryl.הפשיה הסגורה מספקת כיסוי לאתר הלמינקטומיה. לאחר מכן, סגרו את העור באמצעות תפרי ניילון או סיכות כירורגיות. ספקו אלגזיה לאחר הניתוח למשך 72 שעות באמצעות הזרקות תת-עוריות יומיות של carprofen במינון של five milligrams per kilogram.העבירו את העכבר לכלוב התאוששות עם מצע רך שאינו גרגירי. הניחו את העכבר על צדו כדי לאפשר נשימה נוחה. לאחר מכן, עקבו אחר בעל החיים עד שיהיה ער לחלוטין.מוביל לאמבולנס ומתחיל לשתות. יש לנטר את ההחלמה לאחר הניתוח באמצעות בדיקה יומית בשלושת הימים הראשונים. לאחר מכן, בכל יום שני או שלושה ימים בשבוע עד לסיום הניסוי.שבעה עד 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר ריפוי הפצע הושלם. הסר את תפרי ה-, או את הסיכות של העור. איור זה מראה את הביטוי של חלבון הדיווח הפלואורסצנטי הירוק המשופר, או EGFP, בקרן הגב השמאלית של חוט השדרה ב-L ארבע.שבועיים לאחר ההזרקה הסטריאוטקסיים של R-A-A-V-E-G-F-P, בוצע צביעה אימונוהיסטוכימית לנוירונים עבור חלבון הגרעין הנוירונלי המוצג באדום. ראש החץ מצביע על תאי גליה טרנספקטים פזורים בעמוד השדרה הגבי (dorsal column). כ-80% מהנוירונים בקרן הגב המדיאלית (medial dorsal horn) נדבקו בנגיף.ניתן להשלים את הפרוצדורה תוך 30 עד 40 דקות, ויש לזכור לשמור על תנאי סטריליות במהלך הפעולה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע הזרקות תוך-שרירית (intraspinal) לרמות של חוט השדרה בעכבר. אנו משתמשים בטכניקה זו למניפולציה גנטית, אך ניתן להתאימה למטרות אחרות, כגון הגשת תרופות אל תוך חוט השדרה.

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Porlan, E., et al. שינוי גנטי יציב ויעיל של תאים בעכבר הבוגר V-SVZ לניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאי גזע עצביים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שינוי גנטי יציב של תאי גזע עצביים (NSCs) באזור הגחון-תת-חדרי (V-SVZ) באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של גן טיפולי נושא וירוס במודל עכבר. הנגיף חודר לתאי גזע, עובר שעתוק הפוך, משתלב בגנום ומאפשר שינוי גנטי יציב ויעיל ליישומים נוירותרפיים.

הזרקה סטריאוטקסית של וירוסים לשינוי גנטי יציב במודל עכבר

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

מקור: Tadokoro, T., et al. העברת וקטור תת-פיאלי הקשור לאדנו 9 (AAV9) בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים טכניקת הזרקה תת-פיאלית להעברת גנים לחוט השדרה בעכברים. ההליך כולל חשיפת הדורה מאטר, ניקוב ה-pia mater והזרקת נגיף אדנו-הקשור רקומביננטי (rAAV) הנושא גן המבטא חלבון פלואורסצנטי לחלל התת-פיאלי. לאחר ההזרקה וההתאוששות, הנגיף מקל על ביטוי גנים בתאי חוט השדרה, ומאפשר לחקור את ביטוי גן המטרה.

העברת גנים תת-פיאליים בחוט השדרה של העכבר כדי להעריך את ביטוי הגנים

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית ליישום טיפולים גנטיים על תת-אוכלוסיות של תאים בחולדות ילודים בגילאים שלאחר הלידה 5-10 ימים על ידי הזרקת משנה כימוגנטית אנטרוגרדית לקליפת המוח הסומטומוטורית ורקומבינאז Cre הניתן להובלה רטרוגרדית לחוט השדרה הצווארי.

התמקדות במערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים עם וקטור דו-ויראלי באמצעות ניתוח משולב של המוח ועמוד השדרה

זריקה תוך-מותנית מייצגת דרך מתן רלוונטית לתרגום למתן טיפול גנטי למערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול סטנדרטי מקיף זה לזריקות תוך-מותניות בעכברים וחולדות בילודים, צעירים ובוגרים נועד להנחות חוקרים באימוץ טכניקה זו למחקרי ריפוי גנטי פרה-קליניים.

הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

למדו הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי לביטוי גני ממוקד בחוט השדרה המאוסי. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית בקרנית הגב הלומברית לחקר תפקוד עצבי ומנגנוני כאב.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

גלה סרטונים נוספים