המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור נוירונים צפאליים מתאי גזע עובריים אנושיים או H ESCs על ידי מעבר דרך מחסומים הדומים לאלה שנצפו במהלך ההתפתחות האנושית. זה מושג על ידי מתן אפשרות תחילה ל-HSCs להתמיין באופן ספונטני בהשעיה במדיום HESC, ולאחר מכן העברתם למדיום אינדוקציה עצבית כדי להתמיין באופן סלקטיבי יותר. לאחר מכן, גופי עובר או אגרגטים PSC מורשים להיצמד לצלחות שטופלו בתרבית רקמות בהן התאים מתרחבים ומתמיינים לשכבה חד-שכבתית.

כאשר המרכזים יוצרים תאי אפיתל נוירולוגיים הדומים מורפולוגית לתאי קילומטר. לאחר מכן, תאי האפיתל העצביים מבודדים ומונחים בתרביות מתלה שם הם יוצרים נוירוספרות. לבסוף, הנוירוספרות מצופות על גבי החלקות כיסוי שבהן הן יכולות להתמיין עוד יותר.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הסוגים הספציפיים של נוירונים שנוצרו באמצעות צביעה חיסונית או אלקטרופיזיולוגיה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מגוון רחב של מחלות תורשתיות גנטיות מכיוון שתאי עצב ספציפיים לחולה יכולים להיווצר גם מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, שם ניתן להבהיר את מנגנון הפעולה כמו גם טיפולים פוטנציאליים. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפתחות תת-סוגים נוירולוגיים של טאלון צפאלי מתאי גזע פלוריפוטנטיים.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון מחלות אנושיות הקשורות לנוירונים צפאליים של טאלון כדי ליצור אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים התחילו בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על פיברובלסטים עובריים של עכברים במדיום HESC בתוספת FGF בסיסי למשך חמישה עד שבעה ימים, המושבות יהיו גדולות, אך עדיין לא מובחנות. כאשר המושבות הגיעו לשלב הנכון בצינור של 50 מיליליטר. הכן תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר של מפרצי דיס במדיום D-M-E-M-F 12 לפי פרוטוקול הטקסט.

שאפו את המדיום מהתאים ולאחר מכן שטפו אותם פעם אחת עם D-M-E-M-F 12. לאחר הסרת הכביסה, הוסיפו מיליליטר אחד של מפרצי דיס לכל באר ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. בסימן שלוש הדקות, בדוק מתחת למיקרוסקופ אם יש קצוות מסולסלים שנראים מעט כהים יותר.

במידת הצורך, דגרו על התאים זמן רב יותר. כאשר התאים מוכנים, הסר את תמיסת ה-dase ושטוף את התאים פעם אחת עם D-M-E-M-F 12 לפני החלפת הכביסה ב-1.5 מיליליטר של מדיום HESC כדי לנתק ולפרק את התאים. מקם את קצה פיפטת זכוכית של 10 מיליליטר על התאים לכיוון הקיר הימני התחתון של באר, ובתנועה קטנה למעלה ולמטה, נע על פני הבאר לצד השני לפני שתחזור בכיוון ההפוך.

לאחר שכל התאים נמצאים בתרחיף, הניחו אותם בצינורות של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם ב-200 גרם למשך שתי דקות לפני הוצאת המדיום מהגלולה. בעזרת מדיום HESC, העבירו את התאים לבקבוק לתרבית. לדוגמה, עבור תאים משש בארות של HSCs, השתמש בבקבוק T 75 אחד עם 50 מיליליטר HESC. בינוני.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר מכן כדי להסיר כל פסולת תאים, העבירו את התאים והמדיום לצינור של 50 מיליליטר ושטפו את התאים פעם אחת לפני העברתם עם 50 מיליליטר של מדיום טרי לבקבוק חדש. המשיכו להזין את התאים בצורה זו עד היום החמישי.

ביום החמישי, סובב את התאים והעביר אותם לבקבוק T 75 חדש. עם 50 מיליליטר של מדיום אינדוקציה עצבית או NIM, דגרו אותם במשך יומיים-שלושה והחליפו מחצית מה-NIM בכל יום לאחר צלחת הדגירה, התאים משתמשים בלמינין או FBS כדי לעזור להם להתחבר לצלחות לצלחת. באמצעות FBS, הוסף 1.5 מיליליטר מדיום עם תאים לכל אחד.

ובכן, נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את האגרגטים ולאפשר לתאים להיצמד למשך הלילה. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת, החלף את כל המדיום בשני מיליליטר NIM לבאר. לאחר יום או יומיים של דגירה, כל אגרגט יתפשט ליצירת שכבה אחת ותוך מספר ימים, המרכזים של רוב התאים הללו ייראו מבחינה מורפולוגית דומים לתאי קולומר.

בסביבות הימים 14 עד 17 תאי קולומר ייראו קומפקטיים יותר. לפעמים התאים יוצרים רכסים או טבעות עם לומן גלוי בפנים. לפני בידוד התאים, בדוק אותם לנוכחות של תאי אפיתל שאינם מהאיחוד האירופי והשתמש בקצה פיפטה כדי לגרד אותם.

לבודד את תאי האפיתל העצביים שנמצאים במרכז המושבות. השתמש במיקרו פיפטה ובפיפטה סטרילית מסוננת של מיליליטר אחד כדי להפעיל לחץ על מרכז המושבה כך שהיא תתרומם. הקפד לא לתת לחלק החיצוני של המושבה להתנתק גם כן.

העבירו שתי צלחות של תאים מבודדים לצינור של 15 מיליליטר וסובבו ב-200 גרם למשך שתי דקות. לאחר הסרת המדיום, העבירו את התאים לבקבוק T 25 שטופל בתרבית שאינה רקמה ומכיל 10 מיליליטר NIM. עם תוספת של B 27 בדגירה למשך הלילה למחרת, התאים צריכים להיות בעלי מראה דמוי כדור.

לעיתים גם התאים ההיקפיים יבודדו והם בדרך כלל יתחברו לתחתית הבקבוק. אם זה קורה, העבירו את התאים הכדוריים לבקבוק חדש, והשאירו את התאים המחוברים מאחור בתרבית. הנוירוספרות וההשעיה למשך שבוע ב- NIMB 27 כדי לקדם סיבולת תאים והתפשטותם.

הוסף A MP מחזורי וגורם גדילה דמוי אינסולין אחד. בסוף השבוע, הנוירוספרות יכילו אבות קדמונים ויהיו מוכנות לציפוי על פתקי כיסוי להתמיינות סופנית. להכנת החלקות כיסוי מצופות למינין פוליאוריטן ב -24, לוחות באר מתחילים בציפוי החלקות כיסוי נקיות בתמיסה של 0.1 מיליגרם למיליליטר של פוליאוריטן ב -37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לצפות את החלקות הכיסוי ב laminin ב -50 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר למינין בהתמיינות עצבית.

בינוני לכל תלוש כיסוי שטופל בפוליאוריטן. היזהר שרק הנוזל שנוגע בכיסוי יחליק את עצמו. דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.

לאחר הדגירה של הלמינין, אספו ושטפו את הנוירוספרות ב-D-M-E-M-F 12. אם התאים גדולים מכדי להיצמד כראוי, הוסיפו כשני מיליליטר אקוטן ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין ולאחר צנטריפוזיה את התאים ב -200 G למשך שלוש דקות, החלף את התמיסה ב- NDM והשתמש ב- P 200 כדי לפרק את התאים לאשכולות קטנים.

מניחים אותם על פתקי כיסוי מצופים מראש, שואבים את רוב המדיום ומעבירים את התאים לצלחת פטרי של שישה סנטימטרים בכמה טיפות של המדיום כך שבחירתם הופכת לקלה יותר מבלי להסיר את הלמינין מהחלקות הכיסוי המצופות מראש. העבירו כארבע עד חמש נוירוספרות לכל אחת. אפשר לנוירוספרות להיצמד לפחות שעתיים עד ארבע שעות לפני הוספת 0.5 מיליליטר של מדיום התמיינות עצבית בתוספת B 27 מחזורי.

MP וגורמים נוירוטרופיים מחליפים מחצית מהמדיום כל יומיים. ניתן לשמור על התאים במשך מספר חודשים כפי שמוצג כאן. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין PSCs אנושיים לנוירונים גלוטמטרגיים טאלון צפאליים באמצעות מספר שלבים קריטיים.

היווצרות PSC צוברת את האינדוקציה של תאי אפיתל עצביים, יצירת אבות צפאליים של טאלון והתמיינות סופית של אבות אלה לנוירונים צפאליים של טאלון. מערכת זו חזקה ויעילה ביצירת נוירונים צפאליים, אבות ותאי עצב גלוטמטרגיים, למשל. ללא תוספת של גורמי איזציה, ה-HSCs התמיינו לשושלת העצבית ו-24 ימים לאחר ההתמיינות.

רוב הקודמנים העצביים היו חיוביים עבור Fox G one, גורם שעתוק המתבטא על ידי הצפלון, אך שלילי עבור HOKs B 4, סמן A עבור תאי המוח האחורי וחוט השדרה המצביע על כך שאבות הטלון הצפליים נוצרו בהצלחה. אבות אלה של טלון צפאלי הם בעלי פנוטיפ גבי כפי שמצוין על ידי הביטוי של PAC 6. סמן המבוטא על ידי אבות גביים, אך לא NK X 2.1 A סמן לאבות הגחוניים.

לאחר התמיינות נוספת, אבות הגב הצפליים הללו התמיינו לנוירונים גלוטמטרגיים, שהיו חיוביים לסמן הגלוטמטרגי. תאי עצב TBR 1 שנשארו חיוביים ל-TBR 1 היו חיוביים גם לסמנים עצביים בטא 3 טובולין או מפה 2. תאים אלה ביטאו גם טרנספורטר גלוטמט שלפוחית אחד או V glut אחד, סמן לנוירונים גלוטמטרגיים בוגרים המרמזים על ייצור יעיל של נוירונים גלוטמטרגיים טאלון צפאליים בתרבית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם תאי העצב האלה יכולים ליצור קשרים סינפטיים עם תאים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב. היה עליו להבדיל בין תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי עצב גלוטמטרגיים צפאליים באמצעות מספר שלבים קריטיים.

היווצרות תאי גזע פלוריפוטנטיים מצטברת אינדוקציה של תאי אפיתל עצביים, יצירת אבות צפאליים והתמיינות סופית של אבות אלה לנוירונים צפאליים.