Name: המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: למדו לייצר נוירונים טלנצפליים גלוטמטיים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות דיפרנציאציה ספונטנית ויצירת נוירוספירות. שיטה זו מאפשרת חקר התבגרות נוירונלית וביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר י Sasai למתן נוגדן FOXG1 בנדיבות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר בתאי גזע קונטיקט (08-SCB-UCHC- 022 ו 11-SCB24) וקרן Paraplegia ספסטי.

1. הדור של מצרפי תאי גזע pluripotent אדם (D1-D4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע pluripotent אדם מתורבתים בפיברובלסטים עובריים של עכבר מתקני האכלה (MEF) בנוכחות בינונית hESC בתוספת גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml). לאחר 5-7 ימים בתרבות, כאשר המושבות גדולות אבל עדיין לא מובחנות, שהם מוכנים לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון האנזים הראשון צריך להיות מוכן. בצינור מ&quot;ל 50, לפזר dispase (או collagenase) בריכוז 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לDMEM/F12 בינוני. מאז פתרונות אלה לערבב טובים ביותר כאשר חממו, הנח את הצינור המכיל את האנזים לבינוני ו° C אמבט מי 37 במשך 10-15 דקות ולאחר מכן לעקר אותו באמצעות מסנן Steriflip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מהתאים, לשטוף אותם עם DMEM/F12, ולשאוב את זה גם כן. הוסף 1 מ&quot;ל של dispase לכל באר ומקום באינקובטור במשך 3-5 דקות לhESCs (עד 10 דקות לiPSCs). תראה את התאים תחת מיקרוסקופ; כשהקצוות להתכרבל מעט / נראים כהה קצת, התאים הם מוכנים לצעד הבא. זה הכי טוב כדי לבדוק את התאים לאחר 3 דקות ולהחזיר אותם במידת צורך. בעת שימוש בפרוטוקול זה בפעם הראשונה, עדיף להתחיל עם רק צלחת אחת של תאים בכל פעם שזה חשוב להסיר את התאים מdispase מהר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את dispase מהתאים. בעדינות (התאים פגיעים מאוד בשלב זה ויבואו את הצלחת בקלות יחסית) להוסיף 1.5 מ&quot;ל של DMEM/F12 בינוני לכל גם כדי לשטוף את dispase. לשאוב את DMEM/F12 ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל של מדיום hESC לכל באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק ולהפריד את התאים, הנח את קצה פיפטה 10 מיליליטר כוס לעבר הפינה הימנית התחתונה של היטב (לגעת בתאים) ולהעביר את פיפטה ולמטה (אנכי) - עליית סטוק צריך להיות בסמיכות לשבץ הירידה ימשיך. ברגע שהצד השני של גם הוא הגיע, לחזור בנואש אופקי<html> ction. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל התאים נמצאים בהשעיה, למקם אותם בצינורות 15 מ&quot;ל וחובצה אותם ב 200 XG עבור 2 דקות. לא צריך להיות גלול של תאים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב את המדיום מלמעלה גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודלו של בקבוק תרבית התאים שצריכים להיות מנוצל כדי לשמור המצרפים תלוי בכמות המקורית של תאים. במשך 6 בארות (צלחת 1) של hESCs, תרבות אחת לא התייחסה אל רקמת T75 בקבוקון עם 50 מ&quot;ל של מדיום hESC צריך להיות מנוצל. העברת התאים מצעד 1.6 לבקבוק ולדגור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להיפטר מפסולת התא, התא הבינוני והבקבוק יש להחליף כ 12 שעות מאוחר יותר. כדי לעשות זאת, הנח את כל התאים / הבינוניים לתוך צינור מ&quot;ל 50, לסובב את התאים למטה (200 XG עבור 2 דקות), ולשאוב את המדיום הישן. לאחר מכן, להוסיף 50 מ&quot;ל של מדיום hESC טרי לתאים והמקום לT75 בקבוק חדש. התאים אז יכולים להיות מוזנים יומי בעקבותיו הליך זה (עד יום 5). </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. אינדוקציה של תאי Neuroepithelial (D5-D17) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים / הבינוני לצינור מ&quot;ל 50, וחובצה את התאים עבור 2 דקות ב 200 x גרם. בשלב הבא, לשאוב את supernatant, ולהעביר את התאים ל( תרבות הלא רקמת מטופלים) החדשה T75 בקבוקון עם 50 מ&quot;ל של מדיום השראה עצבי (נים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הם בנים, מחצית הבינונית יש להחליף בכל יום אחר. המצרפים צריכים להיות גדולים מספיק כדי שבו הם ישקעו לתחתית צינור 50 מיליליטר חרוטים מעצמם לאחר כמה דקות (לא צנטריפוגה חובה). לאחר 2-3 ימים בנים (D7-D8 כולל), התאים צריכים להיות מוכנים לצלחת. Laminin או סרום שור עוברי (FBS) יכול להיות מנוצל כדי לעזור לתאים לצרף את הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר תרביות רקמה טופל 6 צלחות גם כי יש צורך תלוי הצפיפות של התאים כמו כל המצרפי צריך להיות מסוגל לגדול על הצלחת במשך כמה ימים נוספים בלי לגעת בכל אחד מהאחרים. בממוצע, לתאים מאחדT75 בקבוק יניב כ 04-06 יוני צלחות בשווי של תאים כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בlaminin, לדלל אותו בנים ל10-20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​למעייל הצלחת 6-הטובה (~ 0.5 מ&quot;ל / היטב). לאחר ציפוי במשך 2-3 שעות, אגרגטים תא לוח על גבי צלחות 6-כן (~ 20-30 אגרגטים לטובים). לאחר המצרפים צרפו, להוסיף 1.5 מ&quot;ל של נים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בFBS, להכין תערובת של 90% ו 10% נים FBS (1.5 מ&quot;ל / היטב). הוסף 1.5 מ&quot;ל של מדיום עם תאים לכל היטב, בעדינות לנער את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את אגרגטים, ולאפשר לתאים לצרף O / N באינקובטור. הקפד להחליף הבינוני (2 מ&quot;ל / היטב של נים) בבוקר שלמחרת כדי להסיר FBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יום או ימים של להיות מצופה, בכל צבירה תפרוש כדי ליצור monolayer. בתוך כמה ימים, המרכזים ביותר של תאים אלה מופיעים מורפולוגית דומה לתאי columnar (מוארך). במהלך תקופה זו, לשנות את הנים בכל יום אחר. כמה קווי PSC (אספסיאלly iPSC), עלול להיוצר תאי columnar בצורה פחות יעיל. אם זה קורה, התוספת של BMP ומעכבי TGF (Dorsomorphin 29, 19 בSB431542 2 מיקרומטר) בשלב 2 יכולה להיות מועילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביב 14-17 ימים, תאי columnar יופיעו יותר קומפקטיים. לפעמים תאים אלה יוצרים רכסים או טבעות עם לומן גלוי בפנים. חוץ ממורפולוגיה העמודים, תאים בשלב זה להביע סמני neuroepithelial, כגון PAX6 וSOX1 12,26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הבידוד יכול להתחיל, יש לבחון את התאים הראשונים כדי לקבוע אם יש נוכחיים בתאים שאינם neuroepithelial. סמן אובייקטיבי יכול להיות מנוצל כדי לציין את המושבות שאינן neuroepithelial. אלה אז יכולים להיות מסולקים על ידי גירוד אותם עם קצה פיפטה. </li></ol> 3. הדור של אבות Telencephalic (D17-D24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרכזים של המושבות מכילים את תאי neuroepithelial, וצריכים להיות מבודדים משאר המושבה. ניתן לעשות זאת באמצעותmicropipette וטיפ סטרילי 1 מ&quot;ל מסונן פיפטה. כאשר כמות קטנה של לחץ מוחלת על החלק המרכזי של המושבה, זה בדרך כלל מרים אותן די בקלות. היה זהיר לא לתת לחלק החיצוני של המושבה לנתק גם כן. אם המרכזים להיות עקשנים ולא יורד בעצמם, הם יכולים להסיר על ידי גוזמים אותם באמצעות מחט תחת מיקרוסקופ בברדס סטרילי. להעביר את חלקי המרכז של המושבות לצינור מ&quot;ל 15 ולסובב ב 200 XG עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבינוני צריך להישאף משל התאים. שתי צלחות בשווי של תאים ואז ניתן להעביר לתרבות הלא רקמה טופלה T25 בקבוקון המכיל 10 מ&quot;ל של נים עם התוספת של B27 (ללא ויטמין A, 1:50). השתמש 5-10 מ&quot;ל של מדיום לצלחת אחת של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים נתפסים למחרת, הם צריכים מרחב כמו מראה. זה הכרחי כדי להעביר תאים אלה לתוך בקבוק חדש (בנוכחות הנים וB27, 1:50) כפי שהוא לעתים קרובות התאים ההיקפייםשמתגנב ולצרף לתחתית הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurospheres צריך אז להיות מתורבת בהשעיה למשך שבוע באמצעות נים בתוספת B27 (1:50). על מנת לקדם את סיבולת תא וההתפשטות, מחזורי AMP (cAMP, 1 מיקרומטר), כמו גם אינסולין גורם גדילה (IGF1, 10 ng / ml) ניתן להוסיף למדיום בתרבות השעיה. בשלב זה, את neurospheres מכיל אבות telencephalic (FOXG1 +) והם מוכנים למצופים על coverslips לבידול מסוף. </li></ol> 4. הבחנה נוספת לנוירונים Telencephalic (D25 +) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips המצופה poly-ornithine/laminin (בצלחות 24 גם) לציפוי התאים. Coverslips מנוקה ראשון, ולאחר מכן הם מצופים תכסיס-ornithine (ברמה של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 37 ° C, O / N, ומאוחסן במקפיא). ציפוי Poly-ornithine: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את coverslips: הנח את coverslips במבחנה המכילה חומצה חנקתית ועדינות לנער במנדף למשך שעה אחת. לשפוך את החומצה חנקתית, יש לשטוף מספר פעמים במי DI, ולהשאיר את coverslips תחת מים זורמים DI לפחות 15 דקות. הנח את coverslips באתנול 95% וגם ללחוץ למשך 30 דקות (אם משתמש באופן מיידי) או בחנות באתנול בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע סטרילי, לשפוך את תכולת השפופרת המכילה 50 המ&quot;ל coverslips המעוקר לתוך המכסה של צלחת 6-כן. השימוש במלקחיים מעוקרים, להרים coverslip אחד בכל פעם ולהזקיף באחת גם מצלחת 24 היטב. חזור על כך שכל יש גם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שהם יתייבשו לחלוטין, קש על הצלחות עד coverslips נפל שטוח בכל אחד גם. הבא להוסיף 100-ornithine פולי μl (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בד&quot;ה סטרילי 2 O) לכל coverslip ודגירת צלחות O / N ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר צלחות מן החממה ולאפשר להם להתקרר לRT. לשאוב פולי ornithine את כל coverslip (מקצה tהוא coverslip) לוודא שלא לגעת או לשרוט את coverslips בתהליך. לאפשר את coverslips להתייבש במשך כ 30 דקות לפני השטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 המ&quot;ל סטרילי DH 2 O לכל באר, תן לו לשבת 10 דקות, ולשאוב את המים מכל באר. חזור על לשטוף זה צעד עוד שתי פעמים. לאחר הצלחות להתייבש לגמרי, (חופשה מכסה את מכסה מנוע ב) למקם את המכסים על, מכסה ברדיד אלומיניום, ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעייל coverslips עם laminin, להוסיף 50 μl מתערובת של מדיום התמיינות עצבי וlaminin (ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לכל coverslip טופל פולי ornithine להיות זהיר כדי לקבל את הנוזל נוגע coverslip עצמו (ולא רק לשפוך כבוי). דגירתם על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות לפני הכנת התאים לקובץ מצורף. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיסוף וסרכזת neurospheres ב 200 XG עבור 2 דקות בצינור מ&quot;ל 15. לשאוב את supernatant. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם DMEM-F12 וחובצה את התאים שוב. אם neurospheres הם גדולים מדי כדי לצרף כראוי, הם יכולים להיות מנותקים עם Accutase בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בAccutase: לאחר שטיפת התאים עם DMEM-F12, את neurospheres הם ניתק לקבוצות קטנות על ידי הוספת Accutase (~ 2 מ&quot;ל) ודוגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לאחר מכן, להוסיף את אותה כמות של טריפסין מעכב (~ 2 מ&quot;ל) וחובצה את התאים ב 200 XG ל3 דקות. התאים אמורים להיות מושעה מחדש אז בNDM ושבור באמצעות פיפטה P200. את האשכולות הקטנים אז יכולים להיות מצופים על coverslips מראש מצופה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את רובו של המדיום ולמקם את התאים על צלחת פטרי 6 סנטימטר בכמה טיפין של המדיום, כך שבחירתם נעשית קלה יותר. הוסף כ 4-5 neurospheres לכל coverslip מראש מצופה. אין צורך לערב את laminin הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו neurospheres לצרף לפחות 2-4 שעות. ברגע שיש להםttached היטב, יותר בינוני (0.5 מ&quot;ל / coverslip) יש להוסיף. זה צריך להיות מורכב מבינוני עצבי בידול בתוספת B27 (1:50), מחנה (מיקרומטר 1), וגורמי neurotrophic (BDNF, GDNF, ו IGF, כל שעת 10 ng / ml). בשלב זה המחצית הבינונית ניתן לשנות בכל יום אחר והתאים האלה יכולים להישמר במשך מספר חודשים. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li>
<li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+toward+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li>
<li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li>
<li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li>
<li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li>
<li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis%3A+conserved+programs+in+neocortex%2C+cerebellum%2C+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li>
<li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853(2010).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+patterning+of+the+central+nervous+system%3A+how+many+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li>
<li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li>
<li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li>
<li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li>
<li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li>
<li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li>
<li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך ההתמיינות העצבי. חשוב להבטיח שהאדם הוא PSCs pluripotent כי כבר עלולים להיות מוטים באופן אחר את התאים לקראת הפיכת שושלת שאינה עצבית. זה יכול להיות מאושר על ידי מכתים את PSCs האדם עם נוגדנים נגד סמני pluripotency כגון Oct4, Sox2, Nanog, וTra-1-60 1-3. אם PSCs האדם לא מייחס היטב אחרי passaging, מעכב ROCK (Y27632) ניתן להוסיף לעזרה. לאלו שיש קושי בשמירה על pluripotent התאים שלהם, כמה בעיות פוטנציאליות הן באיכות / צפיפות של תאי MEF, כמו גם הרבה...

תאי גזע pluripotent אדם (PSCs), כוללים שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (iPSCs), יש את היכולת לייצר כל סוג תא בגוף, כוללים תאי עצב 1-3. בידול מכוון של תת עצבי שונים מPSCs אדם מחזיק את המפתח ליישום של תאים אלה ברפואת רגנרטיבית. הדור של תת עצבי פונקציונלי במהלך פיתוח הוא תהליך מורכב כרוכים בגיוס של שושלת עצבית, מפרט של אבות אזוריים לאורך ציר rostro-הזנב, ובידול של סוגי תאי עצב לאחר mitotic מאבות 4.5 האזוריים. החל משנת 2001, מספר מערכות שהוקמו כדי ליצור שושלת עצבית מhESCs, שספק פלטפורמת לדור הבא של תת עצבי 6,7. בהתבסס על עקרונות התפתחותיים, סוגים שונים של תאי עצב מוטורי כגון תאי עצב שדרה 8-12, המוח התיכון DOPהנוירונים aminergic 13-15, ותאי רשתית עצבי 16,17 כבר צוינו ביעילות מPSCs אדם. הדבר נעשה על ידי יישום morphogens הקריטי חשובים למפרט של סוגי תאי עצב אלו במהלך התפתחות בגוף חייה. פרוטוקולים אחרים יש גם פותח כדי לקדם את הבידול של hESCs לנוירונים או באמצעות גורמים נוספים כגון 18-20 מולקולות קטנות או על ידי שיתוף culturing עם סוגי תאים אחרים כדי לעזור לקדם את הבידול 21. הניאוקורטקס האנושי מפותח מאוד ומכיל סוגים רבים של תאים, כולל תאי עצב glutamatergic אשר משחקים תפקיד חשוב בלמידה, זיכרון ותפקוד הקוגניטיבי 22,23. הצעד הראשון ביצירת נוירונים glutamatergic בתרבות הוא לציין בתאים telencephalic. הקבוצה של Yoshiki Sasai דיווחה בידול המכוון של מבשרי telencephalic מעכבר ESCs (mESCs) באמצעות suspensio הסרום ראשון חינםתרבות n בנוכחות DKK1 (אשר מעכב איתות Wnt) כמו גם LeftyA (אשר מעכב קטרי איתות) 24. כתוצאה מכך, מספר קבוצות כולל זו שלנו גם דיווחו על המפרט של מבשרי telencephalic מPSCs אדם בללא בינוני 25-27 סרום. הדור של מבשרי telencephalic מPSCs אדם אינו דורש השימוש בmorphogens אקסוגניים והיעיל ביצירת המקדמים הללו הוא הרבה יותר גבוה מזה מmESCs 26,27. כאן, מערכת הגדרה כימית לזירוז עצבי שהוקם גם על ידי קבוצתו של ג&#39;אנג 7 כבר תארה. ללא תוספת של גורמים אקסוגניים caudalizing, פרוטוקול זה יעיל מייצר מבשרי telencephalic מPSCs אדם 27. אבות אלה לאחר מכן ניתן מובחנים לאבות הגבו או גחון על ידי ויסות האיתות של Wnt וסוניק קיפוד (שש). את אבות הגב עוד יכולים להתמיין לתאי עצב דואר glutamatergicfficiently 27. בנוסף, פרוטוקול זה גם עובד היטב עבור הדור של נוירונים glutamatergic מ28 iPSCs האנושי, המאפשר לדור של נוירונים מטופל ספציפיים שיכול להיות מנוצל כדי לחקור את מנגנון הפעולה, כמו גם טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מחלות . יתר על כן, המערכת שלנו מספקת גם פלטפורמה כדי לחקור את הפיתוח ואת המפרט של סוגים עצביים מגוונים בtelencephalon.

<table><tbody><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם תערובת חומרים מזינים F12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>תחליף סרום נוקאאוט</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; תנול (14.3 מ')</td><td>סיגמא</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירו-בסיסי</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>למינין (אנושי)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>למינין (עכבר)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell טכנולוגיות</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>מעכב רוק</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2, bFGF)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ג'לטין</td><td>נוגדן Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1</td> ד<td>"ר י. ססאי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 נוגדן (1:50)</td><td>מחקרים התפתחותיים נוגדן Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (1:5000)</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 נוגדן (1:200)</td><td>נוגדן Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>נוגדן AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 (1:100)</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי נגזר גליה (GDNF)</td> <td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילת אינסולין 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>AMP מחזורי (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>קיפוד קולי (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 50 מ"ל</td><td>בקטון דיקינסון (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>6 צלחות</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות</td> באר <td>צלוחיות BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 (לא מטופלות)</td><td>צלוחיות BD</td><td>353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 (לא מטופלות)</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחות פטרי</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית 9 אינץ'</td><td>פישר</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Steriflip (0.22 &mu; M)</td> <td>מסנני Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 1,000 מ"ל (0.22 &mu; M)</td><td></td> מיקרוסקופ ניגוד פאזה <td>Millipore</td> SCGPU10RE <td></td></tr><tr><td>(Observer A1)</td> חממת פחמן דו חמצני <td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>(Hera Cell 150)</td> קולט אדים לבטיחות ביולוגית <td>של Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Sterilgard III Advance)</td> צנטריפוגה <td>של חברת</td><td></td><td></td>בייקר</tr><tr><td>(5702 R)</td> <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

המפרט של נוירונים glutamatergic telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

כאן, הליך הדרגתי ליצירת נוירונים glutamatergic telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם (PSCs) יעילות שתואר. תהליך הבידול הוא יזם על ידי שבירת PSCs האדם לתוך גושים שמכתרים את טופס אגרגטים כאשר התאים מוקם בתרבות השעיה. המצרפים אז הם גדלו במדיום hESC מימים 1-4 לאפשר לבידול ספונטני. במהלך תקופה זו, את התאים יש את היכולת להפוך כל אחת משלוש השכבות הניבטות. מימים 5-8, את התאים מוקם בהשראה עצבית בינוני לדחוק אותם לשושלת העצבית. סביב היום 8, התאים מותר לצרף אל 6 גם צלחות ולהבחין שבמהלך הזמן את צורת תאי neuroepithelial. תאים אלה neuroepithelial יכולים להיות מבודדים ביום 17. התאים לאחר מכן ניתן לשמור אותו כneurospheres עד שהם מוכנים להיות מצופים על coverslips. שימוש באמצעי בסיסי ללא כל גורמי caudalizing, תאי neuroepithelial הם specifieד למבשרי telencephalic, שאז יכול להיות מובחן יותר לתוך אבות telencephalic גב ונוירונים glutamatergic יעילות. בסך הכל, המערכת שלנו מספקת כלי ליצירת נוירונים glutamatergic אדם לחוקרים ללמוד פיתוח של הנוירונים האלה ואת המחלות שמשפיעות עליהם.

הנה, בפרוטוקול כדי לבדל PSCs אדם לתוך הנוירונים glutamatergic telencephalic דרך כמה שלבים קריטיים: ההיווצרות של אגרגטים PSC, האינדוקציה של תאי neuroepithelial, הדור של אבות telencephalic, ובידול המסוף של אבות אלה לתוך תאי עצב telencephalic (איור 1) יש תואר. מערכת זו היא חזקה ויעילה בדור של אבות telencephalic ונוירונים glutamatergic. כדוגמה (איור 2), ללא תוספת של גורמי caudalizing, את hESCs היה מובחן לשושלת העצבית 27. בהודעת בידול ימים 2...

הליך זה מניב נוירונים telencephalic על ידי עובר מחסומים שדומים לאלו שנצפו בהתפתחות האנושית. התאים מותרים באופן ספונטני כדי להבדיל, חשופים לגורמים שדוחפים אותם לכיוון השושלת העצבית, מבודדים, ומצופים על coverslips כדי לאפשר בידול מסוף והתבגרות.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק נוירונים צפליים מתאי גזע עובריים אנושיים (H ESCs), באמצעות מעבר דרך נקודות בקרה הדומות לאלו הנצפות במהלך ההתפתחות האנושית. הדבר מושג תחילה על ידי מתן אפשרות ל-HSCs להבדיל באופן ספונטני בתליה במצע HESC, ולאחר מכן העברתם למצע אינדוקציה עצבית כדי להבדיל אותם באופן סלקטיבי יותר. לאחר מכן, גופי עובר או אגרגטים של PSC מועמדים להיקשר לפלטות שעברו טיפול לתרביות רקמה, שם התאים מתרבים ומבדילים לשכבה אחת (monolayer).כאשר המרכזים יוצרים תאי נוירו-אפיתל הדומים מורפולוגית לתאי קילומטר. לאחר מכן, תאי הנוירו-אפיתל מבודלים ומוצבים בתרביות סספנסיה שבהן הם יוצרים נוירוספירות. לבסוף, הנוירוספירות נזרעות על לוחות כיסוי שבהן הן יכולות להמשיך להבדיל.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את סוגי הנוירונים הספציפיים שנוצרו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית או אלקטרופיזיולוגיה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מגוון רחב של מחלות תורשתיות, כיוון שניתן להפיק נוירונים ספציפיים למטופל מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs), ובכך ניתן לה 규ש את מנגנון הפעולה וכן את הטיפולים הפוטנציאליים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחותם של תתי-סוגי נוירונים תלנצפאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים.ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות, כגון מחלות אנושיות הקשורות לנוירונים טלנצפליים. כדי להפיק אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, התחל בגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה של פיברובלסטים עובריים של עכבר במדיום HESC המועשר ב-basic FGF למשך חמישה עד שבעה ימים; המושבות יהיו גדולות, אך עדיין לא מובחנות. כאשר המושבות מגיעות לשלב המתאים, הכן במבחנה של 50 milliliters תמיסה של 1 mg/mL של dis bays במדיום D-M-E-M-F 12 בהתאם לפרוטוקול הכתוב.שאבו את המצע מהתאים ולאחר מכן שטפו אותם פעם אחת עם D-M-E-M-F 12. לאחר הסרת השטיפה, הוסיפו מיליליטר אחד של dis bays לכל באר והדגירו ב-37 degrees Celsius למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר שלוש דקות, בדקו תחת המיקרוסקופ אם מופיעים שוליים מקוערים שנראים כהים מעט יותר.במידת הצורך, דגרו את התאים למשך זמן ממושך יותר. כאשר התאים מוכנים, הסירו את תמיסת ה-dase ושטפו את התאים פעם אחת עם D-M-E-M-F 12 לפני החלפת השטיפה ב-1.5 milliliters של מצע HESC כדי לנתק ולפרק את התאים. מקמו את קצהו של פיפט זכוכית בנפח 10 milliliters על התאים לכיוון הדופן הימנית התחתונה של הבאר, ובתנועות קטנות של מעלה ומטה, נעו לרוחב הבאר לצד השני לפני החזרה בכיוון ההפוך.לאחר שכל התאים נמצאים בתרחיף, העבירו אותם למבחנות של 15 milliliter וסובבו אותם בצנטריפוגה ב-200 G למשך שתי דקות לפני הסרת המצע מהמשקע. בעזרת מצע HESC, העבירו את התאים לבקבוק תרבית. לדוגמה, עבור תאים משישה בארות של HSCs, השתמשו בבקבוק T 75 אחד עם 50 milliliters של HESC.Medium.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 שעות. לאחר מכן, כדי להסיר שאריות תאים, העבירו את התאים והמצע למבחנה של 50 milliliters ושטפו את התאים פעם אחת לפני העברתם עם 50 milliliters של מצע טרי לבקבוק חדש. המשיכו להזין את התאים באופן זה עד ליום החמישי.ביום החמישי, סבבו את התאים בצנטריפוגה והעבירו אותם לבקבוק T 75 חדש. עם 50 milliliters של מצע אינדוקציה עצבית או NIM, דגרו אותם למשך יומיים עד שלושה ימים, כאשר מחליפים מחצית מה-NIM מדי יום. לאחר הדגירה, זרעו את התאים בלוחיות באמצעות laminin או FBS כדי לסייע להם להיצמד ללוחיות. בשימוש ב-FBS, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע עם תאים לכל אחת.ננער בעדינות את הפלטה כדי לפרוס את האגרגטים ונניח לתאים להיקשר למשך הלילה. למחרת, בטמפרטורה של 37 °C, נחליף את כל המצע בשני מיליליטר של NIM לכל באר. לאחר יום או יומיים של אינקובציה, כל אגרגט יתפשט ויהפוך לשכבה אחת (monolayer), ובתוך מספר ימים, מרכזי התאים ברובם ייראו מבחינה מורפולוגית בדומה לתאי עמוד (columnar cells).בסביבות הימים 14 עד 17, תאי העמוד (columer cells) ייראו דחוסים יותר. לעיתים התאים יוצרים רכסים או טבעות עם לומינה (lumen) גלויה בפנים. לפני בידוד התאים, בחנו אותם לאיתור תאי אפיתל שאינם EU והשתמשו בקצה של פיפטה כדי לגרד אותם החוצה.כדי לבודד את תאי העור העצבי (neuro epithelial cells) הנמצאים במרכז המושבות, השתמשו במיקרו-פיפט ובפיפט מסננת סטרילי בנפח של 1 mL כדי להפעיל לחץ על מרכז המושבה עד שהיא תתרחף ותיפרד. היזהרו שלא לגרום גם לחלק החיצוני של המושבה להתנתק.העבירו תאים מבודדים מכמות של שתי צלחות למבחנה של 15 milliliter וסבבו ב-200 G למשך שתי דקות. לאחר הסרת המצע, העבירו את התאים לבקבוק T 25 שלא עבר טיפול לתרבית רקמה המכיל 10 milliliters של NIM. עם הוספת B 27 הדגירו למשך לילה; למחרת, התאים אמורים להיראות כספרואידים (בעלי מראה דמוי כדור).לעיתים יבודדו גם תאים פריפריאליים, והם בדרך כלל יידבקו לתחתית הבקבוק. אם זה קורה, העבירו את התאים הספרואידיים לבקבוק חדש, והשאירו את התאים הדבקים מאחור. תרבתו את הנוירוספירות בתרחיף NIMB 27 למשך שבוע אחד כדי לעודד עמידות ותגדילות של התאים.הוסיפו cyclic AMP ו-insulin-like growth factor one. בסוף השבוע, הנוירוספירות יכילו פרוגניטורים צפליים ויהיו מוכנות להעברה ללוחיות כיסוי לצורך דיפרנציאציה סופית. כדי להכין לוחיות כיסוי מצופות polyurethane laminin בפלטות של 24 בארות, התחילו בציפוי לוחיות כיסוי נקיות בתמיסת polyurethane בריכוז 0.1 milligram per milliliter בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה, לאחר מכן צפו את לוחיות הכיסוי ב-laminin בכמות של 50 microliters בריכוז 20 microgram per milliliter של laminin עבור דיפרנציאציה עצבית.תוספת מצע לכל זכוכית כיסוי שעובדה בפוליאוריתן. יש להקפיד שהנוזל יגע בזכוכית הכיסוי בלבד. הדגירה תתבצע בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה עד שעתיים.לאחר הדגירה בלמינן, אסוף ושטוף את הנוירוספירות ב-D-M-E-M-F 12. אם התאים גדולים מדי מכדי להיצמד כראוי, הוסף כ-2 mL של Accutane והדגר את התאים ב-37 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין, ולאחר סבוב בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך שלוש דקות, החלף את התמיסה ב-NDM והשתמש בפיפט P 200 כדי לפרק את התאים לצבירים קטנים.הניחו אותם על לטיות כיסוי (cover slips) מצופות מראש, שאבו את רוב המצע והעבירו את התאים לכלי פטרי בן שישה סנטימטרים בכמה טיפות של המצע, כדי להקל על הברירה שלהם מבלי להסיר את הלמינין מהלטיות המצופות. העבירו כארבעה עד חמישה נוירוספירים לכל לטייה. אפשרו לנוירוספירים להיקשר למשך שעתיים עד ארבע שעות לפחות לפני הוספת 0.5 milliliters של מצע התמיינות נוירונית המועשר ב-B 27 cyclic.מחליפים מחצית מהמדיום כל יומיים באמצעות MP וגורמים נוירוטרופיים. ניתן לתחזק את התאים למשך מספר חודשים, כפי שמוצג כאן. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגזור תאי PSC אנושיים לנוירונים גלוטמטריים טלוניים צפליים (talon cephalic) דרך מספר שלבים קריטיים.היווצרות אגרגטים של PSC משרה השראת תאי אפיתל עצביים, יצירת תאי אב טלונצפליים (talon cephalic progenitors), ודיפרנציאציה סופית של תאי אב אלו לנוירונים טלונצפליים. מערכת זו היא חסונה ויעילה ביצירת תאי אב ונוירונים גלוטמטארגיים צפליים, למשל. ללא הוספת גורמים משרים, תאי ה-HSC עברו דיפרנציאציה לשושלת העצבית 24 ימים לאחר הדיפרנציאציה.מרבית התאים הקדמוניים העצביים היו חיוביים ל-Fox G1, פקטור שעתוק המבוטא ב-cephalon, אך שליליים ל-HOXB4, סמן עבור תאי המוח האחורי וחוט השדרה, מה שמעיד על כך שהתאים הקדמוניים של ה-telencephalon נוצרו בהצלחה. תאים קדמוניים אלו של ה-telencephalon בעלי פנוטיפ דורסלי, כפי שמעיד הביטוי של PAX6, סמן המבוטא בתאים קדמוניים דורסליים, אך לא של NKX2.1, סמן עבור תאים קדמוניים ונטרליים.בעקבות התמיינות נוספת, פרוגניטורים דורסליים צפליים אלו התמיינו לנוירונים גלוטמטרגיים, שהיו חיוביים לסמן הגלוטמטרגי. נוירוני TBR one שנשאר חיוביים ל-TBR one היו חיוביים גם לסמנים נוירונליים beta three tubulin או map two. תאים אלו ביטאו גם את vesicular glutamate transporter one או V glut one, סמן לנוירונים גלוטמטרגיים בוגרים, דבר המצביע על ייצור יעיל של נוירונים גלוטמטרגיים צפליים בתרבית.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו השאלה האם נוירונים אלו יכולים ליצור קשרי סינפסה עם תאים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של התהליך להגבהה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ובידולם לנוירונים גלוטמטארגיים צפליים דרך מספר שלבים קריטיים.היווצרות אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים, השראת תאי אפיתל עצביים, יצירת תאי מקור צפאלים (cephalic progenitors), והבידול הסופי של תאי מקור אלו לנוירונים צפאלים.

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סרטון זה מדגים את תהליך התמיינות גופים עובריים (EBs) לצברים נוירואפיתליאליים וחלוקתם לאחר מכן לתאי עצב וגלייה. שיטה זו מאפשרת יצירה יעילה של תאי עצב וגליה במבחנה, המשמשים כמערכות בדיקה לבדיקת רעילות וכן להערכה של מסלולים שונים המעורבים ברעילות עצבית.

יצירת תאי עצב ותאי גליה מגופי עובר פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתמיין לנוירונים על ידי העברתם עם לנטי-וירוסים מהונדסים הנושאים גן גורם שעתוק נוירוגני תחת שליטה של אלמנט מגיב טטרציקלין, ולאחר מכן טיפול בנגזרת טטרציקלין ומדיום התבגרות.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

אנחנו, בהתבסס על ידע מביולוגיה התפתחותית ומחקר שפורסם, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוירונים דופמינרגיים A9 במוח התיכון הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, שיהיו שימושיים למידול מחלות וטיפול בהחלפת תאים למחלת פרקינסון.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) נחשבים כלי רב עוצמה עבור סריקה וכימיים ההקרנה ופיתוח של מודלים חדשים במבחנה לבדיקת רעילות, כולל נוירוטוקסיטי. הנה, פרוטוקול מפורט עבור ההבחנה של hiPSCs לתוך נוירונים וגליה מתואר.

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

למדו לייצר נוירונים טלנצפליים גלוטמטיים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות דיפרנציאציה ספונטנית ויצירת נוירוספירות. שיטה זו מאפשרת חקר התבגרות נוירונלית וביולוגיה התפתחותית.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

גלה סרטונים נוספים