Name: חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: חקור קיטוב מקרופאגים במודל מבודד מח עצם עכברים. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטריה ו-PCR בזמן אמת לניתוח תגובות הפעלה M1 ו-M2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי (7,850,037 BGIA לד&quot;ר Beiyan ג&#39;ואו).

1. בידוד של תאים במח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את עצם ירך ועצמות שוקה 6-8 עכברים ישנים שבוע, לשטוף את השיער ולאחר מכן לחתוך את העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 21G ומזרק 10 מ&quot;ל כדי לשטוף את מוח לסרום קר PBS 2% חום מומת שור עוברי (FBS) (3-5 מ&quot;ל / עכבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח עובר דרך מחט 21G 4-6 פעמים לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עוברים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים, עצמות, שיער ותאים / רקמות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 נפח של פתרון Cl 4 NH (0.8% פתרון 4 Cl NH, StemCell טכנולוגיה), ולדגור על קרח במשך 10 דקות כדי להסיר את תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב PBS 2% FBS הקר (20-50 מ&quot;ל, תלוי בכמות תאים). </li></ol> 2. גיבוש BMDM אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי מח העצם המבודדים במדיום גידול BMDM (2x10 6 תאים / מ &#39;יב). </li></ol> מדיום גידול BMDM: בינוני של של Iscove שינוי Dulbecco (IMDM) + 10% FBS + 15% מסוננים (0.2 מיקרומטר) תא (ATCC, CCL-1) התרבות supernatant (המכיל גורם המגרה מונוציטים מושבה, M-CSF) או 10 ng / ml M L-929 -CSF. הערה: L-929 supernatant התא מכיל M-CSF 18. כדי להבטיח פעילות האפקטיבית של מדיום אוויר, 5 X 10 5 L-929 תאים הם זורעים בT75 ס&quot;מ 2 צלוחיות עבור 6-7 ימים, בינונית מותנה נאסף ועבר דרך 0.45 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. ניתן להשתמש בו באופן מיידי aliquots בינוני או מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך 1-2 חודשים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב6 או 12 צלחות תרבית רקמה כן (תלוי בעיצוב ניסיוני) (קורנינג שחקן משנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מדיום גידול BMDM טרי ביום 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, היווצרות BMDM הבוגרת מוערכת באמצעות ניתוח תזרים cytometryוfluorophore נוגדנים מצומדות כדי לזהות תאי המבטאים CD11b וF4/80. </li></ol> 3. הפעלה מקוטבת BMDM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לשנות לגירוי בינוני טרי: להפעלת M1, השתמש IMDM המכיל 10% FBS ו100 LPS ng / ml או 100 ng / ml LPS עם 50 ng / ml IFNγ; להפעלת M2, השתמש IMDM המכיל 10% FBS עם 10 ng / ml IL-4 ו / או 10 ng / ml IL-13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף BMDMs מגורה על ידי ניתוקם מהצלחת באמצעות 0.05% טריפסין חם, ואחריו על ידי שטיפה את התאים פעמיים עם PBS המכיל 10% FBS. </li></ol> הערה: כדי לנתק וresuspend מקרופאגים הבשלים לאחר התמיינות, פתרון טריפסין 0.05% (המכיל 0.48 מ&quot;מ EDTA, Invitrogen) או 2-5 מ&quot;מ EDTA בCa-Mg וללא חיץ PBS או מאוזן של האנק (HBSS) יכולה להיות בשימוש. בעת שימוש במדיום עיכול המכיל טריפסין, טיפול בתאים על 37 מעלות צלזיוס במשך פחות מ -10 דקות כדי למנוע אובדן של סורפני חלבונים בשל יתר מערכת העיכול. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנוגדנים כדי לזהות ביטוי של פני שטח אנטיגנים תא, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 או CD86 בנקודות זמן שונים תוך שימוש בנהלים מכתים cytometry זרימה רגילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ביטוי של גנים אופייניים למקרופאגים M1 ו-M2 הופעל כולל IL-1β, TNF-α ו-IL-6 (הפעלת M1) או IL-10, IL-13, וarginase1 PPARγ (הפעלת M2) באמצעות qRT-PCR. לקבוע הפעלה של מסלולי איתות תא המעורבים בהפעלה של מקרופאגים M1 או M2 על ידי ניתוח סופג מערבי. </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מדווחים כאן הליך פשוט וישימה בקלות במבחנה כדי לגרום להפעלה של מקרופאגים הנגזרים מתאי אב במח עצם. הליך זה יכול לשמש לחקירה של מנגנונים אחראים לקיטוב של מקרופאגים. טוהר מקרופאגים בוגרים הושג באמצעות ממוצעי פרוטוקול זה 95-99%, ואין הליכי טיהור נוספים נדרשים. כדי לחקור את תפקידם של גנים ספציפיים של אינטרסים בהקשר של קיטוב מקרופאג, ביטוי חוץ רחמי או מציאה הגן ספציפית יכול להתנהל transfection הבאה של התאים ביום 7. פרוטוקול זה גם יספק חלון תרבות בן 7 ימים כדי לחקור את ההשפעו...

להבדיל מתגובות דלקתיות הקלסיים, מקרופגים שלחדור רקמות לעתים קרובות להציג את מצב הפעלה של מקוטב שממלא תפקיד מכריע בויסות פונקציות פיסיולוגיות של רקמות מארחות 1-8. על הגירוי, הפעלת מקרופאג ניתן למיין לקלסית (M1) ואלטרנטיבית (M2) הפעלה 2, 4, 9. הפעלת מקרופאג M1 תלויה בקולטנית Toll-כמו (TLRs) והפעלה של פקטור הגרעיני kappa B (NFκB) / ג ביוני N-מסוף קינאז 1 (JNK1), מוביל לייצור של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNF-α ו-IL- 1β והפעלה של INOS כי תוצאות בייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי כגון תחמוצת ניטריד (NO) 10, 11. בניגוד לכך, מגויסי M2 macrophage הפעלת PPARγ, PPARδ, או IL-4-Stat6 מסלולים, שהובילו להפעלה אלטרנטיבית, אנטי דלקתית (M2), כי הוא קשור עם גברת ביטוי של הקולטן מנוז CD206, ו1 arginase (ARG1) 6, 12 - 14 &lt;/ Sup&gt;. מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) להציג אידיאליים במודל חוץ גופית להבין את מנגנוני שליטה קיטוב של מקרופאגים הופעל 15. באופן ספציפי, הפעלה של מקרופאגים M1 יכולה להיגרם על ידי lipopolysaccharides (LPS) גירוי, בעוד שקיטוב של מקרופאגים M2 יכול להיגרם על ידי IL-4 ו / או IL-13. ניתן לזהות מקרופאגים בוגרים מח עצם נגזרות ומקרופגים מופעלים באמצעות ניתוח תזרים cytometry לביטוי של פני שטח אנטיגנים, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ו CD86 9, 16, 17. בנוסף, ניתן למדוד שינויים בייצור ציטוקינים ומסלולי איתות סלולריים הקשורות לקיטוב מקרופאג על ידי כמותי RT-PCR והמערבי סופג, בהתאמה. לסיכום, מקרופאגים מח עצם נגזרות עכבר יכולים לשמש כמודל רלוונטי ללמוד קיטוב מקרופאג במבחנה.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>עכברים GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים</td><td>m BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יוד</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

חקירה של קיטוב macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות במודל חוץ גופית לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.

תיאור סכמטי של הליך דור BMDM מוצג (איור 1). טוהר גבוה של מקרופאגים בוגרים ניתן להבחין ביום 7, כאשר הם מייצגים 95-99% מCD11b + F4/80 + תאים (איור 2). ניתן לבחון מקרופאגים מקוטבות באמצעות נוגדנים נגד CD11b, F4/80, CD11c וCD206 ואחרי ניתוח cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 3, מקרופאגים M1 מזוהים כמו CD11b + + F4/80 CD11c + CD206-תאים (Q2), ואילו מקרופאגים M2 הם CD11b + + F4/80 CD11c-CD206 + תאים (Q4). מצב הפעלת BMDM יכול להיות מ...

המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל כדי לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

ליצירת מקרופגים המופקים ממחית עצם לצורך אנליזת קיטוב. עצמות הפמור והטיביה מבודלות מעכברים ותאי מחית העצם נאספים. לאחר מכן, התאים נתרחלים במצע המכיל גורמי גדילה כדי להשרות היווצרות מקרופגים.לאחר שבעה ימי תרבית, המקרופאגים המופקים ממח עצם מטופלים בגירויים שונים ועוברים קיטוב. תגובות ההפעלה נותחות באמצעות ציטומטריית זרימה, real-time PCR ואנליזת western blot; התוצאות המתקבלות מראות טהרה גבוהה של מקרופאגים המופקים ממח עצם עם תגובות הפעלה מקוטבות למסלול M1 או M2, בהתאם לגירויים.השלכה של טכניקה זו היא לקראת טיפול או אבחון של מחלות קשורות למגוון, כולל עמידות לאינסולין ו-CROs, מכיוון שמאקרופאגים חודרים ל-T הם שחקני מפתח בהקשר זה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן בידוד של תאי מח עצם הוא קשה למדי והתנובה היא קריטית להשגת הכנה מספקת של תאים למחקר לצורך השראה של היווצרות מאקרופאגים. עבדו במנדף סטרילי. התחילו פרוטוקול זה עם עצמות פמור וטיביה שבודדו מעכברים בני שש עד שמונה שבועות בצלחת לתרבית רקמות. שטפו את העצמות ב-PBS ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי לחתוך את שני קצות העצמות, תוך הקפדה לא להסיר יותר מדי בעודכם מחזיקים את העצם עם פינצטה.החדירו מחט במידה 21 או 23 עם מזרק של 10 מיליליטר המכיל PBS קר עם 2% FBS שהופעל בחום לאחד מקצוות העצם. לחצו על הבוכנה כדי לשטוף את מחית העצם אל תוך צלחית תרבית רקמה חדשה. לאחר מכן, העבירו את מחית העצם דרך אותה מחט ארבע עד שש פעמים כדי לפרק את התאים.לאחר מכן, שפכו את התאים למסננת תאים של 70 מיקרון כדי להסיר גושים של תאים, עצם, שיער ותאים או רקמות אחרות. אספו את הנוזל שעבר בסינון לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. לאחר שהתמיסה עברה דרך המסנן, הוסיפו לשנשננית שלושה נפחים של ammonium chloride בריכוז 0.8% והדגירו על קרח למשך 10 דקות.להסרת תאי דם אדומים לאחר הדגירה, סבבו את התאים ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר הסבב, השהו מחדש את משקע התאים ב-20 עד 50 milliliters של PBS קר עם 2% FBS. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שפיכת הנוזל העליון (supernatant), המשיכו להשראת היווצרות BMDM כפי שמתואר בסעיף הבא של הפרוטוקול. כדי להשרות היווצרות BMDM, השעו את תאי מוח העצם המבודדים במצע גידול BMDM בריכוז של 2X.זרוו שש תאים למילליליטר, קצב של 1 עד 2 כפול 10⁶ תאים בכל באר של פלטת תרבית רקמות בעלת 6 או 12 בארות, והדגרירו את התאים ב-37 °C. זריעה בריכוז זה תקל על התנתקות התאים לצורך ציטומטריה של זרימה לאחר שלושה ימים. החליפו למצע גידול BMDM טרי ביום השביעי.היווצרותם של BMDM בוגרים מוערכת באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה ונוגדנים מצומדים לפלואורופור כדי לזהות תאים המבטאים CD 11 B ו-F four 80. לאחר אישור היווצרותם של BMDM בוגרים, העבירו למצע DMEM modified Is cove's טרי עם 10% FBS ו-LPS או LPS ו-interferon gamma להפעלת M1, או IL four או IL 13 להפעלת M2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.אספו את ה-b MDMs המעוררים על ידי ניתוקם מהצלחת. לשם כך, הסירו את המצע מהתאים ושטפו ב-PBS ללא סידן או מגנזיום. לאחר מכן, הוסיפו 0.05% trypsin חם המכיל 0.48 millimolar EDTA, והדגרירו ב-37 degrees Celsius למשך לא יותר מ-10 דקות כדי למנוע איבוד של חלבוני פני השטח עקב עיכול יתר.לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם PBS המכיל 10%FBS והעבירו אותם למבחנות דגימה בנפח 1.2 מיליליטר. השתמשו בנוגדנים כדי לזהות ביטוי של אנטיגנים על פני השטח של התא, כולל CD 11 BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 או CD 86 בנקודות זמן שונות. השתמשו בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים של ציטומטריית זרימה תוך שימוש ב-quantitative PCR.קבע את רמות הביטוי של IL-1β, TNF-α ו-IL-6 כדי להעריך הפעלה של M1, או של IL-10, IL-13, arginase 1 ו-PPAR-γ כדי להעריך הפעלה של M2. לבסוף, בצע western blotting כדי להעריך הפעלה של מסלולי איתות תאיים המעורבים בהפעלה של מקרופאגים M1 או M2, זאת כדי להעריך את טוהר ה-BMDM הבשלים. לאחר ההשראה, בוצע ניתוח flow cytometric באמצעות נוגדנים נגד CD11b, F4/80, CD11c ו-CD206. ה-BMDMs סוננו תחילה לפי FSC ו-SSC כדי להסיר תאי DRI ותצמיגים.MDMs בוגרים הוגדרו כתתי-אוכלוסיות חיוביות ל-CD 11 B וחיוביות ל-F four 80, הנראות בחלק הימני העליון של תרשים זה והוות 95 עד 99% מהאוכלוסייה המגודרת להערכת קיטוב מקרופאגים. בוצע ניתוח נוסף. ראשית, בוצע גידור (gating) כדי לזהות מקרופאגים שהסתננו לרקמה, שהם תאים חיוביים ל-CD 11 B וחיוביים ל-F four 80.מבין אלו, מקרופגים מסוג M1, החיוביים ל-CD 11 C ושליליים ל-CD 2 0 6, מופיעים ברביע השני, בעוד שמקרופגים מסוג M2, השליליים ל-CD 11 C והחיוביים ל-CD 2 0 6, מופיעים ברביע הרביעי. כדי להעריך את הפעלת המקרופגים, תאים הודגרו עם LPS להשראת הפעלת M1 או עם IL four להפעלת M2. עם ההפעלה, גודלם של המקרופגים גדל, כפי שמעידה ההסטה של FSCA של מקרופגים מסוג M1 או M2 ב-24 שעות לאחר הגירוי בהשוואה למקרופגי M0 שלא טופלו.סמני שטח הקשורים להפעלה של מקרופאגים נותחו אף הם לאחר הגירוי. הסמן המגיב המוקדם CD 69 הוערך חמישה או 24 שעות לאחר הגירוי, והסמנים CD 80 ו-CD 86 נותחו 48 שעות לאחר הגירוי. כפי שמוצג כאן, נצפתה שפע גבוהה יותר של CD 69, CD 80 ו-CD 86 על פני השטח של מקרופאגים שעברו גירוי, וזאת כדי להעריך הפעלה קלאסית ואלטרנטיבית של מקרופאגים.תאים שעברו גרייה באמצעות LPS או IL-4 למשך 24 שעות נאספו, ו-RNA כולל הוצא מהם לצורך ניתוח באמצעות quantitative real-time PCR כפי שמוצג כאן. ביטוי מוגבר של arginase one ו-PPAR gamma זוהה במקרופאגים מסוג M2 בהשוואה למקרופאגים שלא טופלו. ביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים, Interleukin-1 beta ו-TNF alpha, עלה במקרופאגים מסוג M1. כדי להעריך את הפעלת נתיב NF-kappaB על ידי LPS, נעשה שימוש בנוגדנים נגד p65 ו-phospho-p65 בניתוח western blot כפי שמוצג כאן.פס חזק יותר כנגד P 65 מזופספוריל נראה לאחר טיפול ב-LPS. יחד, נתונים אלו מצביעים על מקפגים ממקור מחילק העצם עם תגובות הפעלה מקוטבות לגירויי M1 או M2. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכוש הבנה טובה באופן הפקת מקפגים ממקור מחילק העצם, ולאחריה ניתוח הפעלה מקוטבת.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להעריך את טהרת המקרופגים המובחנים לפני בדיקת התגובה שלהם. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטה כגון טרנספקציה זמנית של גנים או SHRA כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד הגנים מעורבים בוויסות של הפעלת המקרופגים?

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה...

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לגרימת התמיינות וקיטוב של מונוציטים היקפיים שמקורם בדם למקרופאגים M1 או M2. דגירה עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים, ליפופוליסכריד ואינטרפרון-גמא מניבה מקרופאגים M1 מעודדי דלקת, ואילו דגירה עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים ואינטרלוקין-4 גורמת לייצור מקרופאגים אנטי-דלקתיים מסוג M2.

התמיינות וקיטוב של תאים שמקורם במונוציטים לתאים דמויי מקרופאגים

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

פרוטוקול זה מספק שיטה ללמוד זיהום שחפת Mycobacterium במאקרופאגים אנושיים M1- או M2 מקוטבים המבוססים על בידול של מונוציטים היקפיים-דם לתאים דמויי מקרופאג' הנגועים בזן הארסי H37Rv המסומן על ידי GFP, ומנותחים עם ציטומטריית זרימה באמצעות פאנל של 10 צבעים כולל ביטוי של סמני M1/M2 נבחרים.

קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת הפוטנציאל החיסוני של משטחי שתלים במבחנה, במטרה לשפר את האמינות והשחזור של הפרוטוקולים הנוכחיים ולקדם מחקר נוסף. פרופילי ציטוקינים מפרישים, ביטוי mRNA וסמני פני התא נוטרו באמצעות מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם כדי לחקור קיטוב מקרופאגים המעובדים על טיטניום.

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל 

חקור קיטוב מקרופאגים במודל מבודד מח עצם עכברים. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטריה ו-PCR בזמן אמת לניתוח תגובות הפעלה M1 ו-M2.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

גלה סרטונים נוספים