חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם
23 ביוני 2013
המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות במבחנה מודל כדי לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.
ליצור מקרופאגים שמקורם במח עצם לניתוח קיטוב. עצמות עצם הירך והשוקה מבודדות מעכברים ותאי מח העצם נאספים. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיום המכיל גורמי גדילה כדי לגרום להיווצרות מקרופאגים.
לאחר שבעה ימים של תרבית, המקרופאגים שמקורם במח העצם מטופלים בגירויים שונים ובמקרופאגים מקוטבים. תגובות ההפעלה מנותחות על ידי זרימה ציטומטרית, PCR בזמן אמת ותוצאות ניתוח blos מערביות מתקבלות המראות טוהר גבוה של מקרופאגים שמקורם במח עצם עם תגובות הפעלה מקוטבות ל-M1 או M שתיים. גירויים משקרים.
ההשלכה של טכניקה זו היא עמידה לקראת טיפול או אבחון של מחלות הקשורות למגוון, כולל עמידות לאינסולין וה-CROs מכיוון שמקרופאגים חודרים ל-T הם שחקן מרכזי בהקשר זה, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהאצת תאי מח העצם קשה במקצת והתשואה קריטית להשגת הכנה מספקת של תאי מחקר להשראת היווצרות מקרופאגים עבודה במכסה מנוע סטרילי. התחל את הפרוטוקול הזה עם עצמות עצם הירך והשוקה שבודדו מעכברים בני שישה עד שמונה שבועות בצלחת תרבית רקמה. שטפו את העצמות ב-PBS ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי לחתוך את שני קצוות העצמות, והקפידו לא להסיר יותר מדי תוך כדי החזקת העצם בעזרת מלקחיים.
הכנס מחט 21 על 23 עם מזרק של 10 מיליליטר המכיל PBS קר עם FBS מופעל בחימום של 2% לקצה אחד של העצם. לחץ על הבוכנה כדי לשטוף את המח החוצה לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה. לאחר מכן, העבירו את המח דרך אותה מחט ארבע עד שש פעמים כדי לנתק את התאים.
לאחר מכן שפכו את התאים למסננת תאים של 70 מיקרון כדי להסיר גושי תאים, עצם, שיער ותאים או רקמות אחרות. אוספים את הזרימה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר שהתמיסה עברה דרך המסנן, הוסף שלושה נפחים של 0.8% אמוניום כלוריד לזרימה ודגירה על קרח למשך 10 דקות.
כדי להסיר כדוריות דם אדומות לאחר הדגירה, סובב את התאים ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, השעו מחדש את כדור התא ב-20 עד 50 מיליליטר PBS קר עם 2% FBS. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו.
סובב את התאים ב-500 פעמים G למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר ששפכו את הספינאט. המשך לגרום להיווצרות BMDM כמתואר בסעיף הבא של הפרוטוקול כדי לגרום להיווצרות BMDM Resus, השהה את תאי מח העצם המבודדים במדיום גידול BMDM בריכוז של פי שניים.
מרכז את ששת התאים לזרע מיליליטר פעם עד פעמיים 10 לששת התאים בכל באר של צלחת תרבית רקמה של שש או 12 בארות ודגירה על התאים ב-37 מעלות צלזיוס. זריעה בריכוז זה תקל על ניתוק לזרימה ציטומטרית לאחר שלושה ימים. שנה למדיום גידול BMDM טרי ביום השביעי.
היווצרות BMDM בוגר מוערכת באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה ונוגדנים מצומדים פלואורול כדי לזהות תאים המבטאים CD 11 B ו-F 4 80. לאחר אימות היווצרות BMDM בוגר, שינוי לטרי הוא מדיום ההד השונה של המפרץ עם 10% FBS ו-LPS או LPS וגמא אינטרפרון להפעלת M1 או IL 4 או IL 13 להפעלת M שתיים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר 24 שעות.
אספו את ה-b MDMs המגורים על ידי ניתוקם מהצלחת. לשם כך יש להוציא את המדיום מהתאים ולשטוף עם PBS ללא סידן או מגנזיום. לאחר מכן הוסיפו 0.05% טריפסין חם המכיל 0.48 מילי-מולר, EDTA דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-10 דקות כדי למנוע אובדן חלבונים על פני השטח עקב עיכול יתר.
לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS המכיל 10% FBS והעבירו אותם לצינורות דגימה של 1.2 מיליליטר. השתמש בנוגדנים כדי לזהות ביטוי של אנטיגנים על פני התא כולל CD 11 BF ארבע 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 או CD 86 בנקודות זמן שונות. שימוש בהליכי צביעת ציטומטריית זרימה סטנדרטיים באמצעות PCR כמותי.
קבע את רמות הביטוי של IL אחד בטא TNF אלפא ו-IL 6 כדי להעריך את הפעלת M1 או IL 10 IL 13, ארגינאז אחד ו-PPAR gamma כדי להעריך את הפעלת M two. לבסוף, בצע כתמים מערביים כדי להעריך את ההפעלה של מסלולי איתות תאים המעורבים בהפעלה של שני מקרופאגים M1 או M, כדי להעריך את טוהר ה-BMDM הבוגר. לאחר זרימת האינדוקציה, בוצע ניתוח ציטומטרי באמצעות נוגדנים כנגד CD 11 BF ארבעה 80, CD 11 C ו-CD 2 0 6 B.MDMs הוצמדו לראשונה על FSC ו-SSC כדי להסיר DRI ומצומדים.
MDMs בוגרים הוגדרו כ-CD 11 B חיובי F ארבע 80 תת-אוכלוסיות חיוביות, שנראות בפינה הימנית העליונה של תרשים זה ופגעו ב-95 עד 99% מהאוכלוסייה המגודרת כדי להעריך את קיטוב המקרופאגים. בוצע ניתוח נוסף. שער ראשון בוצע כדי לזהות מקרופאגים שחדרו לרקמות, שהם CD 11 B חיובי F ארבעה תאים חיוביים 80
.מבין אותם מקרופאגים M1, שהם CD 11 C חיובי ו-CD 2 0 6 שלילי מופיעים ברבע השני, בעוד M שני מקרופאגים, שהם CD 11 C שלילי ו-CD 2 0 6 חיוביים מופיעים ברבע ארבע. כדי להעריך את הפעלת המקרופאגים, התאים הודגרו עם LPS כדי לגרום להפעלת M1 או IL 4 להפעלת M שתיים. עם ההפעלה, גודל המקרופאגים גדל כפי שמעיד המעבר של FSCA של M1 או M שני מקרופאגים ב-24 שעות לאחר הגירוי בהשוואה ל-M אפס לא מטופל.
סמני פני השטח הקשורים להפעלת מקרופאגים נותחו גם הם לאחר הגירוי. סמני התגובה המוקדמת CD 69 הוערכו חמש או 24 שעות לאחר הגירוי, סמני CD 80 ו-CD 86 נותחו 48 שעות לאחר הגירוי. כפי שמוצג כאן, שפע מוגבר של CD 69, CD 80 ו-CD 86 על פני השטח נצפתה במקרופאגים מגורים כדי להעריך הפעלה קלאסית וחלופית של מקרופאגים.
אלה שעוררו עם LPS או IL 4 במשך 24 שעות נאספו וסך ה-RNA חולץ לניתוח על ידי PCR כמותי בזמן אמת כפי שמוצג כאן. ביטוי גמא מוגבר של ארגינאז אחד ו-PPAR זוהו בשני מקרופאגים M בהשוואה לביטוי מקרופאגים לא מטופלים של ציטוקינים פרו-דלקתיים. אינטרלוקין אחד בטא TNF אלפא גדל במקרופאגים M1 כדי להעריך את הפעלת מסלול NF kappa B על ידי נוגדני LPS כנגד P 65 ו-P 65 הקשור לפוספו שימשו בניתוח כתמים מערביים כפי שמוצג כאן.
רצועה חזקה יותר נגד P 65 זרחני נראית עם טיפול LPS שנלקח. יחד, נתונים אלה מצביעים על מקרופאגים שמקורם במח עצם עם תגובות הפעלה מקוטבות לשני גירויים M1 או M. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מקרופאג שמקורו במח עצם, ואחריו ניתוח הפעלה מקוטב.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להעריך את הטוהר של מקרופאגים מובחנים לפני בדיקת תגובתם. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה כמו טרנספקציה חולפת של גנים או SHRA על מנת לענות על שאלה נוספת כמו, כיצד גנים מעורבים בוויסות הפעלה של מקרופאגים?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל in vitro אדפטיבי לחקר קוטביות של מקפגים. תאי גזע/פרוגניטורים המטופויים ממחולל גרמי של עכבר מובחלים למקפגים ומעוררים כדי להגיע לקוטביות של פנוטיפים M1 או M2.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- קיטוב מאקרופגים הוא קריטי להבנת התגובות החיסוניות.
- גירויים שונים יכולים להוביל לקיטוב מסוג M1 או M2.
- ציטומטריה זרימה ו-PCR הן שיטות נפוצות לניתוח הפעלה של מאקרופגים.
- מחקר זה משתמש במאקרופגים המופקים ממח עצם לצורך ניתוח ניסויי.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל לחקר קיטוב של מקרופאגים.
- ניתוח ההשפעות של גירויים שונים על הפעלת מקרופאגים.
- מעקב אחר שינויים באנטיגנים על פני השטח של התא וביטוי גנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עצמות פמור (ירך) וטיביה (שוק) מעכברים.
- איסוף וגידול של תאי מחית עצם עם גורמי גדילה.
- קיטוב של מקרופגים באמצעות גירויים שונים.
- ניתוח של תגובות הפעלה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-real-time PCR.
תוצאות עיקריות
- הושגה רמה גבוהה של טוהר עבור מקפגים (macrophages) המופקים ממח עצם.
- מקפגים מקוטבים הציגו תגובות הפעלה מובחנות.
- בדיקות flow cytometry ו-PCR אישרו את הצלחת הקוטב.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי מצבים תפקודיים של מקפגים.
מסקנות
- המודל שפותח יעיל לחקר פולריזציה של מקרופאגים.
- גירויים שונים מובילים לפרופילים מובחנים של הפעלת M1 ו-M2.
- מחקר זה מעמיק את ההבנה של הביולוגיה של המקרופאגים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של קיטוב מקרופאגים המשתמשים במקרופאגים המופקים ממחולל הגזירה (BMDMs) מספקים פלטפורמה חסונה לבחינת תפקוד תאי חיסון וויסות נתיבים בשלבי גילוי מוקדמים. הערכה כמותית של מצבי קיטוב מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית ותומכת בביטחון ניבוי בתיקוף מטרות עבור פורטפוליו של אימונולוגיה ודלקות. מערכת זו מקלה על רצף תרגומי משלב הגילוי במעבדה (in vitro) למודלים פרה-קליניים של מחלות שבהם פנוטיפים של מקרופאגים מעורבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות חיסוניות על ידי כימות תגובות קיטוב M1/M2.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות גירויים ומדדים ספציפיים למסלול.
- מקל על בדיקת השערות לגבי מעורבות של גן או מסלול בהפעלה של מקרופאגים.
- מספק מערכת מבוקרת לניתוח של סיגנלינג ותפקודי אפקטור של תאי מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת הכנות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של BMDM עבור תהליכי סינון המשך.
- מאפשרת קריאות כמותיות באמצעות פלוו-ציטומטריה ו-PCR לצורך פיתוח בדיקות.
- תומכת בהערכה חסונה של השפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות על מצבי מקרופאגים.
- מאפשרת הכנה ניתנת להרחבה ותוצרי פנוטיפ עקביים בין ניסויים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מצבי קיטוב in vitro לפנוטיפים של מקרופאגים הרלוונטיים למחלה הנצפים in vivo.
- מאפשרת גילוי של סמני ביולוגים (biomarkers) על ידי קישור פרופילים של אנטיגנים על פני השטח וביטוי גנים לתוצאות פונקציונליות.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים של אסטרטגיות אימונומודולטוריות למודלים פרה-קליניים.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי פתולוגיה המונעת על ידי מקרופאגים לצורך מחקר תרגומי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
תהליך עבודה זה של פולריזציה של BMDM מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, בכך שהוא מאפשר בחינה מונחית-השערה של מנגנוני חיסון ותיקוף של מטרות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערת האפס לגבי תפקוד של גן או מסלול בהפעלה של מקרופאגים.
- סריקה: מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סריקה של תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליטיקה: מספק נתוני ציטומטריה זרימה, qPCR ו-western blot לצורך ניתוח השוואתי של מצבי קיטוב.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה של ממצאים in vitro לפנוטיפים של מקרופאגים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וסתגלנית למחקרי תפקוד של תאי מערכת החיסון לאורך תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות חיסוניות ובניתוח מסלולים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של בדיקות מקרופאגים לשימוש בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים מכניסטיים חסונים בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של נכסי אימונולוגיה ודלקת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים ראשוניים, תרביות תאים ואימונופנוטיפציה.
- נדרשת גישה למכשור של ציטומטריה זרימה, qPCR ו-western blot.
- נדרש תקינה קפדנית של פרוטוקולי הכנת התאים והסטימולציה בין הצוותים השונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים שונים או מודלים של מחלות.
- התבyield והטוהר של BMDMs הם קריטיים לניתוחים אמינים בהמשך התהליך.
