ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות נגיף שפעת A באמצעות שבב מיקרופלואידי. ראשית, הפעל את הדגימה עם מאגר ליזה דרך תעלת ה-SPE כדי לחלץ את הנגיף ולחלץ RNA, לטעון את המגיב R-T-P-C-R עם RNA שחולץ ולהפעיל את ערוץ השעתוק ההפוך כדי להמיר RNA ויראלי ל-CDNA. לאחר מכן, הפעל את התערובת לתוך תעלת ה-PCR על מנת להגביר את תוצאות ה-DNA המתקבלות המראות את גודל וריכוז האמפליקון על סמך אות הקרינה מאלקטרופורזה נימית.

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מקבלת את דגימת המטופל הגולמית והיא משלבת מיצוי חומצות גרעין, טיהור, שעתוק הפוך והגברה לשבב יחיד ליצירת שני לוחות, מחלקים כתשעה גרם של כדורי XN X באופן שווה במרכז לוחית מתכת, מניחים על מכבש מחומם של 198 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הפעל לחץ לאט על 2, 500 PSI למשך חמש דקות נוספות. כעת, מקם רובד אחד על תבנית האפוקסי מחמם מראש ב-157 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והפעל לחץ לאט עד 1000 PSI למשך 10 דקות נוספות.

לאחר מכן, ללבוש כפפות תרמיות, הסר את הלוח והעובש מהמכבש החם, ולאחר מכן הסר את הלוח מהתבנית לפני שהוא מתקרר. קדחו שלושה חורים בשבב המובלט, אחד כל אחד בכניסה, ביציאת הפסולת וביציאת התעלה המיקרופלואידית. לאחר מכן שטפו את הצ'יפס עם IPA ואחריו RNA משם והמים של דיאנה.

יבש את הצ'יפס באוויר כדי לחבר את הצ'יפס תחילה מחממים מראש ב-131 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן לוחצים על 350 PSI למשך 10 דקות נוספות. באמצעות JB Weld Epoxy, חבר יציאות ננו בפסולת הכניסה ויציאות היציאה נרפאות בנפרד למשך 15 עד 24 שעות. לפי הוראות היצרן, שטפו את תעלת ה-SPE עם 50 מיקרוליטר RNA משם ואחריה 100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.

כעת טען את תעלת ה- SPE בארבעה מיקרוליטרים של תמיסת השתלה טרייה שהוכנה כדי להצליב את הדגירה של המתאקרילט למשך 10 דקות בתנור UV, הסר את תמיסת ההשתלה הנותרת בוואקום. שברו את כדור המיקרוספרה המיובש על ידי הקשה על הצינור כשהמכסה סגור. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת עמוד SPE מוכנה טרייה ומערבולת לערבוב.

טען ארבעה מיקרוליטר של תמיסת SPE לאותו קישור צולב ערוץ על ידי קרינת UV למשך 2.5 דקות מכל צד, וכתוצאה מכך עמוד SPE מפולימר לבן אטום. שטפו את התעלה עם 500 מיקרוליטר של 100% מתנול כדי לשטוף עודפי מגיבים וממיסים פירוגניים תוך פולימריים. חבר שני תנורי סרט דק לתחתית השבב בעזרת סרט מוליך תרמית.

שימו לב שצריך ליישר את דפנות המחממים עם קצה התעלות הרחבות למשך הזמן של דנה ולכרוע בנפרד, הנח חמישה צמדים תרמיים לתוך השבב דרך תעלות הצד הפתוחות ללא מוצא של כל סרט שבב. כדי לתקן את מיקום הצמדים התרמיים, הוסף ארבעה מיקרוליטר של 25 XRNA מאובטח ל-96 מיקרוליטר של 70% אתנול בצינור אחד, ול-100% אתנול בצינור שני. כמו כן, הכינו 300 מיקרוליטר של מאגר תעלות ו-316 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

מחממים את התמיסות בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי להפעיל את ה-RNA מאובטח, ואז לאזן את התעלה המיקרופלואידית. הפעל את מאגר הערוץ דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מיליליטר לשעה.

עכשיו דגימת בדיקת פאבה מהירה ב-VTM ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את הדגימה ברגע שהיא מופשרת. צנטריפוגה את הדגימה ב-13,000 סל"ד למשך 10 דקות.

העבירו 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט לתוך 300 מיקרוליטר של מאגר הליזיס, והוסיפו שישה מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד לנשא מיקרוליטר, מערבולת RNA לערבוב. לאחר מכן סובב במשך חמש שניות וטען את כל הליזאט למנעול פיתוי מזרק CC אחד. העבירו את הליזאט דרך תעלת SPE בקצב זרימה של 0.8 מיליליטר לשעה.

לאחר מכן שטפו את תעלת ה-SPE עם 100 מיקרוליטר של 70% אתנול, ואחריו 100 מיקרוליטר של 100% אתנול במיליליטר אחד לשעה. מקם מזרק ריק בסימן 0.5 מיליליטר ודחף אוויר דרך התעלה כדי לייבש אותו במיליליטר אחד לשעה. כעת העבירו 67.5 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז דרך התעלה כדי לחסל את חומצות הגרעין הקשורות במהירות של 0.5 מיליליטר לשעה ולאסוף 13.5 מיקרוליטר מיציאת הננו ביציאת הפסולת.

טען 36.5 מיקרוליטר של מאסטר R-T-P-C-R. מערבבים פנימה את יציאת הננו ביציאת הפסולת ומערבבים עם תבנית RNA לתגובת R-T-P-C-R של 50 מיקרוליטר. לאחר מכן טען את תערובת R-T-P-C-R לתוך תעלת RT על ידי ואקום עדין.

אטום את יציאת הננו עם אביזר סגור. החל 35 וולט על מחמם אחד. שמור את הריאגנטים בתעלת RT למשך 30 דקות לאחר שהמחמם מתאזן ב-50 מעלות צלזיוס.

שמור את הריאגנטים בתעלת RT למשך 15 דקות לאחר שהמחמם מתאזן ב-95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החל 27 וולט על מחמם אחד ו-50 וולט על מחמם, שניים כדי לאזן את המחמם, אחד ב-60 מעלות צלזיוס ומחמם שניים ב-95 מעלות צלזיוס. דחוף את הריאגנטים לתוך תעלת ה-PCR במהירות של 0.5 מיקרוליטר לדקה.

כ-20 דקות לאחר מכן, כאשר הריאגנטים התקרבו לקצה תעלת הסרפנטין, אספו את מוצרי ה-PCR ביציאה באמצעות פיפטר וקצה בגודל מתאים לבדיקת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent. הוצא את ערכת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent מהמקרר 30 דקות לפני הבדיקה. הפעל את הביו-אנלייזר ופתח את 2, 100 תוכנות המומחים.

טען מיקרוליטר אחד של מוצרי ה-PCR לבדיקה ופעל לפי פרוטוקול Agilent. ניתוח והקלטת הנתונים בזרימת עבודה זו. דגימת הלוע של האף של המטופל מעורבבת עם מאגר ליזה ומורחת על השבב.

השבב מופעל ותוצרי ה-PCR של נגיף השפעת הם אדומים באמצעות שבב אלקטרופורזה נימי מסחרי. בשל הכמויות השונות של נגיף השפעת בדגימה של כל מטופל, הריכוז הסופי של תוצר ה-PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה להיות בעלת רעש נמוך כדי לנקות שיאי סולם ב-35 ו-10, 380 זוג בסיסים ושיא מוצר בודד בגודל המוצר המתוכנן של 107 זוג בסיס עבור המדגם החיובי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לייצר ולהפעיל את שבב המיקרו נוזל כדי לזהות שפעת נגיף.