ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת
26 במרץ 2013
שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נגיף שפעת A באמצעות שבב מיקרופלואידי. ראשית, מעבירים את הדגימה עם בופר ליזיס דרך תעלת ה-SPE כדי לבצע ליזיס לנגיף ולחלץ RNA; טוענים את ריאגנט ה-R-T-P-C-R עם ה-RNA שחולץ ומפעילים את תעלת השעתוק ההפוך כדי להמיר את ה-RNA הנגיפי ל-CDNA. לאחר מכן, מעבירים את התערובת לתעלת ה-PCR כדי להגביר את ה-DNA; התוצאות המתקבלות מראות את הגודל והריכוז של האמפליקון על בסיס אות הפלואורסצנציה מאלקטרופורזה קפילרית.
היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מקבלת את דגימת המטופל הגולמית ומשלבת מיצוי חומצות גרעין, טיהור, שעתוק הפוך והגברה בשבב אחד. כדי ליצור שתי פלטות, פזרו כ-9 g של כדורי XN X באופן שווה במרכז פלטת מתכת, והניחו במכבש מחומם ל-198 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הפילו לחץ באיטיות עד ל-2,500 PSI למשך חמש דקות נוספות. כעת, מקמו פלטה אחת על תבנית אפוקסי שחוממה מראש ל-157 °C למשך 10 דקות, והפילו לחץ באיטיות עד ל-1000 PSI למשך 10 דקות נוספות.
בשלב הבא, בעזרת כפפות תרמיות, הוצא את הלוח והתבנית מהמכבש החם, ולאחר מכן הוצא את הלוח מהתבנית לפני שיתקרר. קדח שלושה חורים בשבב המבוצע, אחד בכל אחד מהם: בכניסה, בפתח הניקוז ובמוצא של תעלת המיקרופלואידקה. לאחר מכן, שטוף את השבבים ב-IPA, ולאחר מכן ב-RNAs away ובמי-דה-יונזים.
ייבשו את השבבים באמצעות אוויר; כדי להדביק את השבבים, חממו תחילה בטמפרטורה של 131 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הפעילו לחץ של 350 PSI למשך 10 דקות נוספות. בעזרת דבק אפוקסי מסוג JB Weld, חברו ננו-פורטים בנפרד בפתחי הכניסה, הפסולת והיציאה, והמתינו לייבוש (cure) למשך 15 עד 24 שעות. בהתאם להוראות היצרן, שטפו את תעלת ה-SPE באמצעות 50 µL של RNAway, ולאחריו 100 µL של מים נקיים מנוקלאז.
כעת טענו את תעלול ה-SPE עם 4 µL של תמיסת השתלה (grafting solution) שהוכנה טרי, כדי ליצור קשירה צולבת של המטקרילאט; הדגרירו למשך 10 דקות בתנור UV והסירו את שאריות תמיסת ההשתלה באמצעות ואקום. פצלו את משקע המיקרוספירות היבש על ידי נקישה על המבחנה כאשר המכסה סגור. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת עמודת SPE שהוכנה טרי וערבבו באמצעות וורטקס.
טען ארבעה µL של תמיסת ה-SPE לאותו תעלה, בצע קישור צולב באמצעות הקרנת UV למשך 2.5 דקות מכל צד, עד לקבלת עמוד SPE פולימרי לבן ואטום. שטוף את התעלה עם 500 µL של 100% methanol כדי לשטוף שאריות של מגיבים ומסממנים פירוגניים בתוך הפולימר. הצמד שני מחממי שכבה דקה לתחתית השבב באמצעות סרט דביק בעל מוליכות תרמית.
שימו לב כי יש ליישר את דפנות המחממים עם קצה התעלות הרחבות למשך הזמן הדרוש; בנפרד, הכניסו חמישה תרמוקפלים לשבב דרך תעלות הצד הפתוחות והחסומות של כל סרט שבב. כדי לקבע את מיקום התרמוקפלים, הוסיפו 4 µL של 25 XRNA secure ל-96 µL של 70% ethanol במבחנה אחת, ול-100% ethanol במבחנה שנייה. כמו כן, הכינו 300 µL של channel buffer ו-316 µL של lysis buffer.
חממו את התמיסות בטמפרטורה של 60 °C למשך 15 דקות, כדי להפעיל את ה-RNA secure ולאחר מכן כדי להגיע לשיווי משקל בערוץ המיקרופלואידי. העבירו את בופר הערוץ דרך ערוץ ה-SPE בקצב זרימה של 0.8 ml/h.
כעת, דגימה לבדיקת fava מהירה ב-VTM בטמפרטורה של 37 °C. הוצא את הדגימה ברגע שהיא מפשירה. סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך 10 דקות.
העבר 100 µL מהעליון ל-300 µL של תמיסת ליזיס, והוסף 6 µL של RNA carrier בריכוז של 1 µg/µL, וערבב באמצעות וורטקס. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה למשך חמש שניות וטען את כל הליזאט למזרק Luer-lock בנפח של 1 CC. העבר את הליזאט דרך תעלת ה-SPE בקצב זרימה של 0.8 mL/h.
לאחר מכן, שטפו את תעלת ה-SPE עם 100 µL של 70% ethanol, ולאחריהם 100 µL של 100% ethanol בקצב של 1 mL לשעה. מיקמו מזרק ריק בסימון של 0.5 mL ודחפו אוויר דרך התעלה כדי לייבש אותה בקצב של 1 mL לשעה. כעת, העבירו 67.5 µL של nuclease free water דרך התעלה כדי לאלואט את החומצות הגרעיניות הקשורות בקצב של 0.5 mL לשעה, ואספו 13.5 µL מה-nano port בפתח הניקוז (waste port).
טען 36.5 µL של תערובת ה-R-T-P-C-R. ערבב בננו-פורט (nano port) בפתח הפסולת וערוב עם תבנית ה-RNA לתגובת R-T-P-C-R בנפח של 50 µL. לאחר מכן, טען את תערובת ה-R-T-P-C-R לערוץ ה-RT באמצעות ואקום עדין.
אטמו את הננו-פורט (nano port) באמצעות מחבר סגור. הגבילו 35 וולט למחמם הראשון. השאירו את הריאגנטים בערוץ ה-RT למשך 30 דקות לאחר שהמחמם הראשון הגיע לשיווי משקל ב-50 °C.
השאירו את הריאגנטים בערוץ ה-RT למשך 15 דקות לאחר שהמחמם הראשון הגיע לשיווי משקל ב-95 degrees Celsius. לאחר מכן, הפעילו 27 וולט על המחמם הראשון ו-50 וולט על המחמם השני כדי להביא את המחמם הראשון לשיווי משקל ב-60 degrees Celsius ואת המחמם השני ל-95 degrees Celsius. דחפו את הריאגנטים אל ערוץ ה-PCR בקצב של 0.5 microliters לדקה.
כ-20 דקות מאוחר יותר, כאשר הריאגנטים מתקרבים לסוף התעלה המפותלת, אספו את תוצרי ה-PCR בפתח היציאה באמצעות פיפט וטיפ במידה מתאימה עבור בדיקת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent. הוציאו את ערכת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent מהמקרר 30 דקות לפני הבדיקה. הדליקו את ה-bioanalyzer ופתחו את תוכנת ה-2, 100 expert.
טען מיקרוליטר אחד של תוצרי ה-PCR לבדיקה ופעל לפי הפרוטוקול של Agilent. נתח ורשום את הנתונים בתהליך עבודה זה. דגימת הנזל מההיפופרינקס של המטופל מעורבבת עם באפר ליזיס ומיושמת על השבב.
השבב מופעל ותוצרי ה-PCR של נגיף השפעת נקראים באמצעות שבב אלקטרופורזה קפילרית מסחרי. בשל הכמויות השונות של נגיף השפעת בדגימה של כל מטופל, הריכוז הסופי של תוצרי ה-PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה להציג רעש נמוך עם פסגות סולם ברורות ב-35 ו-10, 380 base pair, ופסגת תוצר בודדת בגודל התוצר המתוכנן של 107 base pair עבור הדגימה החיובית.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי אופן הייצור וההפעלה של שבב מיקרו-פלואידי לזיהוי נגיף השפעת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שבב תרמופלסטי מיקרופלואידי משולב שנועד לאבחון מולקולרי, ובפרט לזיהוי נגיף השפעת A. השבב מאפשר מיצוי חומצות גרעין, שעתוק הפוך והגברה באמצעות PCR בתהליך יעיל וממשיך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרופלואידיקה
- דיאגנוסטיקה מולקולרית
- וירוסולוגיה
רקע
- התקנים מיקרופלואידיים הם בעלי פוטנציאל לחולל מהפכה בתהליכים דיאגנוסטיים.
- מיצוי והגברה יעילים של חומצות גרעיניות הם קריטיים לזיהוי נגיפי מדויק.
- שילוב של מספר שלבים בשבב אחד משפר את השמישות ומפחית סיכונים לזיהום.
- טכנולוגיה זו מאפשרת שימוש בדגימות גולמיות של מטופלים, ובכך מפשטת את זרימת העבודה.
מטרת המחקר
- פיתוח שבב מיקרופלואידי המשלב מיצוי חומצות גרעין, טיהור, שעתוק הפוך והגברה.
- הדגמת יעילות השבב בזיהוי נגיף השפעת A.
- אספקת מתודולוגיה מפורטת לייצור והפעלת השבב.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ליזיס של הדגימה באמצעות בופר לחילוץ RNA מהנגיף.
- הטענת ריאגנטים של PCR עם שעתוק הפוך (R-T-P-C-R) יחד עם ה-RNA שחולץ.
- הפעלה של ערוץ השעתוק ההפוך להמרת ה-RNA הנגיפי ל-cDNA.
- הגברה של ה-DNA בערוץ ה-PCR וניתוח התוצאות באמצעות אלקטרופורזה קפילרית.
תוצאות עיקריות
- השבב מזהה בהצלחה נגיפי influenza A מדגימות גולמיות של מטופלים.
- התוצאות מעידות על הגודל והריכוז של האמפליקון על בסיס אותות פלואורסצנציה.
- הגישה האינטגרטיבית מפחיתה את הצורך במספר הליכים נפרדים.
- ניתוח פלואורסצנציה מאשש את יעילות תהליך ההגברה.
מסקנות
- השבב המיקרופלואידי מהווה התקדמות משמעותית באבחון מולקולרי.
- הוא מייעל את תהליך הגילוי של נגיף influenza A.
- טכנולוגיה זו עשויה להיות מותאמת עבור פתוגנים ויראליים אחרים בעתיד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דיאגנוסטיקה מיקרופלואידית משולבת מייעלת את הגילוי של מחלות זיהומיות על ידי איחוד של מיצוי חומצות גרעין, הגברה וניתוח בפלטפורמה אחת. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי ואת היעילות התפעולית בממשק הקריטי שבין קבלת הדגימה לקריאה מולקולרית. הטכנולוגיה תומכת בפריסה מהירה וניתנת להרחבה לצורך מעקב אחר פתוגנים בכל רחבי הפורטפוליו ותיקוף יעדים בשלב מוקדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של דגימות קליניות לאיתור נוכחות של פתוגנים וחתימות של חומצות גרעין.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שילוב של ליזיס, טהרה והגברה במערכת סגורה.
- מקל על בדיקה מהירה של היפותזות עבור יעדים של מחלות זיהומיות תוך שימוש בחומרים המופקים מחולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין דגימות חומצות גרעין מאומתות עבור בדיקות מולקולריות וזרימות עבודה של סריקה בהמשך התהליך.
- מבצע סטנדרטיזציה של עיבוד הדגימות לשיפור השחזוריות ועקביות הפלט הכמותי.
- מאפשר פיתוח בדיקות בתפוקה גבוהה על ידי הפחתת התערבות ידנית וסיכון לזיהום.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטי אבחון לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים עבור תוכניות למחלות זיהומיות.
- מספקת רצף החל מרכישת דגימות קליניות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים מולקולריים כמותיים ואמינים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
פלטפורמה מיקרופלואידית זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר תרגומי (translational research) על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח כמותי וישיר של חומצות גרעין ויראליות מדגימות חולים.
- ביולוגיה של גילוי: משלבת זיהוי פתוגנים מונחה-השערה עם הפחתת סיכונים מכניסטית במסגרת זרימת עבודה אחת.
- סריקה: מספקת תוצרי חומצות גרעין כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות המבוססות על אלקטרופורזה קפילרית עבור מדידת ריכוז וגודל מדויק של האמפליקון.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמת תוצרי האבחון לדרישות של סמנים ביולוגיים קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לפתוגנים חדשים באמצעות שינוי תכנון الريאגנטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות בתהליכי זיהוי פתוגנים.
- ערך תפעולי: מייעל את תהליכי ה-sample-to-answer, וממזער את זמן העבודה הידנית ואת הסיכון לשגיאות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות go/no-go עבור תוכניות למחלות זיהומיות ותומך בפריסה ניתנת להרחבה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון של מועמדים לאבחון ולטיפול עבור פתוגנים מרובים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מיקרופלואידי ובאופטימיזציה של בדיקות מולקולריות.
- נדרשת גישה למערכות בקרה תרמית, משאבות מזרקים ומכשור לאלקטרופורזה קפילרית.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים עבור הכנת השבבים והפרוטוקולים האנליטיים.
- ההתאמה לנתיב פתוגנים חדשים תלויה בתכנון מחדש ובתיקוף של ריאגנטים.
- התפוקה והיכולת להרחבה (scalability) מושפעות מייצור השבבים ומהאינטגרציה של רכיבים היקפיים.
