Name: ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: למד שבב microfluidic משולב לגילוי שפעת A באמצעות חילוץ חומצות גרעין, תמסור לאחור ואמפליפיקציית PCR בזרימה אחת. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר מדגימות חולים גולמיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01 EB008268.

1. ייצור שבבים 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את שני לוחות מכדורי Zeonex 690R: להפיץ 8-9 כדורי Zeonex גרם באופן שווה במרכז לוחית מתכת, מחממים על העיתונות המחוממת בעמ &#39;198 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט ל2,500 psi למשך 5 דקות נוספות. כדי להשלים שלב זה, השתמש עיתונות חמה קארבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלטת microfluidic הערוץ בשלט עם עובש אפוקסי. פרטים על ייצור העובש מתוארים במקום אחר 12 (עיצוב ערוץ באיור 2b): לשים שלט אחד על עובש אפוקסי; מחמם אותם בעיתונות המחוממת ב157 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט לpsi 1000 למשך 10 דקות נוספות . הסרת הפלאק מהעובש ביד או באמצעות מלקחיים לפני שהיא מתקררת. (שים לב: ללבוש כפפות תרמיות בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים בשבב הבולט בכניסה, יציאת פסולת, והיציאה של ערוץ microfluidic. אנחנו השתמשנו בקוטר 1.25 מ&quot;מeter מקדח להפוך את השלושה חורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ונד שבב המובלט עם שלט אחר (על גבי): לשטוף את השבבים עם IPA, RNAse הרחק ובמי deionized ברצף; אוויר יבש ומחמם אותם בעיתונות המחוממת ב131 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן קש על 350 psi לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף Nanoports בכניסה, הפסולת, ואת היציאות לשקע בנפרד באמצעות JB הוולד אפוקסי; לרפא במשך 15 עד 24 שעות לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ערוץ SPE עם 50 RNAse חוץ μl, אחריו עם מי nuclease חופשיים μl 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערוץ SPE עם 4 μl של פתרון ההשתלה (methacrylate תיל עם 3% w / v benzophenone) ולאחר מכן Crosslink methacrylate ידי דוגר למשך 10 דקות בתנור UV תחת אורך גל 365 nm UV ו2000 mJ / 2 סנטימטר. הסר את פתרון השתלת שיירים עם ואקום. אנחנו נצלנו את חלל הריק הקיר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פתרון טרי צריך להיות בשימוש. זה בדרך כלל מקובל, עם זאת, כדי לאחסןפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון SPE העמודה (כל% v / v): 16% dimethacrylate אתילן, 24% methacrylate וטיל, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, ולהוסיף 1% -2 dimethylamino-4-(מתיל phenylamino)-פנול כצילום יוזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את אותו הנפח של תמיסת microspheres סיליקה כפתרון עמודת SPE (כדי להפוך תערובת ביחס 1:1), ולייבש אותו לחלוטין ב 70 מעלות צלזיוס למשך לילה בתנור ואקום. לשבור את הכדור על ידי קשה על הצינור עם המכסה הסגור. הוסף פתרון עמודת SPE לתוך הצינור המיובש סיליקה microsphere והמערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 4 μl של פתרון SPE לאותו ערוץ ולאחר מכן Crosslink זה על ידי הקרנת UV במשך 2.5 דקות. ואז, להפוך את השבב מעל ולהקרין תמורת 2.5 דקות נוספות. טור SPE polymerized צריך להיות מוצק לבנה אטומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הערוץ עם 500 μl של מתנול 100% לשטוף מעל מגיבים עודפים. לשטוף זה גם מסיר תוך פולימר פוממסי rogenic, ובכך ליצור מבנה הנקבובי הפתוח של עמודת SPE כאשר התייבשו בתנאי הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שני תנורים, סרט דק לחלק התחתון של השבב עם קלטת מוליכי תרמית. את הצדדים של תנורי החימום צריכים להיות מיושרים עם הקצה של הערוצים הרחבים לdenaturation וחישול בנפרד (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 צמדים תרמיים מקום לשבב דרך מת הסתיימו ערוצי צד פתוחים של כל שבב (ראה איור 2b). את הצמדים התרמיים להישאר בערוצים אלה באמצעות התאמת עיתונות. קלטת שמשה כדי לתקן את המיקום של צמדים תרמיים נוסף. </li></ol> 2. שיטת חילוץ שלב מוצקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 96 μl של אתנול 70% במים DEPC שטופל וautoclaved (deionized או Millipore בפילטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 μl הוסף של רנ&quot;א 25X Secure עד 96 μl של אתנול 70% בצינור אחד, ולשכפל את אותה תערובת עם אתנול 100% בצינור נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300μl של חיץ ערוץ על ידי ערבוב הבא: 75 μl של thiocyanate ז 6 guanidine (GuSCN), 150 μl של 2-propanol, 63 μl מים חופשיים nuclease, ו12 μl של רנ&quot;א Secure 25X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 312 μl של חיץ תמוגה ידי ערבוב: 100 μl של 6 מ&#39;GuSCN, 200 μl של 2-propanol, ו12 RNA 25X μl המאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם אתנול 70%, 100% אתנול, חיץ ערוץ ומאגרי תמוגה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות כדי להפעיל RNA המאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאזן את ערוץ microfluidic, הפעל את חיץ הערוץ דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהיר להפשיר מדגם הבדיקה בVTM על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, והסר את המדגם באופן מיידי מאמבט מים ברגע שהוא מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 13000 סל&quot;ד למשך 10 דקות, ולהעביר 100 μl של supernatant לתוך 300 μl של חיץ תמוגה. השלם את התערובת על ידי הוספת 6 μl של מיקרוגרם 1 / רנ&quot;א המוביל μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לערבב, ואחרי סיבוב כבר5 שניות, טענו כל lysate לתוך מזרק סמ&quot;ק luer-Lok 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל lysate דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ערוץ SPE עם 100 μl של אתנול 70%, ואחריו אתנול 100% μl of100 ב1 מ&quot;ל / שעה. (יש נפח מת μl 50 שבקצה המזרק שלא ידחק אותי החוצה, ולכן למעשה רק 50 μl עובר ערוץ.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם מזרק ריק בסימן 0.5 המ&quot;ל ולדחוף אוויר דרך הערוץ כדי לייבש אותו ב1 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 67.5 μl מי nuclease חינם דרך הערוץ לelute את חומצות גרעין הקשורות ברמה של 0.5 מ&quot;ל / שעה, ולאסוף μl 13.5 מnanoport בנמל הפסולת. (איבוד הנוזלים בשל הנפח המת μl 54 שבקצה המזרק וערוץ SPE). </li></ol> 3. RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 36.5 μl של מיקס מאסטר RT-PCR במהלך השלב היבש האוויר (2.12) תוך שימוש בחומרים הכימיים בתוך ערכות OneStep Qiagen RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען RT-PCR מגיב בnanoport בנמל הפסולת, ולערבב עם רנ&quot;א כדי לקבל את התגובה הבאה 50 μl RT-PCR: 13.5 רנ&quot;א eluted μl במי nuclease חופשיים, 4 תמהיל האנזים μl RT-PCR, פתרון ש 10 μl, 10 μl1X 1 חיץ צעד, 2 25 מ&quot;מ μl MgCl 2, 1 פריימר 5&#39;-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 &#39;50 מיקרומטר μl קדימה, 1 מיקרומטר פריימר μl 50 הפוך 5&#39;-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;, DNTP 2 μl, 1.0% μl 0.75 w / v BSA, 0.73 μl PEG8000 ומי nuclease חופשיים μl 5.02. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת RT-PCR לתוך ערוץ RT ידי ואקום עדין (השתמשנו בואקום הקיר) ולאטום Nanoport עם הולם סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 35 V לדוד 1. שמור את ריאגנטים בערוץ RT למשך 30 דקות לאחר החימום 1 equilibrates ב 50 ° C. שמור את ריאגנטים בערוץ RT במשך 15 דקות לאחר ש1 equilibrates הדוד ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 27 V לתנור 1 ו 50 V לדוד 2, להמתין כשלוש דקות או עד 1 equilibrates דוד בגיל 60 ודהז; C ומחמם 2 equilibrates ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף את ריאגנטים לערוץ ה-PCR על 0.5 μl / דקה. זה אמור לקחת 20 דקות לריאגנטים לזרום דרך התעלה המפותלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמדגם הופך אותו לסוף הערוץ המתפתל, לאסוף את מוצרי ה-PCR בשקע באמצעות pipettor וקצה בגודל המתאים. </li></ol> 4. איתור מוצרי PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים במבחן Agilent רגישות גבוהה DNA כדי לזהות את המוצרים. כדי להפעיל את המבחן הזה מוציא את ערכת DNA רגישות הגבוהה Agilent ממקרר 30 דקות לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Bioanalyzer ולפתוח את תוכנת המומחה 2100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען μl 1 של מוצרי ה-PCR לבדיקות והמעקב Agilent הפרוטוקול <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">(20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ולתעד את הנתונים. </li></ol>

<ol><li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+Influenza%3A+The+Inside+Story%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li>
<li>WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/">http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/</a> (2009).</li>
<li>WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/">http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/</a> (2009).</li>
<li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A%2FH1N1+detection+set%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li>
<li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+the%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+%28H1N1%29+during+the+New+York+City+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li>
<li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A%28H1N1%29+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li>
<li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses%3A+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li>
<li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+MA+%22Transducer%2793%2C+seventh+international+conference+on+solid+state+sensors+and+actuators%22">Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators</a>. , 924-926 (1993).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li>
<li>Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176(2012).</li>
<li>Rådström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes%3A+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li>
<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

החוקרים הכריזו אין אינטרסים כספיים מתחרים.

שיטת האבחון שהוצגה כאן הדגימה את היכולת של שבב microfluidic פלסטיק משולב כדי להגביר שפעת RNA מן דגימות מטופל עם סגוליות גבוהות וגבול גילוי נמוך 13 עצבנו השבב הזה לנקודת פוטנציאל של בדיקות טיפול:. (א) את הטמפרטורה וfluidic השליטה הייתה פשוטה יותר, (ב) את השבב הוא עלות נמוכה ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה באמצעות הזרקה, ו (ג) את השבב הוא חד פעמי ומיועד לשימוש חד פעמי, וכך להקטין את החשש לזיהום צולב דגימה. למ...

מיליוני מקרי מוות דווחו בשלוש מגיפות השפעת של המאה ה -20 1. יתר על כן, מגיפת השפעת האחרונה הוכרזה על ידי ארגון הבריאות העולמית (WHO) 2 בשנת 2009, והחל מיום 1 באוגוסט 2010, 18449 מקרי מוות שדווח על ידי ארגון בריאות עולמית 3. מגיפה זו הוכיחה שוב את הניטל הגבוה של מחלות זיהומיות, ואת הצורך בזיהוי מהיר ומדויק של שפעת כדי לאפשר אישור מהיר מחלה, תגובה לבריאות הציבור מתאימה וטיפול יעיל 4. ישנן מספר שיטות נפוצות לאבחון שפעת, אלה כוללים immunoassays מהיר, בדיקת האנטיגן ניאון ישירה (DFA) ושיטות תרבות ויראליות. immunoassays ראפיד דרמטי חסר רגישות 5-8, בעוד שתי שיטות האחרות הן עתירות עבודה וזמן רבים 9. בדיקות מולקולריות להציע יתרונות רבים, כולל תפנית הזמן sensit קצר, גבוהלקוחים, וסגולי גבוהים יותר. כמה גופים מסחריים כבר עובדים לקראת בדיקות מולקולריות מהירות (הנקרא גם בדיקות או NATS חומצות גרעין) למחל זיהומיות, וכמה יש מבחני שפעת בצינורות שלהם. עם זאת רובם דורשים הכנת מדגם את השבב. אף אחד מתיקוני הרפואה ו( CLIA) ייתרו בדיקות מולקולריות לשלב הכנת מדגם לתוך מחסנית assay או מודול. טכנולוגיית מעבדה על השבב משחקת תפקיד חשוב בפיתוח של מכשירי בדיקת נקודה של טיפול. לאחר המבוא של שבב ה-PCR לראשונה בשנת 1993 10, מאמצים רבים שהושקעו בפיתוח שבבי בדיקת חומצות גרעין. עם זאת, רק מעטים מהם יש הכנת מדגם גולמית משולבת עם הגברה במורד זרם. אנחנו הוכחנו בעבר את המזעור של עמודת מיצוי שלב מוצקה (SPE) לתוך שבב microfluidic פלסטיק 11 ולפתחment ואופטימיזציה של שבב ה-PCR זרימה רציפה 12. כאן, אנו מרחיבים את העבודה הקודמת לשלב SPE בצעדי PCR RT ולתוך שבב יחיד לאבחון קליני ולהפגין את יכולתה להגביר חומצות גרעין ממטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> 1-dodecanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 196118-50 </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2-Propanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 19516 </td></tr><tr><td> Benzophenone </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 239852-50 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> methacrylate וטיל </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 235865-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> רנ&quot;א Carrier </td&gt; <td> Qiagen, ולנסיה, קליפורניה </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> Cyclohexanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> dimethacrylate אתילן </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> dimethacrylate אתילן גליקול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 335681-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 250 μl מזרק הזכוכית </td><td> המילטון, רינו, NV </td><td> 81127 </td></tr><tr><td> thiocyanate guanidine </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 50981 </td></tr><tr><td> ערכת ה-DNA רגישות גבוהה </td><td> Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> עיתונות חמה </td><td> קארבר, Wabash, IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB epoxies הוולד </td><td> מקמאסטר-CaRR, Elmhurst, IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> מזרקי luer-Lok </td><td> BD-רפואי, פרנקלין אגמים, ניו ג&#39;רזי </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> methacrylate תיל </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td> אפצ&#39;רץ&#39; מדעי </td><td> N-333-01 </td></tr><tr><td> Nanoport התאמה </td><td> אפצ&#39;רץ&#39; מדעי </td><td> ה-F-120x </td></tr><tr><td> מי nuclease חופשיים </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR ערכה </td><td> Qiagen, ולנסיה, קליפורניה </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td> אספקת חשמל </td><td> VWR, רנדור, הרשות פלסטינית </td><td> 300V </td></tr><tr><td> RNAse חוץ </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 83931-250 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> אפלייד Biosystems, הפוסטר סיטי, קליפורניה </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> סיליקה microspheres </td><td> Polysciences, ורינגטון, הרשות פלסטינית </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> משאבת מזרק </td><td> הרווארד Apparatus, Holliston, MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> קלטת מוליכי תרמית </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> צמד תרמי </td><td> אומגת הנדסה, סטמפורד, קונטיקט </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> מחממי סרט דק </td><td> Minco, מיניאפוליס, מינסוטה </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> Crosslinker אולטרה סגול </td><td> UPV, Upland, קליפורניה </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;td&gt; Zeon כימיקלים, Louisville, KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

אבחון מהיר ויעיל, לשחק תפקיד חשוב בשליטה על מחלה זיהומית ומאפשר ניהול יעיל מטופל וטיפול. כאן, אנו מציגים שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב עם היכולת להגביר שפעת וירוס במטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates. בעקבות טעינת מדגם המטופלים, מכשיר microfluidic רצף מבצע תמוגה על שבב תא, טיהור רנ&quot;א וצעדים בתוך ריכוז המיצוי המוצק השלב (SPE), שעתוק לאחור (RT) ותגובת שרשרת פולימרז (PCR) בRT-PCR תאים, בהתאמה. איתור נקודת סיום מתבצע באמצעות Bioanalyzer את השבב (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה). עבור ציוד היקפי, השתמש משאבת מזרק יחידה לנהוג מגיבים ודגימות, בעוד שני תנורי סרט דקים שמשו את המקורות החומים לRT-PCR והתאים. השבב נועד להיות שכבה אחת ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה, כדי לצמצם את fabricatiעל זמן ועלות. שבב microfluidic מספק פלטפורמה לניתוח מגוון רחב של וירוסים וחיידקים, מוגבלים רק על ידי שינויים בעיצוב מגיב הדרושים כדי לזהות פתוגנים עניין חדשים.

<html> תוצאה טיפוסית מוצגת באיור 3 לשפעת דגימת שטיפת אף ולוע נגועה. בשל כמויות השונות של נגיף שפעת בכל דגימת מטופל, הריכוז הסופי של מוצר PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה רעש נמוך, שני שיאי סולם ברורים (35 ו10380 נ&quot;ב) ושיא מוצר אחד בגודל המוצר מיועד (107 נ&quot;ב) למדגם החיובי. אמנם שיא המוצר צריך להיות באופן תיאורטי נעדר בקרות שליליות, עשה להתבונן פסגות PCR מזויפות ליד מוקד שפעת הספציפית מהיווצרות פריימר-הדימרים בכמה דוגמאות. פסגות מוצר מרובות משקפות אפשרות של זיהו...

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נגיף שפעת A באמצעות שבב מיקרופלואידי. ראשית, מעבירים את הדגימה עם בופר ליזיס דרך תעלת ה-SPE כדי לבצע ליזיס לנגיף ולחלץ RNA; טוענים את ריאגנט ה-R-T-P-C-R עם ה-RNA שחולץ ומפעילים את תעלת השעתוק ההפוך כדי להמיר את ה-RNA הנגיפי ל-CDNA. לאחר מכן, מעבירים את התערובת לתעלת ה-PCR כדי להגביר את ה-DNA; התוצאות המתקבלות מראות את הגודל והריכוז של האמפליקון על בסיס אות הפלואורסצנציה מאלקטרופורזה קפילרית.היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מקבלת את דגימת המטופל הגולמית ומשלבת מיצוי חומצות גרעין, טיהור, שעתוק הפוך והגברה בשבב אחד. כדי ליצור שתי פלטות, פזרו כ-9 g של כדורי XN X באופן שווה במרכז פלטת מתכת, והניחו במכבש מחומם ל-198 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הפילו לחץ באיטיות עד ל-2,500 PSI למשך חמש דקות נוספות. כעת, מקמו פלטה אחת על תבנית אפוקסי שחוממה מראש ל-157 °C למשך 10 דקות, והפילו לחץ באיטיות עד ל-1000 PSI למשך 10 דקות נוספות.בשלב הבא, בעזרת כפפות תרמיות, הוצא את הלוח והתבנית מהמכבש החם, ולאחר מכן הוצא את הלוח מהתבנית לפני שיתקרר. קדח שלושה חורים בשבב המבוצע, אחד בכל אחד מהם: בכניסה, בפתח הניקוז ובמוצא של תעלת המיקרופלואידקה. לאחר מכן, שטוף את השבבים ב-IPA, ולאחר מכן ב-RNAs away ובמי-דה-יונזים.ייבשו את השבבים באמצעות אוויר; כדי להדביק את השבבים, חממו תחילה בטמפרטורה של 131 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הפעילו לחץ של 350 PSI למשך 10 דקות נוספות. בעזרת דבק אפוקסי מסוג JB Weld, חברו ננו-פורטים בנפרד בפתחי הכניסה, הפסולת והיציאה, והמתינו לייבוש (cure) למשך 15 עד 24 שעות. בהתאם להוראות היצרן, שטפו את תעלת ה-SPE באמצעות 50 µL של RNAway, ולאחריו 100 µL של מים נקיים מנוקלאז.כעת טענו את תעלול ה-SPE עם 4 µL של תמיסת השתלה (grafting solution) שהוכנה טרי, כדי ליצור קשירה צולבת של המטקרילאט; הדגרירו למשך 10 דקות בתנור UV והסירו את שאריות תמיסת ההשתלה באמצעות ואקום. פצלו את משקע המיקרוספירות היבש על ידי נקישה על המבחנה כאשר המכסה סגור. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת עמודת SPE שהוכנה טרי וערבבו באמצעות וורטקס.טען ארבעה µL של תמיסת ה-SPE לאותו תעלה, בצע קישור צולב באמצעות הקרנת UV למשך 2.5 דקות מכל צד, עד לקבלת עמוד SPE פולימרי לבן ואטום. שטוף את התעלה עם 500 µL של 100% methanol כדי לשטוף שאריות של מגיבים ומסממנים פירוגניים בתוך הפולימר. הצמד שני מחממי שכבה דקה לתחתית השבב באמצעות סרט דביק בעל מוליכות תרמית.שימו לב כי יש ליישר את דפנות המחממים עם קצה התעלות הרחבות למשך הזמן הדרוש; בנפרד, הכניסו חמישה תרמוקפלים לשבב דרך תעלות הצד הפתוחות והחסומות של כל סרט שבב. כדי לקבע את מיקום התרמוקפלים, הוסיפו 4 µL של 25 XRNA secure ל-96 µL של 70% ethanol במבחנה אחת, ול-100% ethanol במבחנה שנייה. כמו כן, הכינו 300 µL של channel buffer ו-316 µL של lysis buffer.חממו את התמיסות בטמפרטורה של 60 °C למשך 15 דקות, כדי להפעיל את ה-RNA secure ולאחר מכן כדי להגיע לשיווי משקל בערוץ המיקרופלואידי. העבירו את בופר הערוץ דרך ערוץ ה-SPE בקצב זרימה של 0.8 ml/h.כעת, דגימה לבדיקת fava מהירה ב-VTM בטמפרטורה של 37 °C. הוצא את הדגימה ברגע שהיא מפשירה. סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך 10 דקות.העבר 100 µL מהעליון ל-300 µL של תמיסת ליזיס, והוסף 6 µL של RNA carrier בריכוז של 1 µg/µL, וערבב באמצעות וורטקס. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה למשך חמש שניות וטען את כל הליזאט למזרק Luer-lock בנפח של 1 CC. העבר את הליזאט דרך תעלת ה-SPE בקצב זרימה של 0.8 mL/h.לאחר מכן, שטפו את תעלת ה-SPE עם 100 µL של 70% ethanol, ולאחריהם 100 µL של 100% ethanol בקצב של 1 mL לשעה. מיקמו מזרק ריק בסימון של 0.5 mL ודחפו אוויר דרך התעלה כדי לייבש אותה בקצב של 1 mL לשעה. כעת, העבירו 67.5 µL של nuclease free water דרך התעלה כדי לאלואט את החומצות הגרעיניות הקשורות בקצב של 0.5 mL לשעה, ואספו 13.5 µL מה-nano port בפתח הניקוז (waste port).טען 36.5 µL של תערובת ה-R-T-P-C-R. ערבב בננו-פורט (nano port) בפתח הפסולת וערוב עם תבנית ה-RNA לתגובת R-T-P-C-R בנפח של 50 µL. לאחר מכן, טען את תערובת ה-R-T-P-C-R לערוץ ה-RT באמצעות ואקום עדין.אטמו את הננו-פורט (nano port) באמצעות מחבר סגור. הגבילו 35 וולט למחמם הראשון. השאירו את הריאגנטים בערוץ ה-RT למשך 30 דקות לאחר שהמחמם הראשון הגיע לשיווי משקל ב-50 °C.השאירו את הריאגנטים בערוץ ה-RT למשך 15 דקות לאחר שהמחמם הראשון הגיע לשיווי משקל ב-95 degrees Celsius. לאחר מכן, הפעילו 27 וולט על המחמם הראשון ו-50 וולט על המחמם השני כדי להביא את המחמם הראשון לשיווי משקל ב-60 degrees Celsius ואת המחמם השני ל-95 degrees Celsius. דחפו את הריאגנטים אל ערוץ ה-PCR בקצב של 0.5 microliters לדקה.כ-20 דקות מאוחר יותר, כאשר הריאגנטים מתקרבים לסוף התעלה המפותלת, אספו את תוצרי ה-PCR בפתח היציאה באמצעות פיפט וטיפ במידה מתאימה עבור בדיקת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent. הוציאו את ערכת ה-DNA ברגישות גבוהה של Agilent מהמקרר 30 דקות לפני הבדיקה. הדליקו את ה-bioanalyzer ופתחו את תוכנת ה-2, 100 expert.טען מיקרוליטר אחד של תוצרי ה-PCR לבדיקה ופעל לפי הפרוטוקול של Agilent. נתח ורשום את הנתונים בתהליך עבודה זה. דגימת הנזל מההיפופרינקס של המטופל מעורבבת עם באפר ליזיס ומיושמת על השבב.השבב מופעל ותוצרי ה-PCR של נגיף השפעת נקראים באמצעות שבב אלקטרופורזה קפילרית מסחרי. בשל הכמויות השונות של נגיף השפעת בדגימה של כל מטופל, הריכוז הסופי של תוצרי ה-PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה להציג רעש נמוך עם פסגות סולם ברורות ב-35 ו-10, 380 base pair, ופסגת תוצר בודדת בגודל התוצר המתוכנן של 107 base pair עבור הדגימה החיובית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי אופן הייצור וההפעלה של שבב מיקרו-פלואידי לזיהוי נגיף השפעת.

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.

יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה

Virochip הוא microarray הפאן ויראלי שנועד לזהות בו זמנית את כל וירוסים ידועים, כמו גם וירוסים רומן על בסיס הומולוגיה ברצף נשמרת. כאן אנו מדגימים איך לנהל assay Virochip לנתח דגימות קליניות עבור נוכחות של וירוסים מוכרים ושאינם מוכרים.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

פלטפורמה ביוסנסור microfluidic תוכנן של מפוברק בטכנולוגיית photoresist הסרט יבש בעלות נמוכה עבור כימות מהיר ורגיש של analytes שונים. מערכת זו לשימוש יחיד מאפשרת מדידה אלקטרוכימי של--צ'יפ-משותק מבחני מקושרים-אנזים באמצעות הטכניקה להפסיק זרימה.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.

מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים

פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

למד שבב microfluidic משולב לגילוי שפעת A באמצעות חילוץ חומצות גרעין, תמסור לאחור ואמפליפיקציית PCR בזרימה אחת. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר מדגימות חולים גולמיות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

גלה סרטונים נוספים