Name: הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: חקור שינויים מורפולוגיים בסיבי עצב תוך-עוריים נויספטיביים בנוירופתיה כואבת באמצעות הדמיה תלת-ממדית בביופסיות עור אנושי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של סיבי עצב לזיהוי שינויים פתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי K08 NS061039-01A2, התכנית לנוירולוגיה מחקר וגילוי, ואלפרד טאובמן מכון המחקר הרפואי א באוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשה במורפולוגיה וניתוח תמונת הליבה של מחקר מישיגן הסוכרת ומרכז הדרכה, שמומן על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5P90 DK-20572 מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות. המחברים מבקשים להודות לרובינסון וסינגלטון גורדון סמית (אוניברסיטת יוטה) לתרומתם הנדיבה של דגימות עור אנושיות כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של טכניקת אימונוהיסטוכימיה הסמן הביולוגי nociceptive.

חלק א &#39;: אימונוהיסטוכימיה הכנה של צלחת 96 היטב ומניעה של ביופסיות עור Punch מכתים רקע נאספות מבני אדם וטופחו במשך 12-24 שעות בפתרון מקבע (paraformaldehyde 2% עם פתרון 0.75 מ &#39;L-ליזין (pH 7.4) ונתרן 0.05 מ&quot;מ periodate) על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל 8. דוגמאות אז cryoprotected בופר פוספט (PBS) עם גליצרול 20% על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1, מוטבע בתקשורת הרכבה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר), ולאחר מכן מחולקת למקטעים עבים 50 מיקרומטר על cryostat. הפרוטוקול המתואר להלן מיועד לחלקי עור 8, את המספר המרבי של חלקי עור אפשר לעבור אימונוהיסטוכימיה החופשית צף באחד 96 גם צלחת. יום 1: 1. מניעת immunoreactivity הלא ספציפי בשכבה הקרנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96 גם צלחת תווית כפי שמוצג באיור 1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של תמונה-IT FX איתותים (Image-IT), יעילות לחסימת מכתים רקע 11,12, לכל אחד גם בשורת 1 של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של 1X PBS היטב לתוך כל אחד בשורת 2 ו -3 של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת שני סעיפים 50 מיקרומטר לכל מטופל: סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בDL, סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בPT. לולאת inoculating (LeLoop) משמשת להעברת חלקים מאחד למשנהו לשטוף כדי למנוע נזק מורפולוגי. בעדינות להעביר כל סעיף 50 מיקרומטר, באמצעות לולאת inoculating, לאדם גם בשורה 1, המכיל תמונה-IT. דגירה סעיפים בתמונה-IT עבור 30 דקות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את חלקי פעמיים עם 1X PBS (שורות 2 ו -3) במשך 10 דקות ב RT. מניחים צלחת גם על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 2. הכנה של 5% פתרון חסימת BSA ו1% פתרון שטיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בתמונה-IT, להכין 5% חסימת solution (5% פתרון BSA, 0.3% TX-100, 0.1 מ &#39;PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון חסימת BSA 5% לבאר כל השורה 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת inoculating, להעביר חלקים לתוך בארות בודדות של פתרון 5% BSA חסימה. דגירה סעיפים בפתרון חסימת BSA 5% עבור 1-2 שעות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> 3. הכנה של 1% פתרון BSA שטיפה ודילול של נוגדנים ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, להכין 1% שטיפת פתרון (BSA 1%, 0.3% פתרון TX-100, 0.1 מ &#39;PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, לדלל נוגדנים עיקריים ב1% שטיפת פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים הראשוניים מורכבים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים של הנוגדנים העיקריים: PGP, 1:500; TRK,1:500 ב1% BSA שטיפת פתרון. </li></ol></li></ol> 4. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדן ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של נוגדנים עיקריים מדוללים לתוך הבארות הייעודיות של 96 גם הצלחת (שורה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים מ5% חסימת פתרון (שורה 4) לתוך בארות הנוגדן הראשוניות הייעודיות (שורה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 96 גם צלחת O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> יום 2: 5. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון שטיפת BSA 1% לכל אחד גם בשורה 6, 7, ו -8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (6 שורות, 7, ו -8) במשך שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 6. דילול של נוגדנים משני &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים מודגרת בשטיפה האחרונה של פתרון שטיפת BSA 1% (שורה 8), לדלל נוגדנים משני בפתרון שטיפת BSA 1%: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים משני בנויים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים של נוגדנים משני: לPGP (אלקסה פלואוריד 488 חמור נגד הארנב, 1:250), לTRK (אלקסה פלואוריד 647 חמורים נגד עיזים, 1:250) בפתרון BSA 1% שטיפה. </li></ol></li></ol> 7. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של נוגדנים משני מדוללים לתוך בארותיהם המיועדות של צלחת 96 היטב (שורה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים מחסימת פתרון 1% BSA (שורה 8) לנוגדנים משני היטב (שורה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים במיועד המשני הנוגדנים O/ N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> 8. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של 1% BSA פתרון שטיפה היטב לתוך כל אחד בשורת 10, 11, ו -12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (10 שורות, 11, ו -12) עבור שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 9. הכנת שקופיות מיקרוסקופ וביופסיות מחולק הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בשטיפה האחרונה של שטיפת פתרון BSA 1% (שורה 12), להכין שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50 μl של פתרון BSA 1% שטיפה בשקופית אחת בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלקים מפתרון שטיפת BSA 1% (שורה 12), ולמקם אותו בירידה של 50 μl פתרון שטיפת BSA 1% בשקופית מיקרוסקופ הייעודי. אחרי אופטימיזציה עמדתו של הסעיף, להסיר פתרון BSA 1% עודף שטיפה עם טפטפת זכוכית כדורית, נקיטת אמצעי זהירותכדי להימנע ממגע הדגימה. </li></ol> הערה: ודא שסעיף אינו מקופל; הדגימה צריכה להיות שטוחה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 טיפה של להאריך antifade זהב הרכבה מגיב עם DAPI ליד הביופסיה בשקופית מיקרוסקופ. קח coverslip זכוכית מיקרוסקופ מ&quot;מ 22x22 ומניח בעדינות אותו על ביופסיה וירידה של להאריך מגיב antifade זהב עם ירידת DAPI. חזור על פעולה עבור כל מקטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות מיקרוסקופ יבשה O / N ב RT בחושך. </li></ol> הערה: הוצא את כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. למחות עודף להאריך מגיב antifade זהב. חלק ב &#39;: ההדמיה Confocal 10. ההדמיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותות הקרינה תמונה באמצעות לייזר 500 FluoView אולימפוס סריקת מיקרוסקופ confocal עם נפט טבילה (1.3 NA) אובייקטיבית וזום שתי פעמים עם תוכנת 5.0 גרסת FluoView 40X. </p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלקסה פלואוריד 488 ו אלקסה פלואוריד 647 לרגש HeNe 543 ננומטר לייזר הירוק והאדום HeNe לייזר 633 ננומטר, בהתאמה. אות אלקסה פלואוריד 488 מיוצגת על ידי מראה ירוק עד שולחן (LUT) ופלואוריד אלקסה 647 על ידי LUT אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פתחי confocal לכל גלאי ב400 מיקרומטר כדי לשפר את האותות. סריקות רציפות צריכים להילקח ברזולוציה של 1,024 x 1,024 למקסם את הפרדת אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תלת ממדי Z-סדרה באמצעות 1.2 מיקרומטר מרווחי z צעד (מבוסס על יחידת הסריקה האופטימלית מחושבת על ידי תוכנת FluoView) עם מיצוע קלמן (שתי מסגרות). </li></ol> חלק ג&#39;: ויזואליזציה ואנימציה תלת ממדיות 11. ויזואליזציה (3D) תלת ממדים ואנימציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי FluoView פתוחים בתוכנת x64 Imaris (גרסה 7.3, Bitplane AG) כדי להמחיש את הסטים של תמונות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם להציג לפי צורך כדי לשפר את הניגודיות של אות מסוימת בעצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור surface לדמיין גבול עורי, אפידרמיס. השתמש בכלי קונטור בתיקו מצב לשרטט את הגבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת משטח שקוף למחצה עד לגבול כדי לראות את אותות הניאון בסיסיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת תמונות סטילס של אותות ניאון 3D כדי ליצור תמונות Snapshot של סרט 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת האנימציה ליצור סרט 3D. את התמונות ניתן לסובב 360 מעלות מספר פעמים כדי להראות לכל אות בנפרד וממוזג (איורים 2, 3 ו -4). הגדר אנימציה כדי ליצור סרטים בהיקף של 200 מסגרות אנימציה ב15 מסגרות לשנייה. שמור כל סרט כקובץ AVI גלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוס את סרט AVI הסופי עם תוכנת VirtualDub (גרסת 1.9.4). </li></ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li>
<li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor%2Fp38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li>
<li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li>
<li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li>
<li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li>
<li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li>
<li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibre+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li>
<li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+among+pain%2C+sensory+loss%2C+and+small+nerve+fibers+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים להכריז.

מדידה של IENFD כבר בשימוש נרחב על מנת לקבוע את מידת נוירופתיה היקפית 13,14. נכון לעכשיו, הפרוטוקול הנפוץ ביותר מודד רק את הצפיפות של סיבי עצב שחודרים את קרום המרתף של האפידרמיס, זה לא לוקח בחשבון הסתעפות ו / או שינויים מורפולוגיים של העצבים axonal. בנוסף, ניתוח IENFD נוכחי לא הוכח, כדי לקשר בין IENFD עם הנוכחות של כאב בPN 15. אנחנו דיווחו בעבר כי מספרים מוגברים של IENFD nociceptive קשורים לה...

נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ עבור רופאים לכמת צפיפות סיבי עצב intraepidermal, (IENFD) מביופסיות אגרוף עור, שניתן להשתמש בם כדי לאבחן neuropathies קטן סיבים 3, 6-8. ביופסיות שנלקחו מהרגל דיסטלי (DL), 10 ס&quot;מ מעל malleolus לרוחב, וירך הפרוקסימלי (PT), 20 ס&quot;מ מתחת לעמוד השדרה הכסל הקדמי 9. כל IENF מסומנים באמצעות מוצר גן חלבון 9.5 (PGP), סמן 10-12 מחבת עצבית. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD נקבע על ידי צביעת PGP עם brightfield מיקרוסקופיה 6. בנוסף, מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקולי Immunofluorescent לPGP אימונוהיסטוכימיה 7-9. נוירופתיה סיבים קטנה היא נפוצה הקשורים כאב נוירופתי. על מנת להבין את תפקידו של IENF החיוני לעיבוד כאב נוסף, פיתחנו טכניקה לIENF הכוללת שיתוף תווית עם סיבים שיוצרים כאב. Nociceptive IENF, במיוחד Aδ וסיבי C, ניתן ללמוד דרך שיתוף התיוג של IENF עם PGP וסמן nociceptive, tropomyosin-קולטן קינאז (TRK) 5. TRK הוא זיקה הגבוהה לקולטן לגורם גדילה עצבי שחיוני להתפתחות של Nociception. את סיבי עצב nociceptive חיובי TRK הם סיבים שpeptidergic המפורש חומר P (SP) וקלציטונין גנים הקשורים פפטיד (CGRP). בעבר, Lauria ועמיתיו ליישם את הטכניקה כפולת התיוג ללמוד PN, IENF PGP חיובי שיתוף תיוג עם סמן nociceptive 10. במחקר הקודם שלנו, הוכיח כי IENF TRK-חיובי, אך לא IENF שלילי TRK, שהוגברו במודל חיה של נוירופתיה סוכרתית כואבת 5. טכניקת שיתוף תיוג זה מספקת את היכולת להשוות כימות של IENFD nociceptive לסך IENFD והיכולת ללמוד שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. היכולת לדמיין IENF nociceptive וcompaמחדש כימות של IENFD המוחלטת לIENFD nociceptive יכולה לספק ראיות אובייקטיביות לקיומו של כאב, ואולי תובנה חומרת כאב קשור PN. טכניקה זו היא גם לעור של מודלים של בעלי חיים. בהשוואה למחקרים קודמים, בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לניתוח תמונת 3D, יצירת ההזדמנות להימנע מטעויות שעלולות להתרחש בניתוח תמונת 2D.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>כדי להרכיב 1X</td></tr><tr><td>PBS Image-IT FX Signal</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gene Product 9.5 (ארנב פוליקלונלי)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyosin Related-Kinase A (עז פוליקלונלית)</td><td>R& D Systems</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור &אלפא ארנב</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 חמור ואלפא;-עז</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 חמור &אלפא</td><td>עז Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 חמור ואלפא;-</td></tr><tr><td>עז אלבומין, מסרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>טריטון X- 100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>לולאה לא מכוילת</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>חיסון לולאה</td></tr><tr><td>96-well צלחת בדיקה</td><td>קורנינג משולבת</td><td>3603</td><td>צלחת</td></tr><tr><td>באר Prolong זהב אנטי-דהייה מגיב עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית 22x22 מ"מ</td><td>פישר מדעי</td><td>12-541-B</td><td>כיסויים</td></tr><tr><td>סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר מדעי</td><td>12-550-15</td><td>מיקרוסקופ שקופיות</td></tr><tr><td>אולימפוס Fluoview סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV500</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>טמפרטורת חיתוך אופטימלית</td><td>סאקורה</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Leica cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Cryostat</td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

ביופסיה של העור משמשת בדרך כלל כדי לכמת את צפיפות סיבי עצב intraepidermal (IENFD) לאבחון של 1,2 פולינאורופתיה ההיקפי. נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ כדי לאסוף 3 מ&quot;מ ביופסיות עור מהרגל דיסטלי (DL) והירך הפרוקסימלי (PT) להערכת polyneuropathies אורך תלויה 3. עם זאת, בשל אופי multidirectional של IENFs, זה מאתגר לבחון חופף מבנים עצביים דרך הניתוח של הדמיה דו ממדית (2D). לחלופין, הדמיה תלת ממדית (3D) יכולה לספק פתרון טוב יותר לדילמה זו. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מציגים שיטות ליישום 3D הדמיה ללמוד נוירופתיה הכואבת (PN). על מנת לזהות IENFs, דגימות עור מעובדות לניתוח immunofluorescent של מוצר חלבון גן 9.5 (PGP), סמן עצבי מחבת. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD להרתיענכרה על ידי אימונוהיסטוכימיה PGP באמצעות מיקרוסקופיה brightfield 4. במחקר הנוכחי, אנחנו מוחלים ניתוח כפול immunofluorescent לזהות IENFD הכולל, באמצעות PGP, וIENF nociceptive, באמצעות השימוש בנוגדנים המזהים tropomyosin קולט-קינאז, זיקה גבוהה לקולטן (TRK) לגורם גדילה עצבי 5. היתרונות של IENF שיתוף מכתים עם PGP וTRK A נוגדני יתרונות המחקר של PN ידי בבירור מכתים סיבי PGP חיוביים, nociceptive. ניתן לכמת אותות ניאון אלה כדי לקבוע שינויי IENFD ומורפולוגי nociceptive של IENF קשורים PN. את תמונות הניאון נרכשות על ידי מיקרוסקופיה confocal ומעובד לניתוח 3D. 3D הדמיה מספקת יכולות סיבוב נוסף כדי לנתח שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. יחדיו, ניאון שיתוף מכתים, ההדמיה confocal, וניתוח 3D באופן ברור לטובת המחקר של PN.

אנחנו מוחלים פרוטוקול הנוכחי כדי ללמוד את המורפולוגיה של IENF בביופסיות עור וPT DL מחולים עם PN. העור, משלושה נושאים, שנאסף באוניברסיטת יוטה להפגין pathomorphology קשור PN. הנושאים כוללים: מקרה 1: גבר בן 51 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 14 חודשים; ניקוד כאב: 51); מקרה 2: גבר בן 56 עם היסטוריה של PN בסוכרת מסוג 2 (משך: 108 חודשים; ניקוד כאב: 47), ומקרה 3: גבר בן 66 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 42 חודשים; ניקוד כאב: 46). היסטוריה ובדיקת נוירולוגית, כולל בדיקות...

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע אימונוהיסטוכימיה על חתכי ביופסיה של עור אנושי כדי לבחון שינויים מורפולוגיים של סיבי עצב תוך-אפידרמליים הקשורים לנוירופתיה כואבת באמצעות הדמיה תלת-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה של חתכים צפים למשך שלושה ימים על חתכי ביופסיה בודדים של עור אנושי. השלב השני הוא הדמיה של חתכי עור בעובי 50 micron באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.בשלב הבא, קובצי תמונות תצוגת הזרימה (flow view) מעובדים באמצעות תוכנת MRS כדי ליצור קובץ סרט בתלת-ממד של תמונות האימונופלואורסצנציה המקוריות. השלב האחרון הוא שימוש בתוכנת vdw או בתוכנה דומה כדי לדחוס את קובץ הסרט. בסופו של דבר, תוצאות דימות בתלת-ממד מאפשרות להלכיד ולחקור שינויים מורפולוגיים הקשורים לנוירופתיה כואבת.נכון לעת זו, צפיפות סיבי עצב אפידרמליים תוך-ניתוחית משמשת כשיטה כמותית לאבחון נוירופתיה. סימון כפול של סיבי עצב תוך-דרמליים אלו עם ביומארקר נוציספטי עשוי לשפוך אור על הכאב הקשור לסיבוך זה. לפרוטוקול הדימיון הדו-ממדי הנוכחי יש מגבלות רבות, כולל חפיפה של סיבי העצב.בניגוד לכך, דימוי תלת-ממדי מאפשר ניתוח מעמיק יותר של שינויים מורפולוגיים הקשורים לנוירופתיה, כגון נפיחות והחיוורות של האקסונים, וכן מדידה של נפח האקסונים. חשוב לציין כי יש לנקוט בצעדים להשגת תמונות באיכות גבוהה כדי להפיק אנימציות תלת-ממדיות משמעותיות, שכן שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נוירופתיה כואבת. ניתן ליישם אותה גם על דגימות אחרות, כגון תרביות איברים עבות או תרביות תאים תלת-ממדיות, כדי לבחון ולמדוד שינויים מורכבים במורפולוגיה תלת-ממדית.לאחר קיבוע וחיתוך של ביופסיות עור אנושי כפי שפורט בחלק הכתוב של פרוטוקול זה, סמנו פלטה של 96 בארות שתשמש לצביעה, כפי שמוצג בתמונה זו. לאחר מכן, הוסיפו 150 microliters של image ITFX signal לכל באר בשורה הראשונה של פלטת 96 הבארות המסומנת, ופפטו 150 microliters של one XPBS לכל הבארות בשורות השנייה והשלישית. השתמשו בלולאת הזרקה כדי להעביר נתח של 50 millimeter שנלקח מביופסיית רגל דיסטלית של מטופל לאחת הבארות המכילות image.לאחר מכן, העבר מקטע של 50 מילימטר שנלקח מהחלק הפרוקסימלי של אותו מטופל לבאר הבאה המכילה תמונה. חזור על הליך זה עם מקטעים מהרגל הדיסטלית ומהירך הפרוקסימליים משלושה מטופלים נוספים. דגרי את המקטעים ב-, צלם אותם על רוקר שטוח למשך 30 דקות בזמן שמקטעי הביופסיה מדגגרים ב- צלם אותם; הכן תמיסת חסימה של 5% וערבב את התמיסה בוורטקס עד להמסה מלאה של ה-BS A לאחר שחלפו 30 הדקות.העבירו את הפרוסות ל-PBS בשורה השנייה והנעיפו (rock) במשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו ב-PBS בשורה השלישית במשך 10 דקות. שוב עם הנעיפה, פפטו 150 µL של תמיסת חסימה 5%BSA לכל באער בשורה הרביעית והעבירו את הפרוסות לבאערים אלו. הדגירו את הפרוסות בתמיסת חסימה 5%BSA למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר על מכשיר הנעיפה (flat rocker). במהלך הדגירה זו, הכינו תמיסת שטיפה 1%BSA תוך ערבוב ב-vortex עד להמסה מלאה של ה-BSA, ולאחר מכן דללו את הנוגדנים הראשוניים לריכוז הנדרש בתמיסה זו.לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של נוגדנים ראשוניים מהולים לבארים בשורה חמש של פלטת 96 הבארים. עם תום תקופת האינקובציה, העבירו את הSections מתמיסת החסימה לבארים המתאימות של הנוגדנים הראשוניים. בשלב הבא, אטמו את הפלטה באמצעות פאראפילם ונייר אלומיניום כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור, והדגירו לאינקובציה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C על רוקר שטוח. למחרת, הוסיפו 150 µL של תמיסת שטיפה של 1% BSA לכל באר בשורות שש, שבע ושמונה, והעבירו את הSections דרך שטיפות אלו למשך שעה אחת ברוקר בטמפרטורת החדר, תוך הקפדה שהפלטה תהיה מוגנת מאור במהלך כל שטיפה. בזמן שהSections עוברים אינקובציה בשטיפה האחרונה של תמיסת שטיפה 1% BSA, מהלו נוגדנים שניוניים בתמיסת שטיפה 1% BSA בהתאם להנחיות בחלק הכתוב של הפרוטוקולים.עם תום זמן האינקובציה, הוסיפו 150 µL של נוגדנים משניים מדוללים לבארות המיועדות בשורה תשע של פלטת 96 בארות. העבירו את החתכים לבארות אלו, כסו את הפלטה עם פאראפילם ונייר אלומיניום, והדגירו לאינקובציה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C על רוקר שטוח. למחרת, הוסיפו 150 µL של תמיסת שטיפה 1%BSA לכל באר בשורות 10, 11 ו-12, ושטפו את החתכים בתמיסה זו למשך שעה אחת כל אחת, כפי שבוצע קודם לכן.בזמן שחתכי הביופסיה דוגרים בשטיפה האחרונה של תמיסת שטיפה 1%BSA, הכינו למשחות מיקרוסקופ על ידי טפטוף של 50 µL מתמיסת שטיפה 1%BSA על כל למשה בנפרד. הוציאו את החתך מהשטיפה האחרונה והניחו אותו בטיפה של 50 µL מתמיסת שטיפה 1%BSA על למשת המיקרוסקופ הייעודית. לאחר אופטימיזציה של מיקום החתך, הסירו את עודפי תמיסת השטיפה 1%BSA באמצעות פיפטת זכוכית עם נבול, תוך נקיטת אמצעים למניעת מגע עם הדגימה.טפטפו טיפה אחת של חומר קיבוע Prolonged Gold למניעת דהייה עם DPI בסמוך לביופסיה על למסלול המיקרוסקופ. לאחר מכן, קחו כיסוי זכוכית למיקרוסקופ בגודל 22 על 22 מילימטר והניחו אותו בעדינות על הביופסיה ועל טיפת חומר הקיבוע. הסירו בועות אוויר באמצעות קצה של פפית, ונגבו את עודפי ה-Prolonged Gold.ריאגנט Antifa. חזור על הפעולה עבור כל מקטע והשאר את למסחיתות המיקרוסקופ להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחשיכה. דגם את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי; במקרה זה נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי סורק לייזר Olympus flow view 500 עם עדשת שימור שמן 40x וזום פי 2, באמצעות תוכנת flow view גרסה 5.0.השתמש ב-Alexa floor 4 88 וב-Alexa floor 6 47 כדי לעורר את לייזר ההליום-ניאון הירוק באורך גל של 543 nanometer ואת לייזר ההליום-ניאון האדום באורך גל של 633 nanometer, בהתאמה. הגדר את המפתח הקונפוקאלי עבור כל גלאי ל-400 microns כדי להגביר את האותות. יש לבצע סריקות רצפיות ברזולוציה של 10 24 על 10 24.כדי למקסם את הפרדת האות, בצעו לכידה תלת-ממדית של סדרת Z במרווחי Z step של 1.2 micron בהתבסס על יחידת הסריקה האופטימלית, שחושבה על ידי תוכנת ה-flow view באמצעות מיצוע של שני פריימים בשיטת kalman, תחילה פתחו את קבצי ה-flow view בתוכנת MRSX 64 או בתוכנה דומה. כדי להציג את מערכות התמונות התלת-ממדיות, התאימו את התצוגה לפי הצורך כדי לשפר את הניגודיות של האות הספציפי לעצב. צרו משטח (surface) כדי להציג את הגבול שבין הדרמיס לאפידרמיס.השתמש בכלי הקונטור (contour tool) במצב ציור כדי לשרטט את הגבול. הקצה משטח חצי-שקוף לגבול כדי לראות את אותות הפלואורסצנציה שמתחתיו וללכוד תמונות סטטיות של אותות הפלואורסצנציה התלת-ממדיים. כדי ליצור תמונות מצב (snapshots) של הסרטון התלת-ממדי, השתמש בתכונת האנימציה כדי ליצור סט אנימציות של סרטון תלת-ממדי, כך שייווצרו סרטונים המורכבים מ-200 פריימים, המונפשים בקצב של 15 פריימים לשנייה.שמרו כל סרטון כקובץ AVI גולמי ודחסו את סרטון ה-AVI הסופי באמצעות תוכנת Virtual Dub או תוכנה דומה. סרטון זה מציג תמונות בתלת-ממד של סיבי עצב תוך-אפידרמליים נוציצפטיביים. תמונה ראשונה זו מראה סיבי עצב תוך-אפידרמליים חיוביים ל-PGP המסומנים בירוק, המייצגים את סך כל הסיבים העצבים התוך-אפידרמליים, וכן סיבי עצב תוך-אפידרמליים חיוביים ל-track a המסומנים באדום, המייצגים סיבי עצב תוך-אפידרמליים נוציצפטיביים.ולסיום, התמונה שהופיעה מדגימה סיבי עצב נוציספטיביים תוך-אפידרמליים חיוביים ל-PGP בדגימת עור ממקרה ראשון, סרגל המقياس מייצג 20 microns. הסרטון הבא מציג תמונות בתלת-ממד של נפיחויות אקסונליות בסיבי עצב תוך-אפידרמליים של נוירופתיות כואבות. נפיחויות אקסונליות המסומנות בחצי חצים נראות לאורך סיבי העצב התוך-אפידרמליים המסומנים על ידי PGP באות ירוקה בתוך המקלעת התת-עורית.בדגימת עור ממקרה שני, סרגל המقياس מייצג 10 microns. תמונה תלת-ממדית זו מציגה הסתעפויות אקסונליות בסיבי עצב תוך-אפידרמליים של נוירופתיה כואבת. הסתעפויות אקסונליות המסומנות בחצי חצים נראות לאורך סיבי העצב התוך-אפידרמליים המסומנים ב-PGP עם אות ירוקה בדגימת עור ממקרה שלישי.סרגל המقياس מייצג 20 microns לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה במהלך ארבעה ימים, שלוש שעות וחצי בכל יום עבור אימונוהיסטוכימיה ו-35 דקות לדגימה עבור דימות קונפוקלי ואנימציה בתלת-ממד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להעביר ולהצמיד את הרקמות כראוי, תוך נקיטת אמצעים למניעת קריעה של דגימות הדגימה לאחר ביצוע פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח tric תלת-ממדי להערכת חידוש עורי, כדי לענות על שאלות נוספות.האם להסתעפות של סיבי עצבים בבטן יש תפקיד חשוב בהתפתחות של נוירופתיה כואבת?

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טכניקה מוצג אוסף ב-vivo של דגימות נוזל interstitial מאתרים רקמות רלוונטי (העור כאן, מוסת בניסוי) למדידת ביוכימיקלים מתווך כאב ודלקת.

המבדק האדם In-Vivo למדידה רקמות ספציפיות של מגשרים nociceptive ו דלקתיות

אלגוריתמים להערכת סף הכאב חום מכני בעור מודלק בניסוי של נבדקי המחקר האנושי מוצגים. שתי בדיקות פרדיגמות כאב באופן עצמאי לבחון עיבוד nociceptive ידי שני הגדולים היקפי סיב עצב שמשדר כאב אוכלוסיות, כלומר לא myelinated סיבי C ו-A קטן myelinated דלתא סיבים.

קביעת חום סף כאב מכני של העור מודלק בבני אדם

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

סרטון זה מדגים הקלטה של סיב יחיד של הולכה עצבית של סיבי C בחולדות. חולדה מורדמת נחתכת כדי לחשוף את העצב הסיאטי, המספק אספקה חושית ומוטורית לגפיים התחתונות. לאחר מכן נחשפים סיבי ה-C הבודדים. גירוי חשמלי ניתן באמצעות אלקטרודות גירוי המושתלות בכף הרגל, ותגובה נרשמת מסיב עצב בודד.

In vivo הקלטה של סיב יחיד של סיבי C של עצב סיאטי בחולדות

מקור: Hamid, H. S., {{}}. הדמיה תלת מימדית וניתוח של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים אנושיים. }J. Vis. exp. (2017)} } סרטון זה מדגים את השיטה להמחשת מיטוכונדריה ספציפית לעצב באמצעות הדמיה תלת מימדית. הוא מתאר את התהליך של רכישת סריקות עוקבות של סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים מסומנים מראש ויצירת תמונות פני שטח תלת מימדיות כדי לבודד ולהציג מיטוכונדריה ביחס למבני עצבים.

הדמיה של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים

הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים - כמו זקיקי שיער וקצות עצבים - שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.

השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

מחקר זה מציג גישת הדמיה דו-פוטונית ב-in vivo להמחשת המבנים של טרמינלי אקסון בעלי סף נמוך (LTMR) בעור כף הרגל הקדמית של עכברים. באמצעות דימות חוזר ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים, שיטה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר מבנה ותפקוד המעגל החישי העור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים.

הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר

חקור שינויים מורפולוגיים בסיבי עצב תוך-עוריים נויספטיביים בנוירופתיה כואבת באמצעות הדמיה תלת-ממדית בביופסיות עור אנושי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של סיבי עצב לזיהוי שינויים פתולוגיים.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

גלה סרטונים נוספים