Name: במבחנה מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למדו שיטה לבידול מונוציטים מדם פריפרי אנושי והפיכתם למקרופאגים מקוטבים באמצעות צנטריפוגה ו-PRC כמותי. מודל זה מאפשר חקר תפקוד מערכת החיסון ומחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Wambsganss נאדין לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם Forschungsgemeinschaft דויטשה (GL599/1-1) ובחלקו על ידי מענק מקרן חדשנות הגבול (אוניברסיטת היידלברג) לחטיבה

1. פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חוצצים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ לבידוד PBMC: &quot;לשטוף חיץ&quot; = 0.02% EDTA ב PBS (שימוש 0.5 M EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ לבידוד מונוציטים: &quot;חיץ שטיפת מקינטוש&quot; = 0.5% BSA (250 מ&quot;ג) + 2 מ&quot;מ EDTA (200 μl) + PBS (50 מ&quot;ל). דגה החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ מכתים FACS ואחסון של תאים: &quot;FACS חיץ&quot; = 10% FCS ב PBS ו&quot; חיץ קיבעון &quot;= 1% PFA ב PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר דם כל 30 מ&quot;ל מוריד בזרוע. השתמש EDTA כנוגד קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד PBMC (Histopaque) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני צינורות 50 מ&quot;ל סטרילי (לא פולי-סטירן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם משלב 2 עם PBS 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מיליליטר Histopaque 25 + 25 מיליליטר דם מלא / PBS לכל צינור. ודא כי Histopaque ודם לא מתערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 עבור 30 דקות ב RT, לא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פלזמה וזורקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ממשק אטום וטפטף לתוך אמבטיה הנקי 50 מ&quot;לדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל של 0.02% EDTA ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של 0.02% EDTA ב-PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 200 השעיה μl תא + 300 μl 0.02% EDTA ב PBS + 500 μl של Trypan כחול (200-500 cells/10 ריבועים, אחרת לשנות גורם לדילול). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד שלילי של מונוציטים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים המתקבלים בשלב 3.10 עבור 10 דקות, 120 x גרם. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תא גלולה 2x על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר מים סטריליים ל3 שניות, להוסיף 1 מ&quot;ל PBS 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם נוספת עם PBS + 0.02% EDTA וצנטריפוגות 10 דקות, 120 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסמוך במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל במאגר EasySep ב5 x 10 7 / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 זין העשרת מונוציטים μl / מ&quot;לזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים מערבולת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 חרוזים μl / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמלא בחיץ EasySep כדי להשלים נפח של 2.5 מ&quot;ל. הפתרון עכשיו מופיע חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכניס לתוך מגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2.5 דקות ב RT. במהלך הזמן הזה התאים שאינם monocytic המאוגדים חרוז המגנטי יעברו לקיר הצינור ולתקוע שם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חיץ עם מונוציטים בלתי מחייבים לתוך צינור סטרילי טרי. פתרון זה נראה לבנבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בצלחת פלסטיק או multiwall צלחת בצפיפות של 0.5 x 10 6/2 ס&quot;מ. הוסף 1 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות / 1 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים בתנאים של ריבית עבור 6-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת לאחר 3 ימים על ידי החלפת 50% מהתקשורת עם תקשורת טרי (ראה טבלת מס &#39;1 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאחר שישה ימים לתאי קציר בידוד mRNA, cytometry הזרימה, מערבי סופג, וכו &#39;. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

המחברים לא צריכים לחשוף כל ניגוד עניינים.

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים את סוג התא המרכזי של מערכת החיסון המולדת. הם משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות רבות, כולל טרשת עורקים או סרטן 2. לפיכך, לומד ביולוגיה מקרופאג הוא חיוני להעמקת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות ולאפשר פיתוח של טיפולים חדשניים. מחקרים רבים ליישם מודלים של עכבר overexpressing או חסרי גנים מסוימים של עניין. במקרה של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות, זה נראה לא הדרך הטו...

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים מרכיב תאי חשוב של מערכת החיסון המולדת ולתרום לתהליכים דלקתיים רבים 1 אקוטיים או כרוניים. המקרופאגים משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים רבות או סרטן 2. המקרופאגים מראים רמה גבוהה של גמישות והם מסוגלים להניח פנוטיפים שונים בהתאם לmicromilieu המקומי 3. לפיכך, לומד בידול מקרופאג וההטרוגניות הוא חיוני להגדלת הידע של הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות שלנו ועל מנת לאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים. במקרים רבים, מודלים Murine משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד ביולוגיה מקרופאג באמצעות מודלים עכבר מלווה בכמה חסרונות: (1) חלקם של מספרי קבוצת משנה ויקוציטים (מונוציטים וגרנולוציטים כלומר) בperipדם heral של עכברים או בני אדם שונה באופן משמעותי המצביע על תפקידים שונים של מונוציטים בפתופיזיולוגיה עכברית ואנושית. (2) יש הבדלים משמעותיים בביטוי גנים בין מונוציטים בדם היקפיים Murine והאנושיים המצביעים על הבדלים משמעותיים בתפקודם במהלך מחלה ובריאות 4. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים ומקרופגים (F4/80, LYC, וכו &#39;.) עכבריים אינה קיימים בתאי מיאלואידית אדם, מה שהופך את העברת ממצאים במודלים של עכבר למצב האנושי קשה למדי. לכן, על מנת להגביר את ההבנה של בידול מקרופאג וההטרוגניות במחלה אנושית שלנו, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלים שעובדים עם מקרופאגים אדם. לכן, לנו כאן לתאר מודל של דור מקרופאג העיקרי אדם כי הוא קל לשימוש ומאפשר לימוד של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות אדם במבחנה בתנאים שונים וכתוצאה מכך שונה מקרופאג פוסוגי larization. במספר מחקרים, יש לנו להשתמש במודל חוץ גופית של מקרופאגים האנושיים העיקריים מונוציטים הנגזרות לנתח ביולוגיה מקרופאג ואת הרלוונטיות שלה לטרשת עורקת פוטנציאל אנושית 5-7. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

<table><tbody><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה (סטרילי)</td> <td>פישר</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), נוזל (ללא סידן או מגנזיום)</td> <td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep ערכת העשרת מונוציטים אנושיים</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep מגנט</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>פישר</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>מקרופאג'-SFM (1X)</td> <td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>נוטרידומה-SP</td><td>רוש</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>אנושי M-CSF 10 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים 6 בארות</td><td>פישר</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול macrophage אדם וקיטוב

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים סוג תא חשוב של מערכת החיסון המולדת. מודלים עכבר הלומדים ביולוגיה מקרופאג סובלים מההבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מקרופאגים מונוציטים הנגזרות Murine והאנושיים. לכן, לנו כאן לתאר במודל חוץ גופית כדי ליצור וללמוד מקרופאגים האנושיים העיקריים. בקצרה, לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות של דם היקפי נמשך מוריד בזרוע, מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear באמצעות בידוד חרוז מגנטי שלילי. מונוציטים אלה בתרבית, במשך שישה ימים בתנאים מסוימים לגרום לסוגים שונים של בידול מקרופאג או קיטוב. המודל הוא קל לשימוש ועוקף את הבעיות שנגרמו על ידי הבדלים בין מינים ספציפי עכבר ואדם. יתר על כן, הוא קרוב יותר לתנאים בvivo מאשר השימוש בשורות תאים הונצחו. לסיכום, המודל שתואר כאן הוא מתאים ללמוד macrophagביולוגיה דואר, לזהות מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשניות. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, באופן שגרתי אנחנו להשיג 25.1 דם x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 מ&quot;ל (שגיאה ממוצעת ± סטנדרטי מ -26 ניסויים בלתי תלויים, איור 1 א). טוהר מונוציטים כפי שנקבע על ידי צביעת תזרים cytometric לCD14 הוא באופן שגרתי יותר מ -95% (97.1 ± 0.4%, סטיית תקן ממוצעת ± מ -3 ניסויים בלתי תלויים, איור 1). כדאיות תא של מונוציטים מבודדים טרי, כפי שנקבע על ידי צביעת trypan הכחולה היא באופן שגרתי יותר מ -95% (נתו...

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ליצירת תאים אלה. השימוש בצנטריפוגה שיפוע, בידוד חרוז שלילי ותנאי תרבות תאים מסוימים, יכולים להיות שנוצרו מקרופאגים מונוציטים הנגזרות ללימודים פנוטיפי ופונקציונליים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד מונוציטים מדם היקפי אנושי ולהבדיל אותם לסוגי קיטוב מקרופאגים שונים. זה מושג על ידי בידוד ראשון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. כשלב שני מבוצע בידוד חרוזים שלילי כדי להשיג מונוציטים חיוביים טהורים CD 14.לאחר מכן, מונוציטים מתורבתים בתנאים ספציפיים על מנת לגרום למקרופאגים מקוטבים במיוחד. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את הביטוי הדיפרנציאלי של סמני קיטוב מקרופאגים בתגובה לתנאי התרבות שלהם על ידי PCR כמותי. שיטה זו יכולה לעזור לנתח את ההתמיינות של מקרופאגים לסוגי קיטוב שונים.תכונה חשובה ביותר במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים. לאחר שאיבת 30 מיליליטר דם מלא מווריד האמה ממתנדב, חלקו את הדם באופן שווה לשתי צינורות חרוטיים שאינם פוליסטירן בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן יש לדלל את הדם בכל צינור עם 10 מיליליטר PBS.לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של חבילת היסטו ל-25 מיליליטר של דם מלא ו-PBS בכל צינור, תוך הקפדה שאריזת ההיסטו והדם לא יתערבבו. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות למשך 30 דקות ב -400 גרם וטמפרטורת החדר ללא הפסקה. לאחר הסיבוב שאבו תחילה את שכבת הפלזמה ולאחר מכן העבירו את שכבת הממשק האטומה לצינור טרי של 50 מיליליטר.שטפו את התאים מהממשק ב -20 מיליליטר PBS בתוספת CDTA למשך חמש דקות ב -250 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאחר השלכת ה-supernatant resus, השעו את הגלולה ב-10 מיליליטר של PBS בתוספת CDTA וערבבו היטב את התאים על ידי מערבולת למשך 10 שניות. כעת יש לדלל 200 מיקרוליטר של מתלה התאים ב-300 מיקרוליטר של PBS בתוספת EDTA, ו-500 מיקרוליטר של טריאם כחול.כדי להשיג כ -200 עד 500 תאים לכל 10 ריבועים וציטומטר המו התחל את הבידוד השלילי על ידי סיבוב התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות ב -120 גרם לאחר הכביסה השנייה, אנו משעים את הגלולה בתשעה מיליליטר מים סטריליים למשך שלוש שניות. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 10 XPBS לאחר שטיפה וספירת התאים פעם נוספת, דלל אותם במאגר מוגדר קל בחמש פעמים 10 מתוך שבעת התאים למיליליטר. כעת דגרו על התאים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב -50 מיקרוליטר למיליליטר קוקטייל העשרה מונוציטים.במהלך הדקה האחרונה של מערבולת הדגירה, חרוזי ההעשרה של המונוציטים למשך 30 שניות. לאחר מכן הוסיפו לתאים 50 מיקרוליטר למיליליטר של החרוזים ודגרו על החרוז בתרחיף התאים למשך חמש דקות נוספות. לאחר הדגירה השנייה, הביאו את נפח תמיסת התא עד 2.5 מיליליטר.עם יותר מאגר EEP, התמיסה תופיע כעת בצבע חום. לאחר מכן, הנח את הצינור למגנט eep למשך שתי דקות וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר שהתאים הקשורים בחרוזים הספיקו להידבק, שפכו את המאגר המכיל את המונוציטים הלא קושרים לתוך צינור סטרילי טרי.התמיסה תופיע כעת בצבע לבנבן לאחר שטיפת התאים הלא קשורים פעם אחת עם PBS בתוספת EDTA, תעביר את התאים לצלחת מרובת בארות, ואז תוסיף מיליליטר אחד של מצע תרבית לכל אחד כפול 10 לששת התאים לצלחת התרבית. לבסוף, תרבית התאים בתנאי הניסוי המעניינים למשך שישה ימים כדי לגרום להתמיינות מקרופאגים. החלף מחצית מהמדיה לאחר שלושה ימים במדיה טרייה לאחר שישה ימים.קצור את התאים לניתוח הניסיוני הרצוי. באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, כ-25 פעמים 10 מתוך ששת המונוציטים מתקבלים באופן שגרתי מ-100 מיליליטר של מונוציטים בדם, טוהר כפי שנקבע על ידי זרימה, צביעה ציטומטרית עבור CD 14 גדולה באופן שגרתי מ-95% כאשר היא מתווספת לראשונה לתרבית. המונוציטים הם בתחילה בצורת עגול וצפים תוך מספר שעות.עם זאת, הם נצמדים, ומעניקים להם מראה דמוי ביצה מטוגנת או ציר לאחר שישה ימים. בתרבית עם MCSF בלבד או בתוספת LDL מחומצן במשך 24 השעות האחרונות, או כ-80% מהתאים שלא נחשפו ל-LDL מחומצן הם ברי קיימא, כפי שנקבע על ידי פרופידיום יודיד. טיפול צביעה עם LDL מחומצן לעומת זאת מביא לכ-70% כדאיות התאים לאחר שישה ימים של תרבית.עם זרימת MCSF, ניתוח ציטומטרי מדגים כי בעוד שהתאים ממשיכים לבטא את סמן הלויקוציטים CD 45 ro, הם מפחיתים את סמן המונוציטים CD 14. בהתאם לתנאים הספציפיים שעלולים לגרום לקיטוב מקרופאגים במהלך תרבית תאים, יש צורך בסמנים נוספים כדי להצדיק קיטוב מוצלח. תנאים ספציפיים עלולים לגרום לקיטוב מקרופאגים.לדוגמה, מקרופאגים מקוטבים M1 מבטאים סמנים אופייניים כמו IL 6 ו-TNF alpha, בעוד ש-M שני מקרופאגים מקוטבים מבטאים CD 36 ו-CD 2 0 6, ניתן לחקור מקרופאגים נוספים בניסויים פונקציונליים. לדוגמה, ניתן לחקור את הספיגה של LDL מחומצן באמצעות LDL עם תווית פלואורסצנטית. בניסוי זה, התאים נחשפו ל-10 מיקרוגרם למיליליטר של DII שסומן כ-LDL מחומצן למשך ארבע שעות, והגרעינים נצבעו ב-dpi.ההיסטוגרמה מדגימה את מדידת הזרימה הציטומטרית של ספיגת ה-LDL המחומצנת DII על ידי מקרופאגים המושרים על ידי MCSF עם ההיסטוגרמה האפורה המוצקה המייצגת את תאי הבקרה הלא מטופלים וההיסטוגרמה הפתוחה השחורה. ייצוג המקרופאגים המחומצנים שטופלו ב- LDL לאחר התפתחותו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור התמיינות והטרוגניות של מקרופאגים אנושיים.בכך הוא מאפשר להם לחקור מחלות דלקתיות כגון טרשת עורקים כדי לזהות מנגנוני מחלה חדשים ומטרות טיפוליות חדשות.

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפרימיום של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים. מונוציטים אנושיים ראשוניים יכולים להיות מבודדים ומובחנים לפנוטיפ פרו-דלקתי דמוי M1 באמצעות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) או לפנוטיפ אנטי-דלקתי דמוי M2 באמצעות גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF).

תרבית חוץ גופית והתמיינות של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לגרימת התמיינות וקיטוב של מונוציטים היקפיים שמקורם בדם למקרופאגים M1 או M2. דגירה עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים, ליפופוליסכריד ואינטרפרון-גמא מניבה מקרופאגים M1 מעודדי דלקת, ואילו דגירה עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים ואינטרלוקין-4 גורמת לייצור מקרופאגים אנטי-דלקתיים מסוג M2.

התמיינות וקיטוב של תאים שמקורם במונוציטים לתאים דמויי מקרופאגים

המאמר מתאר את הסתגלות קלה...

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

פרוטוקול זה מתאר את הדור החזק של מקרופאגים מתאי גזע המושרה האדם pluripotent ושיטות לאפיון הבאים שלהם. ביטוי לסמן תא המשטח, ביטוי הגנים, ומוסר פונקציונלי משמשים כדי להעריך את הפנוטיפים ואת התפקוד של מקרופאגים הנגזרות iPSC.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה ללמוד זיהום שחפת Mycobacterium במאקרופאגים אנושיים M1- או M2 מקוטבים המבוססים על בידול של מונוציטים היקפיים-דם לתאים דמויי מקרופאג' הנגועים בזן הארסי H37Rv המסומן על ידי GFP, ומנותחים עם ציטומטריית זרימה באמצעות פאנל של 10 צבעים כולל ביטוי של סמני M1/M2 נבחרים.

קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת הפוטנציאל החיסוני של משטחי שתלים במבחנה, במטרה לשפר את האמינות והשחזור של הפרוטוקולים הנוכחיים ולקדם מחקר נוסף. פרופילי ציטוקינים מפרישים, ביטוי mRNA וסמני פני התא נוטרו באמצעות מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם כדי לחקור קיטוב מקרופאגים המעובדים על טיטניום.

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל 

מונוציטים ומקרופאגים הם תאים חיסוניים פלסטיים מאוד וניתנים לתכנות מחדש החיוניים לבריאות ולמחלות. הם חשים ומגיבים למגוון רחב של גירויים על ידי אימוץ תוכניות בידול ופנוטיפים ספציפיים. תקננו מודל מבחנה לחקר קיטוב ותכנות מחדש של מקרופאגים, ומספק כלי רב ערך למחקר.

מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

למדו שיטה לבידול מונוציטים מדם פריפרי אנושי והפיכתם למקרופאגים מקוטבים באמצעות צנטריפוגה ו-PRC כמותי. מודל זה מאפשר חקר תפקוד מערכת החיסון ומחלות דלקתיות.

גלה סרטונים נוספים