המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד מונוציטים מדם היקפי אנושי ולהבדיל אותם לסוגי קיטוב מקרופאגים שונים. זה מושג על ידי בידוד ראשון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. כשלב שני מבוצע בידוד חרוזים שלילי כדי להשיג מונוציטים חיוביים טהורים CD 14.

לאחר מכן, מונוציטים מתורבתים בתנאים ספציפיים על מנת לגרום למקרופאגים מקוטבים במיוחד. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את הביטוי הדיפרנציאלי של סמני קיטוב מקרופאגים בתגובה לתנאי התרבות שלהם על ידי PCR כמותי. שיטה זו יכולה לעזור לנתח את ההתמיינות של מקרופאגים לסוגי קיטוב שונים.

תכונה חשובה ביותר במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים. לאחר שאיבת 30 מיליליטר דם מלא מווריד האמה ממתנדב, חלקו את הדם באופן שווה לשתי צינורות חרוטיים שאינם פוליסטירן בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן יש לדלל את הדם בכל צינור עם 10 מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של חבילת היסטו ל-25 מיליליטר של דם מלא ו-PBS בכל צינור, תוך הקפדה שאריזת ההיסטו והדם לא יתערבבו. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות למשך 30 דקות ב -400 גרם וטמפרטורת החדר ללא הפסקה. לאחר הסיבוב שאבו תחילה את שכבת הפלזמה ולאחר מכן העבירו את שכבת הממשק האטומה לצינור טרי של 50 מיליליטר.

שטפו את התאים מהממשק ב -20 מיליליטר PBS בתוספת CDTA למשך חמש דקות ב -250 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאחר השלכת ה-supernatant resus, השעו את הגלולה ב-10 מיליליטר של PBS בתוספת CDTA וערבבו היטב את התאים על ידי מערבולת למשך 10 שניות. כעת יש לדלל 200 מיקרוליטר של מתלה התאים ב-300 מיקרוליטר של PBS בתוספת EDTA, ו-500 מיקרוליטר של טריאם כחול.

כדי להשיג כ -200 עד 500 תאים לכל 10 ריבועים וציטומטר המו התחל את הבידוד השלילי על ידי סיבוב התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות ב -120 גרם לאחר הכביסה השנייה, אנו משעים את הגלולה בתשעה מיליליטר מים סטריליים למשך שלוש שניות. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 10 XPBS לאחר שטיפה וספירת התאים פעם נוספת, דלל אותם במאגר מוגדר קל בחמש פעמים 10 מתוך שבעת התאים למיליליטר. כעת דגרו על התאים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב -50 מיקרוליטר למיליליטר קוקטייל העשרה מונוציטים.

במהלך הדקה האחרונה של מערבולת הדגירה, חרוזי ההעשרה של המונוציטים למשך 30 שניות. לאחר מכן הוסיפו לתאים 50 מיקרוליטר למיליליטר של החרוזים ודגרו על החרוז בתרחיף התאים למשך חמש דקות נוספות. לאחר הדגירה השנייה, הביאו את נפח תמיסת התא עד 2.5 מיליליטר.

עם יותר מאגר EEP, התמיסה תופיע כעת בצבע חום. לאחר מכן, הנח את הצינור למגנט eep למשך שתי דקות וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר שהתאים הקשורים בחרוזים הספיקו להידבק, שפכו את המאגר המכיל את המונוציטים הלא קושרים לתוך צינור סטרילי טרי.

התמיסה תופיע כעת בצבע לבנבן לאחר שטיפת התאים הלא קשורים פעם אחת עם PBS בתוספת EDTA, תעביר את התאים לצלחת מרובת בארות, ואז תוסיף מיליליטר אחד של מצע תרבית לכל אחד כפול 10 לששת התאים לצלחת התרבית. לבסוף, תרבית התאים בתנאי הניסוי המעניינים למשך שישה ימים כדי לגרום להתמיינות מקרופאגים. החלף מחצית מהמדיה לאחר שלושה ימים במדיה טרייה לאחר שישה ימים.

קצור את התאים לניתוח הניסיוני הרצוי. באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, כ-25 פעמים 10 מתוך ששת המונוציטים מתקבלים באופן שגרתי מ-100 מיליליטר של מונוציטים בדם, טוהר כפי שנקבע על ידי זרימה, צביעה ציטומטרית עבור CD 14 גדולה באופן שגרתי מ-95% כאשר היא מתווספת לראשונה לתרבית. המונוציטים הם בתחילה בצורת עגול וצפים תוך מספר שעות.

עם זאת, הם נצמדים, ומעניקים להם מראה דמוי ביצה מטוגנת או ציר לאחר שישה ימים. בתרבית עם MCSF בלבד או בתוספת LDL מחומצן במשך 24 השעות האחרונות, או כ-80% מהתאים שלא נחשפו ל-LDL מחומצן הם ברי קיימא, כפי שנקבע על ידי פרופידיום יודיד. טיפול צביעה עם LDL מחומצן לעומת זאת מביא לכ-70% כדאיות התאים לאחר שישה ימים של תרבית.

עם זרימת MCSF, ניתוח ציטומטרי מדגים כי בעוד שהתאים ממשיכים לבטא את סמן הלויקוציטים CD 45 ro, הם מפחיתים את סמן המונוציטים CD 14. בהתאם לתנאים הספציפיים שעלולים לגרום לקיטוב מקרופאגים במהלך תרבית תאים, יש צורך בסמנים נוספים כדי להצדיק קיטוב מוצלח. תנאים ספציפיים עלולים לגרום לקיטוב מקרופאגים.

לדוגמה, מקרופאגים מקוטבים M1 מבטאים סמנים אופייניים כמו IL 6 ו-TNF alpha, בעוד ש-M שני מקרופאגים מקוטבים מבטאים CD 36 ו-CD 2 0 6, ניתן לחקור מקרופאגים נוספים בניסויים פונקציונליים. לדוגמה, ניתן לחקור את הספיגה של LDL מחומצן באמצעות LDL עם תווית פלואורסצנטית. בניסוי זה, התאים נחשפו ל-10 מיקרוגרם למיליליטר של DII שסומן כ-LDL מחומצן למשך ארבע שעות, והגרעינים נצבעו ב-dpi.

ההיסטוגרמה מדגימה את מדידת הזרימה הציטומטרית של ספיגת ה-LDL המחומצנת DII על ידי מקרופאגים המושרים על ידי MCSF עם ההיסטוגרמה האפורה המוצקה המייצגת את תאי הבקרה הלא מטופלים וההיסטוגרמה הפתוחה השחורה. ייצוג המקרופאגים המחומצנים שטופלו ב- LDL לאחר התפתחותו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור התמיינות והטרוגניות של מקרופאגים אנושיים.

בכך הוא מאפשר להם לחקור מחלות דלקתיות כגון טרשת עורקים כדי לזהות מנגנוני מחלה חדשים ומטרות טיפוליות חדשות.