הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד DNA גנומי אנושי מדם מלא, באמצעות טכנולוגיית מיצוי True Tip עם תחנת העבודה לטיפול בנוזלים Hamilton Star. כדי להשיג זאת, תאים מומסים בתמיסה המורכבת מדם, באפר ליזיס, proteinase K ואתנול; התמיסה נשאבת ומוזרקת דרך ה-True Tips מספר פעמים, ובכך נקשר ה-DNA למטריצת ה-True Tip. לאחר מכן, שני באפרי שטיפה נפרדים מוזרמים דרך ה-True Tips על מנת להסיר חלבונים שבירים, באפר ליזיס ומזהמים אחרים מהחומצות הגרעיניות הקשורות.

בשלב השלישי, מייבשים את מטריצת הקשירה של ה-true tip על ידי שאיבה והזרקה של אוויר מספר פעמים כדי לאדות את שאריות בופר השטיפה. בשלב הסופי, מזרימים בופר אלוציה הלוך ושוב דרך מטריצת הקשירה כדי לשחרר את ה-DNA מהמטריצה. באמצעות טכנולוגיית true tip, מופק כך DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה ללא מזהמים, וניתן לאשר זאת באמצעות בליעה ב-UV vis, אלקטרופורזה בג'ל ו-PCR כמותי או רצף. היתרון של true tip על פני שיטות אחרות להכנת דגימות המבוססות על עמודי ספין או חלקיקים מגנטיים הוא ש-Tru Tip קל לאוטומציה.

השיטה אינה דורשת מערכות יקרות הכוללות צנטריפוגות ומוטות מגנטיים, וזרימת העבודה הפשוטה חוסכת מקום יקר על משטח העבודה. למרות שהיום נתמקד בדם מלא, ניתן להחיל את Tru Tip גם על יישומים אחרים של דגימות genomic DNA, כמו גם על viral RNA מדגימות סוואב קליניות או בידוד של cell-free DNA מפלזמה, למשל. את הפרוצדורה ידגים Dane Brady, מהנדס אוטומציה מהמעבדה שלנו, שהיה דמות מפתח בפיתוח פרוצדורת המיצוי של Truet tip בתחנת העבודה Hamilton Liquid Handling.

בפרוטוקול זה, רובוט לטיפול בנוזלים מסוג Hamilton Star מחלץ DNA באופן סימולטני מ-96 בארות של דם מלא. ל-Hamilton Star יש יחידת ערבוב עם חימום אופציונלית על משטח העבודה, החשובה לעיכול אנזימטי של מטריצות קליניות מסוימות, כגון דם מלא. מכיוון שהמערכת יכולה להיות מצוידת בראש פיפט עם 96 ערוצים, קיימת פלטה ייעודית בעלת 96 בארות עבור כל אחד משלבי הטיפים (true tips) והריאגנטים.

ראשית, הפעילו את הציוד הנלווה לרובוט Hamilton Star ואת המחשב. פתחו את תוכנת ה-Hamilton Run Control. פתחו את קובץ ההרצה שסופק על ידי ACON עבור 96 דגימות.

כעת הגדירו את פריסת סיפון ה-star deck בהתאם לתרשים. מקמו טיפים מסוננים של 1 mL בכל העמדות המסומנות ב-1; בעמדה 2 מקמו טיפים לא מסוננים של 1 mL; בעמדה 3 מקמו טיפים מסוג Conni Hamilton 1 mL LPT 2 mm true tips. המשיכו להיעזר בטבלה כדי למלא את שאר העמדות, מ-5 עד 12, בציוד המעבדה הנדרש, אך אל תטענו את הדגימות עדיין.

כעת חלקו את הרכיבים: 75 milliliters של lysis and binding buffer. יש להטעין את F בעמדת תעלה חמישה. לחילופין, ניתן להשתמש בלוחיות ממולאות מראש בבופרים כדי לייעל את ההכנה ולפשט את סידור העמדה.

המשיכו להטעין את הרובוט בהתאם. לבסוף, הסירו את הפקקים מבחוליות הדם והניחו אותן במסדי נשאי הדגימות או בעמדה ארבע על המשטח. הניחו את דגימה 1 בחלק האחורי של הנשא השמאלי ביותר, והמשיכו ברצף לכל נשא, כך שדגימה 96 תמוקם בעמדה הקדמית הימנית.

לאחר טעינת כל הדגימות, יש לאפשר להן להגיע לשיווי משקל בטמפרטורת החדר. מכיוון שהפרוטוקול אוטומטי לחלוטין, הסיכוי לטעות אנושית של המפעיל הוא נמוך. יש להניח את הדגימות במעמד בסדר הנכון, אך ניתן להשתמש בברקוד כדי להבטיח מעקב תקין אחר הדגימות.

כדי להתחיל סקריפט אוטומטי, בחרו בכפתור ההפעלה (play) בפינה השמאלית העליונה של חלון קובץ ההרצה והזינו את מספר הדגימות המעובדות. השלב הראשון המבוצע על ידי הסקריפט הוא העברה של 80 µL של proteinase K לצלחת האינקובציה במיקום 14 במודול המנער המחומם. לאחר מכן, הסקריפט מחלק 200 µL של דגימה לכל באר דגימה בצלחת האינקובציה באמצעות זרוע שמונה הערוצים.

לאחר מכן מחלקים 600 µl של lysis buffer F לכל באער של לוח האינקובציה באמצעות זרוע 96 הערוצים. הסקריפט מערבב את התמיסה למשך 10 מחזורים ומדגיר אותה למשך 20 דקות ב-70 °C וב-500 RPM בלוח הבאערים העמוקים (deep well plate); הטמפרטורה היא 60 °C בלבד, טמפרטורה הנמצאת בטווח הפעילות של proteinase K. בזמן שהדגימות מדגירות, ממשיכה מערכת טיפול בנוזלים לפעול על ידי חלוקת ריאגנטים לאקסטרקציה ואלוציה מאמבטי הריאגנטים למספר לוחות 96 הבאערים המתאימים; 100 µl של Elucian buffer A מתווספים לכל באער בלוח הבאערים העמוקים.

במיקום 13, מופקדים 800 µL של אתנול לכל באער של פלטת הבאערים העמוקה. במיקום 10, מתווספים 1.6 mL של תמיסת שטיפה K לכל באער של פלטת הבאערים העמוקה במיקום 12, ו-1.6 mL של תמיסת שטיפה J מתווספים לכל באער של פלטת הבאערים העמוקה במיקום 11. לאחר דגירה של 20 דקות, תערובת הדגימה מועברת מפלטת הדגירה לפלטת הבאערים העמוקה המכילה אתנול במיקום 10, שם היא מעורבבת באמצעות 12 מחזורי פיפטינג.

במהלך התהליך, טיפי הריאגנטים נשמרים בפח הפסולת לפי הצורך. התוכנית ממשיכה מתהליך הליזיס לשלב מיצוי ה-DNA על ידי טעינה ראשונית של 96 טיפים אמיתיים (true tips) מעמדה שלוש על סיפון הדגימות. השלב הבא הוא שאיבה והעברה של הדגימות בעמדה 10 לאורך 10 מחזורים, ובכך קשירה של החומצות הגרעיניות למונוליט של הטיפ האמיתי.

בשלב הבא, הטיפים האמיתיים עוברים לעמדה 11, שבה בופר שטיפה J מועבר במחזוריות על פני המונולית חמש פעמים כדי להסיר שאריות של ליזיס, בופר ומטריצת הדגימה. לאחר מכן, הטיפים האמיתיים עוברים לעמדה 12, שם בופר שטיפה K מועבר דרכם במחזוריות חמש פעמים כדי להסיר חלבונים ומזהמים אחרים מהחומצות הגרעיניות הקשורות. לבסוף, הטיפים האמיתיים מיובשים באוויר באמצעות 80 מחזורים במהירות גבוהה מעל ללוח השטיפה.

כעת, הטיפים האמיתיים עוברים לעמדה 13, שם בופר אלוציה עובר דרכם בשני מחזורים, חמש פעמים, תוך שחרור ה-DNA אל תוך פלטת הבארות העמוקות. הטיפים האמיתיים נפלטים כעת לסל הפסולת. כעת התוכנית הסתיימה.

הוצא את פלטת האלוציה מהמכשיר והעבר את הדגימות שהופקו לשפופרות המתאימות לאחסון או ליישומים המשכיים. ניתן להתאים את התוכנית כך שתעביר באופן אוטומטי את הדגימות הסופיות לשפופרת או לפלטה הרצויה בתוך שעה אחת בלבד. המערכת האוטומטית הפקיעה DNA גנומי מ-96 דגימות דם באמצעות הרובוט.

פרופילי הבליעה של 45 דגימות דם חיוביות עובדו בו-זמנית עם 45 בקרים של ריאגנטים (reagent blanks). יחס בליעה ממוצע בין 260 ל-280 היה 1.96, והיחס הממוצע בין 260 ל-230 היה 1.93, מה שמעיד על דגימות טהורות על ג'ל agarose בריכוז 1%.

התשואה הממוצעת הייתה כ-five µg של DNA ל-200 µL של דם מלא. בעת אופטימיזציה של פרוטוקול ה-true tip האוטומטי, יש להקפיד במיוחד על מניעת זיהום צולב בין הבארים. RT-PCR מראה הפרדה נקייה בין דגימות חיוביות לשליליות, כפי שמוצג כאן.

עבור מיצויי RNA, ניתן להשלים את המיצוי המלא של 96 דגימות בפחות משעה, עם זמן עבודה ידני מינימלי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידוד DNA גנומי אנושי מדם מלא באמצעות טכנולוגיית TRU האוטומטית בתחנת העבודה לטיפול בנוזלים Hamilton Star.