בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש ברביעיות פלואורו מקודדות גנטית כדי למדוד את דינמיקת הסידן של נוירונים בודדים בתוך תולעת הנמטודה. ראה אלגנטיות, זה מושג על ידי הרכבה ושחרור ראשונים של אלגנטיות C שלמה המבטאת פלואורופור רגיש לסידן בתאי העצב המעניינים בשקופית מיקרוסקופ רגילה. לאחר מכן, נוירונים בודדים מצולמים in vivo באמצעות מיקרוסקופ וידאו וטכניקות הדמיה פלואורסצנטיות סטנדרטיות.

לאחר מכן הסרטון מנותח כדי למדוד את עוצמת הקרינה במיקומים ספציפיים בנוירון עבור שני מחנה Fluor fours G נפוץ, הנותן אות ערוץ יחיד בעל משרעת גדולה חזקה וזיקית מבוססת שריגים, המייצרת יחס ערוץ כפול. תוצאות מדידה מטריות מתקבלות הפעילות העצבית המוצגת בתגובה לגירוי חושי ספציפי, כמו גם פיזיולוגיה של סידן תאי בתגובה לנזק תאי, שניהם מבוססים על מדידה אופטית של רמות סידן יחסיות בתוך הנוירון המצולם. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות דומות במערכות בעלי חוליות או אלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית הם ש-CL elgan מייצג מערכת חזקה, גמישה וניתנת למעקב גנטי להדמיה עצבית in vivo שהיא פשוטה מבחינה טכנית וחסכונית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במגוון רחב של ביולוגיה של נוירונים מבוססי שדה, ומאפשרת מדידות הן של פעילות והן של סינוס עם נוירונים בודדים in vivo. התחל עם מיקרוסקופ מורכב סטנדרטי עם יכולות הדמיה פלואורסצנטיות אפי לאיכות התמונה והאות הטובה ביותר. השתמש במטרת הגדלה גבוהה, צמצם מספרי גבוה ומצלמת CCD מקוררת ברגישות גבוהה על מנת למקסם את רזולוציית התמונה והרגישות תוך מזעור רעשי רקע עבור ארבע פלורה בצבע יחיד.

השתמש בסט מסנני הקרינה הסטנדרטי של מיקרוסקופ המיועד לאורך הגל המסוים של ארבעת הפלואור למחנה G. השתמש בסט מסנני GFP סטנדרטי המותאם לעירור ב-488 ננומטר ופליטה ב-525 ננומטר ארבעה יחסי פלורה מטריים כמו זיקית השתמש במערכת הדמיה כפולה כך שניתן ללכוד את התמונות הזהות בו זמנית בשני אורכי גל נפרדים. ניתן להשיג זאת באמצעות מערכת זמינה מסחרית או ביתית המקרינה תמונות כפולות זו לצד זו על המצלמה באופן הבא.

סט מסנן מיקרוסקופ עם מסנן עירור של 440 פלוס מינוס 20 ננומטר ומראה iic מעבר ארוך של 455 ננומטר מסכת תמונה הממוקמת במישור התמונה הראשוני מיד מחוץ ליציאת ההדמיה של המיקרוסקופ שבו חיישן CCD של המצלמה בדרך כלל יושב את סט עדשות הממסר הראשון, במרחק אורך מוקד אחד ממישור התמונה הראשוני כך שהוא אוסף את האור, מראה דיכרואית המפצלת את האור לשני אורכי גל או תעלות הדמיה נפרדות המשקפות צבע אחד תוך העברת מסנני הפליטה האחרים. הגבלה נוספת של האור המועבר לאורכי גל ההדמיה הספציפיים. עדשות הממסר השני, אחת לכל ערוץ הממוקם בנתיבי האלומה כך שהוא ממקד מחדש את האור למישור תמונה שני במצלמת ה-CCD.

זוג מראות ומראה דיכרואית שנייה מכוונים את נתיבי האלומה כך ששתי התמונות משתלבות מחדש ומוקרנות זו לצד זו על המצלמה. חיישן CCD. הנה דוגמה לתמונה המתקבלת.

לאחר ההגדרה, ניתן לכוונן את התמונות ולכוונן אותן באופן הבא, להזיז את מיקום המצלמה כך שהתמונה המועברת תכסה מחצית משדה הראייה של המצלמה. הזז את התמונה המשתקפת כדי לכסות את החצי השני של שדה הראייה על ידי התאמת שתי המראות האחרונות בנתיב האלומה שלה ומטב את המיקוד על ידי הזזת עדשת הממסר השנייה עבור כל ערוץ קדימה ואחורה לאורך נתיב האלומה. לרכוש בעלי חיים המבטאים פלואורופור רגיש לסידן בנוירון המעניין מהמרכז הגנטי Citis או ממקורות אחרים.

לחלופין, לבנות בעלי חיים טרנסגניים באמצעות טכניקות אלגן כלבי ים סטנדרטיות. לאחר מכן השתמש באחת מהטכניקות הבאות כדי לשתק את אלגנטיות האיטום לשיתוק תרופתי ב-0.05% leal עד 2%aros וליצור רפידות aros להדמיה על ידי לחיצה על טיפה של aros מותך בין שתי שקופיות זכוכית שיש בהן שתי חתיכות של סרט מעבדה כמרווחים. לאחר הסרת המגלשה העליונה, בחרו חמישה עד 10 בעלי חיים והעבירו אותם על הכרית.

מכסים את הכרית בהחלקת כיסוי ומורחים כמויות קטנות של תערובת חמה אחד לאחד של שעוות פרפין וג'לי נפט על הפינות כדי להחזיק אותה במקומה. אפשר חמש עד 10 דקות עד שהלמיסול ייכנס לתוקף ובעלי החיים יהיו שקטים לחלוטין. כדי לשתק בעלי חיים בשיטת aros נוקשה, הכינו רפידות של 10% aros.

הוסף כשלושה מיקרוליטר של תמיסת מיקרוספרה מפוליסטירן אחד עד 10 על פני הרפידות ובחר במהירות חמישה עד 10 אלגנטיות ים נקיים לתוך תמיסת בריכת הסלק. מכסים בעדינות עם החלקת כיסוי ומורחים שעווה מותכת על הפינות. ניסויים טיפוסיים דורשים מתן גירוי או מצב ספציפי לבעל החיים תוך הקלטת וידאו של התגובה של תא עצב בודד.

לרכישת סרטונים. לעתים קרובות אנו מצלמים בערך פריים אחד לשנייה עם זמני חשיפה של כ-300 אלפיות השנייה. יש לנתח וידאו כדי למדוד את עוצמת הקרינה עבור כל פריים באזור העניין או החזר ה-ROI של הנוירון המצולם ביחס לאזור רקע קרוב.

תוכנת הניתוח שלנו מציגה תמונה דחוסה של כל התמונות בסרט שממנה נבחר באופן ידני גבול גס המקיף את מושא העניין בכל הפריימים ונבחר אזור רקע עצמאי. עבור הראשון, החזר ROI נבחר באופן ידני מתוך אזור הגבול. עבור כל מסגרת עוקבת, התוכנית בוחרת את הפיקסלים הבהירים ביותר מתוך אזור הגבול כדי ליצור החזר ROI בגודל הנכון עבור תמונות מטריות יחס שנוצרו עם זיקית, בחר החזר ROI גס ואזור רקע דומה עבור כל אחת מהתמונות או הערוצים הכפולים, ולאחר מכן את ההחזר על ההשקעה מתמונה אחת בפריים הראשון, האות הפלואורסצנטי F עבור כל מסגרת מחושב כעוצמת הפיקסלים הממוצעת בהחזר ההשקעה פחות העוצמה הממוצעת באזור הרקע.

רמת הסידן היחסית לכל מסגרת מחושבת כאחוז השינוי בעוצמה המנורמל לערך בסיס התחלתי הנמדד מהמסגרת הראשונה או מסדרת המסגרות הראשונה. ערכי מדד היחס מחושבים כיחס בין שני הערוצים. החזר ROI שנבחר בתוך גוף התא מייצר את האותות החזקים והחזקים ביותר, אך ניתן גם לבחור ולמדוד אותות מהחזר ROI לאורך תהליכי העצבים.

חשיפה לאור עירור עלולה לגרום להלבנה של הפלורה ארבע ומסומנת בירידה מתמדת באות התלויה ברמות החשיפה אם מתרחשת הלבנה. צמצם את זמני החשיפה ו/או את עוצמת העירור עם מסנני צפיפות ניטרלית כדי למזער את הרעש שנוצר מתנועת אלגנטיות הים במהלך ההקלטה. בתגובה לחשיפה לאור וגירויים ניסיוניים, בצע בזהירות את הליכי הקיבוע באמצעות תכשירים נקיים.

לניתוח תמונה מוצלח, בחר אזורי רקע אחידים למדי כהים יותר מהתמונה לנוירון ורחוקים מספיק כדי למנוע אור מפוזר. מוצג כאן אלגנטיות C יחידה, נוירון SJ המבטא מחנה G המגיב לשדה חשמלי חיצוני של שלושה וולט לסנטימטר למשך שלושה ניסויים נפרדים שכל אחד מהם נמשך 10 שניות. החיה הייתה משותקת באמצעות למיסול, אך הסרטון מציג פגמים קלים הן בתנועה והן במיקוד.

עוצמת הקרינה הסחיפה נמדדה בגוף התא. האות חזק למרות תקלות הווידאו המראות עלייה גדולה של כ-250% בקרינה בתגובה לגירוי הראשון והשלישי כאחד. התוצאה מהגירוי השני מופחתת באופן משמעותי.

הדגמת שונות בהלבנת התגובה העצבית היא מינימלית כפי שניתן לראות על ידי החזרה לרמת בסיס עקבית. פגיעה תאית טראומטית מפעילה סידן חולף גדול בתוך תא עצב הממלא תפקיד חיוני בתגובה הפיזיולוגית של התא. סרטון זה מציג את התגובה הנגרמת לנזק שנגרם למעשי סדום בלייזר של תא עצב בודד.

אופטיקה של הדמיה כפולה שימשה כדי להקליט אותות מתעלות הקרינה CFP ו-YFP של מדווח הזיקית. איור זה מציג את אות השריג שנוצר כפי שנמדד בגוף התא במהלך ניסוי ניתוח הלייזר. בתגובה לנזק לייזר ועלייה בסידן הציטופלזמי ב-T שווה לאפס שניות.

ה-CFP יורד במהירות וה-YFP גדל וכתוצאה מכך עלייה מיידית של כ-200% באות מטרי היחס, שנמשך כ-90 שניות לפני שהוא יורד חזרה לרמות הבסיס הקרובות. ההלבנה מינימלית כפי שניתן לראות מקו הבסיס העקבי. איור זה מציג את אות השריג המתקבל כפי שנמדד במקטע האקסון קרוב לנקודת החיתוך כאן.

הכמות המקומית של פלואורו ארבע משתנה במהלך הניסוי. סיבוך ניתוח לייזר האותות חותך את האקסון וקורע לזמן קצר את הממברנה, מאפשר לפלורה ארבע לברוח ומפחית זמנית את הריכוז הציטופלזמי המקומי שלה. זה ניכר מירידה ראשונית בעקבות YFP בנקודות זמן מאוחרות יותר.

הקצה הקטוע מתנפח כחלק מההתאוששות המתמשכת שלו, וכתוצאה מכך פלואורו ארבע מקומי יותר ועלייה בעוצמה. זה ניכר ביותר בעקבות CFP הגדל לאט, עם זאת, וריאציות אלו משפיעות על שני הערוצים באופן שווה ויחס השריג מפצה ביעילות על מתן אות חזק. המדידה שהתקבלה מראה תגובה דומה לגוף התא עם עלייה מיידית של כ-150% באות, התאוששות דרמטית לכמעט קו הבסיס בכ-90 שניות, ולאחר מכן תגובה משנית נוספת קטנה יותר בכ-150 שניות.

אביזרי מיקרוסקופ מסחריים להדמיה מטרית ביחס זמינים, כמו גם תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת יותר המייצרת מדידות מטריות של יחס פיקסל אחר פיקסל לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקות אלה בקלות יחסית וללא טכניקות חיתוך רקמות או הדמיה מסובכות הנדרשות על ידי מערכות או שיטות מודל אחרות. ניתן להריץ ניסויים שלמים תוך שעה או שעתיים אם הם מבוצעים כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשתק את האלגנטיות להדמיה, לבצע עותק וידאו מקסימלי על נוירונים בודדים in vivo, ולנתח את הסרטון המתקבל כדי למדוד רמות סידן יחסיות על סמך הנוירון.