Name: הקמת Entomopathogens פטרייתיים כEndophytes: לקראת ההדברה ביולוגית Endophytic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: למד שתי שיטות הדברה ביולוגית באמצעות Beauveria bassiana כאנדופיט בפול הקטני. השיטות מספקות הגנה מפני מזיקים חקלאיים ותורמות לחקלאות ברת-קיימא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הייצור והעבודה הניסויית שהוצגו במסמך זה משקפים את עזרתו המסורה והנלהבת של רינאלדו Pareja. ממומן על ידי המחלקה המנהלית של קולומביה למדע, הטכנולוגיה והחדשנות (Colciencias) ועל ידי מענק מקרן ביל ומלינדה גייטס ביוזמת חקירות האתגרים הגדולה.

1. צמחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Surface-לעקר זרעי שעועית (cv. Calima) על ידי טבילתם במשך שתי דקות ב0.5% נתרן היפוכלוריט ושתי דקות באתנול 70%. יש לשטוף השלוש פעמי הזרעים במים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ההצלחה שלך על ידי עיקור ציפוי 100 μl של מי השטיפה האחרונה על אגר תקשורת dextroxe תפוחי אדמה (PDA), ודוגר הצלחת במשך 10 ימים ב 25 ° C. להפסיק ולהפעיל מחדש את הניסוי אם כל צמיחה נראית על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע את הזרעים בקבוצות של שלושה בסירים המכילים תערובת סטרילית של אדמה וחול ב2:1. להעביר את הסירים לחדר צמיחה ב 25 ° C, CA. 50% לחות יחסית והשעות photoperiod 12. שבוע לאחר נביטה, לחסל את שני שתילים הנמרצים לפחות. מים כל 2-3 ימים עם מים מזוקקים סטריליים ולהפרות 10 ו 20 ימים לאחר השתילה בתמיסת 6 גרמה / ליטר מים של דשן NPK 15-15-15. </li></ol> 2. פטרייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג commerניסוח סוציאלי של Beauveria bassiana מתח GHA (Mycotrol SE, Laverlam, קאלי, קולומביה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור תרבות מנייה יחידה נבג, להשעות CA. 1 inoculating לולאה מלאה של נבגים ב1 מ&quot;ל של 0.1% תמיסת מים של טריטון X-100 ומערבולת עבור 10 שניות. ואז, 100 μl הצלחת של ההשעיה על אגרת 2.5% נובל ודגירה במשך 24 שעות ב 25 ° C. העברת conidium נובט יחידה לתוך PDA 100 מ&quot;מ צלחת המכיל ולגדול עד שמכסה את כל הצלחת (3-4 שבועות בקירוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים, לגרד את צמיחת הפטרייה מפני השטח של המדיום ולהשעות אותו ב0.1% סטרילי מ&quot;ל 10 טריטון X-100. מערבולת במשך דקה אחת. לאחר מכן, מסנן את ההשעיה דרך גזה סטרילית להסרת עובש ולקבל השעית המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hemocytometer להעריך את ריכוז הנבגים של השעית המניות. כדי להקל על ספירת נבגים, להכין דילול סדרתי 10,000 כפול של המניות, בכל פעם העברת 100 o μlו השעית נבגים ב900 μl של 0.1% טריטון X-100, וvortexing ל10 שניות לפני הדילול הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיק את הבידוד, להתאים את השעית המנייה לריכוז סופי של 10 8 נבגים / מ&quot;ל, תוך שימוש בנוסחא: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="משוואה 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך את הכדאיות, 100 μl צלחת נבגים של הדילול 10,000 פי אגר על 2.5% נובל ודגירה במשך 24 שעות ב 25 ° C. לאחר מכן, לבחון שלוש קבוצות אקראיות של 100 נבגים כדי להעריך נביטת אחוזים. שקול conidium מונבט כאשר חיידק צינור גלוי יותר ממחצית הקוטר של פרויקטי conidium ממנו. להשתמש רק בהשעיה כאשר נביטת האחוזים הממוצעת עולה על 90%. </li></ol> 3. התחסנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן צמחים כשהם מגיעים לשלב הראשון שלהם האמיתי העלה (14 ימים בקירוב לאחר שתילה). צמחי מים לאדמה עם קיבולת סטרילי לזקק24 שעתי מי אד לפני חיסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטת ריסוס עלים, להשתמש מרסס ידני כדי להחיל השעית הנבגים (טיפול) או 0.1% טריטון X-100 (שליטה) על פני שטח adaxial (העליון) של עלים עד שהם מגיעים רוויה. לכסות את החלק העליון של הסיר בנייר אלומיניום, כדי למנוע ניגר נבגים לאדמה. לאחר הריסוס, כיסוי צמחים בשקית ניילון למשך 24 שעות כדי לשמור על רמה גבוהה של לחות להקל פלישה פטרייתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטה להציף אדמה, השתמש גליל סיים ליישם 10 מ&quot;ל של השעית נבגים (טיפול) או 0.1% טריטון X-100 (שליטה) על פני השטח של הקרקע בבסיס הצמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיסונים, יחזור צמחים לתאי צמיחת סידורן בעיצוב בלוק שלם אקראי. לא פחות מארבעה בלוקים ניסיוניים נוספים צריכים להיות מותקנים כדי לאפשר הערכות של גידול צמחים, בנוסף להערכות של קולוניזציה endophytic, באותו הניסוי. </li></ol> 4. עיבלuations <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ניסוי בלוק אחד בכל פעם, הבחירה בלוקים בסדר אקראי. הדבר חשוב במיוחד לניסויים גדולים שלא ניתן להעריכם ביום אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עיבוד צמח, למדוד ולתעד את שיאו מבסיס לקודקוד meristem. ואז, בזהירות ולעקור שטוף היטב במים זורמים מברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכל צמח, מדגם שני עלונים, שתי פיסות השורש ושתי חתיכות של גזע. בחר דגימות כרוז באופן אקראי מהעלה האמיתי הראשון של הצמח. ואז, להשיג שתי דגימות גזע, 3 סנטימטרים כל אחד, ארוך, מאמצע הצמח ומליד פני הקרקע. לבסוף, להשיג שני מדגם שורש, גם 3 סנטימטר באורך כל אחת, מהאמצע ומהשורש 1 סנטימטר מאחורי קצה השורש. מניח את הדגימות בשלוש שקיות נייר נפרדות ותווית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה ודגימה כל הצמחים בבלוק, להתחיל בעיבוד העלים, אז שורשים, ולבסוף את הגבעולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח לא לעקרסוגיות בברדס זרימה למינרית סטרילי כמו ב1.1, לעיל. יש לשטוף את כל דגימה שלוש פעמים על ידי טבילה במים מזוקקים סטריליים ולתת לו להתייבש בנייר המגבת סטרילית. לאחר מכן, לנתח ולהשליך קצוות החיצוניים שלה, שבו אפשר היה לחסל endophytes תוצאה ממגע עם חומרי חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את המדגם הגזוז לשישה חלקים, עם ממוצע של מ&quot;מ 6x6 לעלים ול6 מ&quot;מ באורכם גבעולים ושורשים. צלחת השישה הסעיפים על צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם תקשורת מחשבי כף יד והשלמה עם טטרציקלין האנטיביוטיקה, סטרפטומיצין ופניצילין בכל 2 מ&quot;ג / ליטר. לאטום את הצלחת עם parafilm ודגירה בחושך ב 25 ° C. כל צמח המניב 6 צלחות, חלק שני במפעל ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את מי שטיפה לאחר העיבוד כל בלוק של חלק צמח נתון. לפני השלכת השתמשה במים, שטיפת צלחת מדגם μl 100 בתקשורת ומחשבי כף יד אינקובטורים במשך 10 ימים ב 25 ° C כדי להעריך את הצלחת עיקור. אם צמיחת פטרייה מתפתחת, לא מחשיבים את הדגימות המתאימות לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הצלחות כל 2-3 ימים במשך 20 ימים כדי לצפות ולהקליט צמיחת פטרייה. חלקי צמח בלו והעברה מפגינים נוכחות endophytes פטריות לצלחות המכילות PDA טרי. זה ימנע זיהום של חלקי צמחים השכנים בצלחת המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא ב &#39; צמיחת bassiana מחלקי צמח. Beauveria bassiana ניתן לזהות על ידי mycelia הצפוף האופייני לבן הופך לקרם צהוב בהירה בקצה. במקרה של ספק, לעגן את הדגימה בטיפת מים ולבדוק תחת מיקרוסקופ, מחפש globose נבגים ונבגים בצורה זגזגה, אופייניים למין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוקים ניסיוניים נוספים כדי להעריך את ההשפעה של הטיפולים בביומסה במפעל. ראשית, למדוד את הגובה שלהם מהבסיס לראש meristem הקודקוד. ואז, בזהירות ולעקור צמחים לשטוף במים ברז ולייבש אותו על 45 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים כדי לקבוע המשקל היבש שלהם. </li></ol>

<ol><li>Vega, F. E., Meyling, N. V., Luangsa-ard, J. J., Blackwell, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVega%2C+FE+%22Fungal+entomopathogens+in+Insect+Pathology%22">Fungal entomopathogens in Insect Pathology</a>. Vega, F. E., Kaya, H. K. , Elsevier. San Diego. 171-220 (2012).</li>
<li>Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathology+and+fungal+endophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Insect pathology and fungal endophytes.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 277-279 (2008).</li>
<li>Sasan, R. K., Bidochka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect-pathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii+%28Clavicipitaceae%29+is+also+an+endophyte+that+stimulates+plant+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+botany%22%5BJournal%5D)">The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii (Clavicipitaceae) is also an endophyte that stimulates plant root development.</a> American journal of botany. 99, 101-107 (2012).</li>
<li>Elena, G. J., Beatriz, P. J., Alejandro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+%28Metschnikoff%29+Sorokin+promotes+growth+and+has+endophytic+activity+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+biological+research%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants.</a> Advances in biological research. 5, 22-27 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%29+by+endophytic+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Suppression of Ostrinia nubilalis (Hübner)(Lepidoptera: Pyralidae) by endophytic Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin.</a> Environmental entomology. 20, 1207-1211 (1991).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Beauveria+bassiana+in+banana+%28Musa+spp.%29+reduces+banana+weevil+%28Cosmopolites+sordidus%29+fitness+and+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Beauveria bassiana in banana (Musa spp.) reduces banana weevil (Cosmopolites sordidus) fitness and damage.</a> Crop protection. 27, 1437-1441 (2008).</li>
<li>Gurulingappa, P., Sword, G. A., Murdoch, G., McGee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+crop+plants+by+fungal+entomopathogens+and+their+effects+on+two+insect+pests+when+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests when in planta.</a> Biological. 55, 34-41 (2010).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+endophytic+Beauveria+bassiana+on+populations+of+the+banana+weevil%2C+Cosmopolites+sordidus%2C+and+their+damage+in+tissue-cultured+banana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+experimentalis+et+applicata%22%5BJournal%5D)">Effect of endophytic Beauveria bassiana on populations of the banana weevil, Cosmopolites sordidus, and their damage in tissue-cultured banana plants.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 129, 157-165 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana%3A+Endophytic+colonization+and+plant+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana: Endophytic colonization and plant disease control.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 267-270 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., Gwinn, K. D., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+fungal+entomopathogens+with+activity+against+plant+pathogens%3A+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution.</a> BioControl. 55, 113-128 (2010).</li>
<li>Akello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+as+an+endophyte+in+tissue+culture+banana+%28Musa+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin as an endophyte in tissue culture banana (Musa spp.).</a> Journal of invertebrate pathology. 96, 34-42 (2007).</li>
<li>Gómez-Vidal, S., Lopez-Llorca, L. V., Jansson, H. B., Salinas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonization+of+date+palm+%28Phoenix+dactylifera+L.%29+leaves+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonization of date palm (Phoenix dactylifera L.) leaves by entomopathogenic fungi.</a> Micron. 37, 624-632 (2006).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+in+cocoa+seedlings+%28Theobroma+cacao%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte in cocoa seedlings (Theobroma cacao).</a> Mycologia. 97, 1195-1200 (2005).</li>
<li>Tefera, T., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inoculation+method+and+plant+growth+medium+on+endophytic+colonization+of+sorghum+by+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Effect of inoculation method and plant growth medium on endophytic colonization of sorghum by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana.</a> BioControl. 54, 663-669 (2009).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+and+colonization+of+coffee+seedlings+%28Coffea+arabica+L.%29+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoscience%22%5BJournal%5D)">Inoculation and colonization of coffee seedlings (Coffea arabica L.) with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales.</a> Mycoscience. 47, 284-289 (2006).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Beauveria+bassiana+dose+and+exposure+duration+on+colonization+and+growth+of+tissue+cultured+banana+%28Musa+sp.%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">The effects of Beauveria bassiana dose and exposure duration on colonization and growth of tissue cultured banana (Musa sp.) plants.</a> Biological. 49, 6-10 (2009).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+research%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Mycological research. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Brownbridge, M., Reay, S. D., Nelson, T. L., Glare, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+following+inoculation+of+radiata+pine+seed+and+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+control%22%5BJournal%5D)">Persistence of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte following inoculation of radiata pine seed and seedlings.</a> Biological control. 61, 194-200 (2012).</li>
<li>Posada, F. J., Chaves, F. C., Gianfagna, T. J., Pava-Ripoll, M., Hebbar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+an+endophyte+in+cocoa+pods+%28Theobroma+cacao+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+U.D.C.A.+actualidad+%26+divulgaci%C3%B3n+cient%C3%ADfica%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as an endophyte in cocoa pods (Theobroma cacao L.).</a> Revista U.D.C.A. actualidad & divulgación científica. 13, 71-78 (2010).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Landa, B. B., Muñoz-Ledesma, J., Jiménez-Díaz, R. M., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonisation+of+opium+poppy%2C+Papaver+somniferum%2C+by+an+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonisation of opium poppy, Papaver somniferum, by an entomopathogenic Beauveria bassiana strain.</a> Mycopathologia. 161, 323-329 (2006).</li>
<li>Biswas, C., Dey, P., Satpathy, S., Satya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+a+season+long+endophyte+in+jute+%28Corchorus+olitorius%29+and+its+rapid+detection+using+SCAR+marker%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as a season long endophyte in jute (Corchorus olitorius) and its rapid detection using SCAR marker.</a> BioControl. , 1-7 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystems+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (Hübner).</a> Agriculture, ecosystems & environment. 45, 147-156 (1993).</li>
<li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li>
<li>Reddy, N. P., Ali Khan, A. P., Devi, U. K., Sharma, H. C., Reineke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+millet+crop+plant+%28Sorghum+bicolor%29+with+the+entomopathogenic+fungus+%28Beauveria+bassiana%29+to+combat+infestation+by+the+stem+borer%2C+Chilo+partellus+Swinhoe+%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Asia+Pacific%22%5BJournal%5D)">Treatment of millet crop plant (Sorghum bicolor) with the entomopathogenic fungus (Beauveria bassiana) to combat infestation by the stem borer, Chilo partellus Swinhoe (Lepidoptera: Pyralidae.</a> Journal of Asia Pacific. 12, 221(2009).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Muñoz-Ledesma, F. J., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+protection+of+Papaver+somniferum+L.+against+Iraella+luteipes+%28Hymenoptera%3A+Cynipidae%29+by+an+endophytic+strain+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Systemic protection of Papaver somniferum L. against Iraella luteipes (Hymenoptera: Cynipidae) by an endophytic strain of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Environmental entomology. 38, 723-730 (2009).</li>
<li>Cherry, A. J., Banito, A., Djegui, D., Lomer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+stem-borer+Sesamia+calamistis+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29+in+maize+following+seed+dressing%2C+topical+application+and+stem+injection+with+African+isolates+of+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pest+management%22%5BJournal%5D)">Suppression of the stem-borer Sesamia calamistis (Lepidoptera; Noctuidae) in maize following seed dressing, topical application and stem injection with African isolates of Beauveria bassiana.</a> International journal of pest management. 50, 67-73 (2004).</li>
<li>Gurulingappa, P., McGee, P. A., Sword, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Lecanicillium+lecanii+and+Beauveria+bassiana+reduce+the+survival+and+fecundity+of+Aphis+gossypii+following+contact+with+conidia+and+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Lecanicillium lecanii and Beauveria bassiana reduce the survival and fecundity of Aphis gossypii following contact with conidia and secondary metabolites.</a> Crop protection. 30, 349-353 (2011).</li>
<li>van Schoonhoven, A., Voysest, O. Common beans in Latin America and their constraints in Bean production problems in the tropics. Schwartz, H. F., Pastor-Corrales, M. A. , Second, CIAT. Cali. 33-57 (1989).</li>
<li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+and+no-choice+assays+for+testing+the+resistance+of+A.+thaliana+to+chewing+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Choice and no-choice assays for testing the resistance of A. thaliana to chewing insects.</a> J. Vis. Exp. (15), e683(2008).</li>
<li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms%3A+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047(2011).</li>
<li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה הספציפית של ניסוי להקמת entomopathogen פטרייתי כendophyte. התוצאות שלנו מראות את שיטת החיסון היא אחד מהם. גורמים ביולוגיים לניסוי עם כוללים מיני גידולים או זנים שנבחרו ומתח המינים entomopathogen פטרייתי או לבודד שימוש. גורמים נוספים לשקול מניפולציה כוללים ריכוז של הבידוד, גיל הצמח בחיסונים, ותנאים של גידול הצמחים. זה יהיה אידיאלי לשיטת חיסון להביא לקולוניזציה צמח המערכתית ידי 14,17,18,21 entomopathogen פטרייתי. במקום זאת, נראה כי שיטות חיסון נוטות לטובת דפוס מסוים של התישבות מקומית. בקפה, למשל, תרסיסי foliar להעדיף התישבות עלה בעוד מספיג אדמה להעדיף התישבות שורש 17. אנחנו מצאנו אותו הדפוס בשעועית המשותפת. סופו של דבר, הבחירה של שיטת חיסון צריכה להיותמונחה על ידי המיקום המיועד של endophyte בתוך מפעל, ככל הנראה התאמת הנישה של אוכלי עשב היעד או פתוגן צמח. למרות זיהוי נפוץ, endophyte וכימות מבוסס על תרבויות תקשורת יכולים להיות יקר, קשים ונוטים שגיאות. לדוגמה, בסך של 10,800 חלקי צמח (מצופה על צלחות פטר 1800) הוערך בניסוי כדי לייעל B. חיסוני bassiana על 16 בננות. מתוך אלה, 4496 סעיפים היו קולוניה ב משוער bassiana, כפי שזוהה בעיקר על ידי מורפולוגיה מושבה. ברור, אימות מיקרוסקופית של המין אנושי לכל מושבה הייתה צעד רצוי אך להרשות לעצמה. מצד השני, 1176 סעיפים היו מיושבים על ידי פטריות אחרות ונזרקו ומטופל כחסרי נתונים 16. ההסתברות קיימת, עם זאת, כי ב &#39; bassiana היה מתחרה גרוע או איטי לגדול, וסופו של דבר היה יכול להופיע מסעיפים אלה, אםמספיק זמן llowed. לכן, שיטות זיהוי endophyte מבוססות על תרבויות תקשורת כפופות לתוצאות חיוביות שגויות ושליליים שווא. בהתאם לכך, הפיתוח של זיהוי אמין יותר ושיטות כימות, למשל אלה המבוססים על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מבחנים 20,21,24, מוצדק היטב. המטרה הסופית של ניסויי חיסון צריכה להיות כדי לפתח טיפול יעיל המספק התנגדות מערכתית עמידה נגד תזונה צמחונית ו / או מחלה. סביר, אבל עדיין לא נבדק, השערה היא כי היקף התישבות endophytic צריך מיתאם חיובי עם המידה של התנגדות endophyte בתיווך. צעד טבעי הבא לאחר זיקוק שיטות חיסון, ולכן, יכול להיות לבחינת המתאם הזה. כמה פרוטוקולי וידאו יכולים לעזור לחוקרים לתכנן assay התנגדות מתאימה למזיקי יעד או פתוגן 29-31. סופו של דבר, היא זו בדיקה שתקבע את ההצלחה של inoculaשיטת tion, והפוטנציאל הקשורים לבקרה ביולוגית endophytic.

entomopathogens פטרייתיים הם רגולטורים חשובים של אוכלוסיות חרקים בעלי פוטנציאל רב כמו 1 mycopesticides. רק לאחרונה, עם זאת, יש לי entomopathogens פטרייתיים הוכח להתרחש כendophytes, הוא באופן טבעי ובתגובה לשיטות חיסון שונות 2. התפקוד האקולוגי של entomopathogens פטרייתיים endophytic נותר במידה רבה בלתי ידוע, אך מספר מחקרים מעורבים אותם בגידול צמחים 3,4, התנגדות אוכלי עשב 5-8, ועמידות למחלות 9,10. המטרה הכוללת של השיטות שהוצגו כאן היא להציג entomopathogen פטרייתי כendophyte, כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) הוא entomopathogen ביותר למד endophytic פטרייתי 5-9,11-19, והוא זמין כmycopesticide מסחרי. שיטות חיסון נבדקו כדי להקים <eמ &#39;&gt; ב&#39; bassiana כendophyte כולל מספיג אדמת 14,17, ציפוי זרעים 18 והתעמקות 14, תחבושות radicle 13,15, שורש וקנה שורש התעמקות 11,16,18, גזע 17 זריקות, תרסיסי foliar 14,17,20 ותרסיסי פרחי 19. שימוש בשיטות אלה, חוקרים הציגו ב bassiana ל11 בננה, 7 שעועית, 13 קקאו, קפה 17, תירס 7, 7 כותנה, תמרים 12, יוטה 21, פרג אופיום 20, דלעת 7, radiata 18 אורן, סורגום 14, 7 ו 7 עגבניות חיטה. הראיות האחרונות עולות כי ב endophytic bassiana יש פוטנציאל להגן על צמחים מפני מזיקים לא רק חרקים 5-7,22-27, אלא גם מכמה פתוגנים צמח 9. השעועית מצויה (Phaseolus vulgaris) מדרגת בין גידולים לפגיעים ביותר למזיקיםומחלות. זה יכול להיות מושפע על ידי יותר מ 400 מזיקים ופתוגנים 200, התקפה שנחשב לגורם ייצור השעועית המגבילה ביותר על פני 28 אזורים. בהתאם לכך, השעועית המשותפת עשויה להיות יבול מודל מצוין לבחון את מלוא הספקטרום של הדברה ביולוגית endophytic ידי B. bassiana. כצעד ראשון בכיוון זה, מאמר זה מתאר תרסיסי foliar ומתיז על קרקע כשיטות חיסון להציג B.bassiana כendophyte בשעועית המשותפת.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>שם המגיב / חומר</td><td>מספר</td><td></td><td>קטלוגי של החברה</td></tr><tr><td>מיקוטרול SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>אגר אצילי</td><td>סיגמא</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G מלח נתרן</td><td>סיגמא</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ)</td> <td>פישר</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (60 x 15 מ"מ)</td><td>פישר</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>תפוחי אדמה דקסטרוז אגר</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה רגילה (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מלח סטרפטומיצין סולפט</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סיגמא</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>חבוש משולש (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>פישר</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת entomopathogens פטרייתיים כendophytes: לקראת ההדברה ביולוגית endophytic

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana הוא entomopathogen פטרייה עם היכולת ליישב צמחי endophytically. כendophyte, B. bassiana עשוי לשחק תפקיד בהגנת צמחים מתזונה צמחונית ומחלה. פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להקמת B. bassiana endophytically בשעועית מצויה (Phaseolus vulgaris), כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic. צמחים גדלים מזרעי קרקע מעוקרת במשך שבועות לפני שקבל ב &#39; טיפול bassiana של 10 8 נבגים / מ&quot;ל (או מים) מיושם גם כתרסיס עלים או אדמה להציף. שבועות לאחר מכן, את הצמחים נקטפים והעלים, גבעוליהם והשורשים נדגמים להעריך קולוניזציה פטרייתי endophytic. לשם כך, דגימות בנפרד משטח מעוקרות, חתוכים למקטעים מרובים, וטופחו בתקשורת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה במשך 20 ימים. התקשורת נבדקת כל 2-3 ימים להתבונן צמיחת פטרייה כsociated עם חלקי צמח ולהקליט את המופע של B. bassiana לאמוד את ההיקף של קולוניזציה endophytic. אנליזות של הצלחת חיסון להשוות את המופע של B. bassiana בתוך חלק צמח נתון (כלומר עלים, גבעולים או שורשים) על פני טיפולים ובקרות. בנוסף לשיטת החיסון, תוצאה המסוימת של הניסוי עשויה להיות תלויה במגוון מינים או חיתוך היעד, מין entomopathogen פטרייתיים להתאמץ או לבודד שימוש, ותנאים של גידול הצמחים.

ב bassiana הצליח endophytically-ליישב פ vulgaris בתגובה לטיפולי החיסון הפגין (איור 1). שני תרסיסי foliar ומתיז על הקרקע הביאו להתישבות endophytic ידי B. bassiana במעל 80% מהמפעלים שטופלו (איור 2). עם זאת, היקף ההתישבות תלויה בחלק הצמח העריך ואת שיטת החיסון בשימוש. עלים הגיבו טובים לחיסוני תרסיס. שורשים, לעומת זאת, הגיבו רק לחיסונים מספיגים. לבסוף, גבעולים הגיבו באופן דומה לשני שיטות החיסון. B. bassiana לא זוהה בכל אחד מחלקי צמחי הבקרה. בלתי תלוי בטיפול, endophytes האחר מאשר B. bassiana גדל מ 15% מסעיפי הצמחים המוערכים, אך הם נותחו יצאו מצלחות תקשורת לפני שהם יכולים לפלוש לחלקים שכנים ולהשפיע על התוצאות. מתקני טיפול ובקרה היו נבדלו בעליל שבועות לאחר חיסון. שום הבדל לא זוהה במשקל היבש שלהם ובגובה שלהם. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. נציג תוצאות של טיפולי חיסון על הקולוניזציה endophytic של צמחי שעועית (Phaseolus vulgaris קורות החיים Calima.) על ידי Beauveria bassiana למעלה משמאל:. בקרת צלחות ללא צמיחה. למעלה מימין: endophyte פטרייה מסעיף מפעל מזהם את כל צלחת. למטה משמאל: ב &#39; bassiana גובר משני חלקי צמח. Endophytic ב: ימני תחתון bassiana נבגים ונבגים כפי שניתן לראות במיקרוסקופ. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> איור 2. השפעת הטיפולים על חיסון קולוניזציה endophytic של ביהצמחי n (Phaseolus vulgaris קורות חיים. Calima) על ידי Beauveria bassiana, שבועות לאחר חיסונים עם GHA המתח. קולוניזציה אחוזים מייצגים את מספר חלקי צמח יישבו מחולקים במספר הסעיפים בתרבית.

פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להציג entomopathogen פטרייתי<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; כendophyte בשעועית המשותפת (<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt;), כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic.

הקמת Entomopathogens פטרייתיים כEndophytes: לקראת ההדברה ביולוגית Endophytic

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

שלום. שמי Ush Parsa ואני אנטומולוג ב-SEA במרכז הבינלאומי לחקלאות טרופית. אני ViiV Artiz, גם מהמרכז הבינלאומי לחקלאות טרופית, ואני Fernando Vega ממשרד החקלאות של ארצות הברית. המטרה הכללית של סרטון זה היא להדגים כיצד להקל ולאמת את ביסוסו של פטרייה כפתוגן.כאנדופיט, נפוץ למצוא בטבע חרק או קרצייה שנדבקו בפטרייה פתוגנית, וישנו היסטוריה ארוכה של שימוש בפתוגנים פטרייתיים אלו כהדברה ביולוגית. לאחרונה, פתוגנים פטרייתיים נמצאו לעיתים מדביקים צמחים, אך ללא הפקת תסמינים גלויים לנוכחותם. תגלית זו מרמזת על הפוטנציאל שלהם לשימוש כאנדופיטים מגנים מפני מזיקי חקלאות.כדי לבחון פוטנציאל זה, חיוני תחילה לפתח שיטת הדבקה המקימה באופן מהימן פטריית פתוגנית כאנדופיט בגידול מטרה. B Bassiana היא אחת הפטריות הפתוגניות הנחקרות ביותר, והיא זמינה בקלות כמוצר מסחרי כהדברה חקלאית. פטרייה זו זוהתה כאנדופיט במיני צמחים רבים, כולל בננות, קפה ומייס.ראיות אחרונות העלו כי ל-B bassiana יש פוטנציאל להגן על צמחים לא רק מפני מזיקים מדור הארטרופודים, אלא גם מפני פתוגנים מסוימים של צמחים. המנגנונים המסבירים הגנה רחבה זו אינם מובנים דיו. עדיין באזור השסתום הטיקי, הדבר עשוי להבטיח פתרונות עבור גידולים החסרים עמידות גנטית למזיק או לפתוגן, אך עבור גידולים הסובלים בדרך כלל מתקיפה סימולטנית של אויבים מרובים, כאשר fas vulgaris הוא דוגמה מובהקת לכך.הוא עשוי להיפגע מיותר מ-400 מזיקים ו-200 פתוגנים, שמתקפתם נחשבת לגורם המגביל ביותר בייצור שעועית באזורים שונים. מסיבה זו, אנו סבורים כי השעועית הנפוצה עשויה להיות גידול מועמד טוב לבחינת פוטנציאל ההגנה של Endo bbar. כשלב ראשון בכיוון זה, Arvid מדגים את יעילותם של ריסוסים על העלים והשקיה של הקרקב כשיטות הדבקה להבאת Bana כאלנדופיט.זרעי שעועית נפוצה מזן TOMA עוברים עיקור שטח באמצעות טבילה למשך שתי דקות ב-0.5% sodium hypochlorite, ולאחריה טבילה למשך שתי דקות ב-70% ethanol ושלושה שטיפות במים מזוקקים סטריליים כדי להבטיח את הצלחת העיקור. דגימה של 100 µL ממי השטיפה נזרעה בצלחת פטרי של 100 mm עם מצע PDA ודגרה בחושך למשך 10 ימים ב-25 °C. יש להפסיק את הניסוי ולהתחיל אותו מחדש אם נראה גדילה בביקרות אלו.זרעים נזרעים בקבוצות של שלושה בעציצים ברוחב 11.5 centimeters, המכילים תערובת של אדמה וחול ביחס של שניים לאחד שעברה סטריליזציה באדים. הצמחים גדלים בתנאים מבוקרים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, 50% relative humidity ומחזור תאורה של 12 שעות עם עוצמת אור של 9, 200 lux שבוע לאחר הנבטה. הצמחים נדישים לאחד לכל עציץ כדי להבטיח חיוניות ולמנוע תחרות.הם מושקים לפי הצורך מדי יומיים עד שלושה, ומדשנים 10 ו-20 ימים לאחר השתילה באמצעות תמיסה של דשן NPK בריכוז שש גרם לליטר מים. כדי להבטיח אחידות גנטית של הפטריות שלנו, יש לגדל את האיזולטים מתרביות קנדיות בודדות. אם מקור הפטרייה הוא חרק עם מיקוזה, אנו מעבירים את הדגימה למנדף זרימה למינרית ומשתמשים בלולאת הזרקה כדי להעביר דגימה קטנה של פטרייה Sporulating DYS למצע PDA.ייתכן שיהיה צורך בהעברות נוספות לצלחות מצע חדשות כדי להסיר מזהמים לאחר שפטריית מטרה גדלה ומתפשטת בתרבית נקייה. דגימה קטנה של מצע מושעת ב-1 milliliter של תמיסת מים 0.1% של Triton X 100 ועוברת ערבוב במערבל Vortex; Triton X 100 הוא חומר פעיל שפטיים (surfactant) המפחית את מתח הפנים של המים ומאפשר למצע להתפזר. מנה של 100 microliter מתליה זו נמרחת על צלחת פטרי של 100 millimeter המכילה שכבה דקה של 2.5% agarose, מה שיאפשר ויזואליזציה של המצע תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.מדגרה של הפיתח מתבצעת בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות בחושך, ולאחר מכן מועבר מצע הנבטה בודד אל פיתח המצע עם PDA ומושאר לצמוח במשך שלושה עד ארבעה שבועות עד אשר הוא מכסה את כל פיתח המצע ויוצר ספורולציה. שיטה זו מספקת תרבית טהורה של הפטרייה לצורך ניסויים עוקבים. לצורך הדגמה זו, אנו משתמשים בתרבית טהורה של Bavaria Bassiana, זן GH HA, שהושג מהמוצר המסחרי Microt.האינוקולום מכינים בתנאים סטריליים. תחת מנף זרימה למינרית, משתמשים בשפכטל סטרילי כדי לגרד כגרם אחד של גידול פטרייתי מפני השטח של המצע, וסוחפים אותו ב-10 milliliters של 0.1%Triton X סטרילי. את התמיה מערבלים במכשיר וורטקס למשך דקה אחת ומסננים דרך בד גזה סטרילי כדי להפריד את ה-canadia מה-Hy-Vee. שלב זה מניב תמיחת תאים שיש להתאימה לריכוז סופי של 10⁸ kedia למיליליטר לצורך האינוקולציה.ראשית, ריכוז תמיסת המקור נאמד באמצעות דילול סדרתי המקל על ספירת ה-kedia. ב-Hema Cytometer, מדללים 100 microliters של תמיסת המקור ב-900 microliters של 0.1%Triton X ומערבלים ב-vortex לקבלת דילול של 1:10. הפעולה חוזרת באופן סדרתי שלוש פעמים נוספות כדי להגיע לדילול של 1:10,000.ה-Kedia יהיה נוכח במספרים גבוהים ביותר בדילול הראשון ובמספרים נמוכים שניתן לספור בקלות בדילול האחרון. כל אחת משתי התאים של ה-Hema cytometer נטענת עם 10 µL של דילול של 1 ל-10,000 ומוצבת תחת מיקרוסקופ לצורך ספירת ה-kedia. השטח המסומן של ה-Hema Cytometer מורכב מתשעה ריבועים גדולים, שכל אחד מהם מכיל 100 nL או 0.0001 mL בהתאמה.כדי להעריך את ריכוז ה-ED בדגימה, אנו סופרים ומחשבים את הממוצע של ה-ED בארבעת הריבועים הגדולים בפינות של כל תא, ומחלקים ממוצע זה ב-0.0001. הכפלת ריכוז זה במקדם הדילול שלנו, 10,000, נותנת את ריכוז תמיסת המקור; כעת נחשב את הנפח הסופי אליו יש להתאים את תמיסת המקור. כדי לקבל אינוקולום של 10 38 edia למיליליטר, נשתמש בנוסחה.הנפח הסופי שווה לנפח המלאי כפול ריכוז המלאי חלקי הריכוז הסופי. בהדגמה שלנו, יש להתאים את המלאי לנפח סופי של 195.5 milliliters כדי להגיע לריכוז הרצוי. לפני השימוש באינוקולום, חשוב לבצע בדיקת נבטות להערכת חיות התעלות.בבדיקה זו, נניח 100 µL של דילול של 1:10,000 על צלחת פטרי של 100 mm עם 2.5% noble egg או מצע גידול. יש לפרוס את הדגימה על פני השטח של המצע באמצעות מקל זכוכית סטרילי ולהדגיר בחשכה בטמפרטורה של 25 °C למשך 24 שעות. את החיוניות יעריכו תחת מיקרוסקופ על ידי אומדן אחוז ה-kedia עם צינור נבט גדל.עבור שלוש דגימות אקראיות של 100 נבגים של Canadian, ניתן להשתמש בתרחיף ה-Canadian להדבקה רק אם אחוזי הנביטה הממוצעים הם מעל 90%. בהדגמה זו, מצאנו נביטה ממוצעת של 97%. נדגים שתי שיטות הדבקה, ריסוס על העלים והשקיה של הקרקע, ששתיהן מיושמות כאשר הצמחים מגיעים לשלב העלה האמיתי הראשון. כ-14 ימים לאחר השתילה, שיטת הריסוס על העלים מבוצעת באמצעות מרסס ידני המכוון את התרחיף אל פני השטח התחתונים או העליונים של העלים עד להשבעתם. חלקו העליון של כל עציץ מכוסה בנייר אלומיניום כדי למנוע נזילת תרחיף אל הקרקע. לאחר הריסוס, כל צמח מכוסה בשקית פלסטיק למשך 24 שעות כדי לשמור על רמות לחות גבוהות המקלות על חדירת הפטרייה.שיטת ההדבקה באמצעות השקיית השורשים (soil drench) מבוצעת בקיבולת המים של הקרקע. כ-24 שעות לאחר השקיית הצמחים עד לרוויה, מתיליים 10 milliliters של תרחיף תאים על פני שטח הקרקע. צמחים בקבוצת הביקורת מקבלים בבסיסם תמיסת 0.1%Tritton X סטרילית, המיושמת באותה דרך כפי שבוצע בטיפולים המקבילים.הצמחים מוחזרים לתאי גידול ומסודרים בתכנון בלוקים אקראי מלא עם שלושה חזרות לכל טיפול. הערכנו את ההתבססות שבועיים לאחר ההחדרה, בלוק אחד בכל פעם. הצמחים נקטפים בזהירות ונשטפים בנפרד תחת מי ברז זורמים עבור כל צמח.אנו דוגמים שני עלים, שתי חתיכות שורש ושתי חתיכות גבעול. העלים נבחרים באופן אקראי מהעלה האמיתי הראשון של הצמח ונערכים כריבועים. דגימות באורך של כ-3 cm נלקחות מחלקו המרכזי של הגבעול ומסמוך לפני השטח של הקרקע. דגימות של שורש ראשי באורך דומה נלקחות מחלקו המרכזי של השורש וממרחק של 1 cm מאחורי קצה השורש.כל דגימה עוברת עיקור פני שטח בנפרד בתוך מabilis סטרילי ב-0.5% sodium hypochlorite למשך שתי דקות, לאחר מכן ב-70% ethanol למשך שתי דקות ושטיפה של שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים לפני ההשארה לייבוש. על נייר סופג סטרילי, הדגימה המעוקרת מנוסחת בזהירות כדי להסיר את שולייה החיצוניים, שבהם ייתכן שסולקו אנדופיטים עקב מגע עם החומריים מחטאים. הדגימה המקוצצת נחתכת לאחר מכן למקטעים קטנים יותר, במימד ממוצע של ששה על ששה מילימטרים עבור עלים, ובאורך של ששה מילימטרים עבור גבעולים ושורשים.את הפרוסות זורעים בצלחות פטרי בנפח 60 מילימטר המכילות PDA בתוספת האנטיביוטיקה tetracycline וכן streptomycin ו-penicillin בריכוז של 2 mg/L לכל אחד. לבסוף, אטמים את הצלחות בפרפין ומדגירים אותן בחושך בטמפרטורה של 25 °C. מי השטיפה מוחלפים לאחר עיבוד כל בלוק, אך לפני כן זורעים דגימה של 100 µL בצלחת פטרי בנפח 100 מילימטר, על מצע PDA, ומדגירים למשך 10 ימים בטמפרטורה של 25 °C כדי לקבוע אם הסטריליזציה הצליחה.אם נראה צמיחה כלשהי בביקורת זו, הבלוק נזרק ואינו נלקח בחשבון לאנליזה. הפלטות נבדקות מדי יומיים עד שלושה במשך 20 ימים כדי להבחין ולתעד צמיחה פטרייתית. חתוכי צמחים שעובמרו במושבות מופרשים ומועברים בנפרד לפלטות מצע חדשות כדי למנוע זיהום של חתוכים סמוכים.הצמיחה של B bassiana מתועדת על סמך מיצליום לבן ודחוס אופייני ההופך לצבע קרם או צהוב בהיר בשוליו. במקרה של ספק, הדגימה מותקנת בטיפת מים תחת מיקרוסקופ ונבדקת לאיתור גלובל סקניה (global scania) וקידייה פורס (kedia force) בצורת זיגזג המאפיינים את המין, באותו היום שבו מוערכת הקולוניזציה. אנו מעריכים גם את השפעת הטיפולים שלנו על צמיחת הצמח.ראשית, אנו מודדים את גובה הצמח מבסיס הצמח ועד לקצה נקודת הצמיחה. לאחר מכן, אנו עוקרים בזהירות את הצמחים, שוטפים אותם במי ברז ומניחים להם להתייבש בטמפרטורה של 45 °C למשך שלושה ימים כדי למדוד את משקלם היבש. לצורך הדגמה זו, ביצענו את הניסוי המלא פעמיים כדי לקבל תוצאות מייצגות.שתי שיטות ההדבקה הובילו להתגשמות של Bana ביותר מ-80% מהצמחים המטופלים. עם זאת, מידת הקולוניזציה הייתה תלויה בחלק הצמח שנבדק ובשיטת ההדבקה שבה נעשה שימוש. הנבטים הגיבו בצורה הטובה ביותר.ההטלה בריסוס השפיעה על השורשים, שסימנו תגובה רק להטלה בהשקיה. לבסוף, הגבעולים הגיבו באופן דומה לשתי שיטות ההטלה. Bana לא זוהה באף אחד ממקטעי הצמחים בביקורת ללא טיפול באנדופיטים, למעט Bana שהופיע ב-15% ממקטעי הצמחים שנבחנו, אך אלו הוסרו מלוחיות המצע לפני שביכלו לפלוש למקטעים שכנים ולהשפיע על תוצאותינו.שבועיים לאחר ההקלחה, הצמחים המטופלים והצמחים של קבוצת הביקורת לא היו ניתנים להבחנה באופן חזותי, ולא נצפו הבדלים משמעותיים במשקל היבש או בגובה שלהם. גורמים רבים עשויים להשפיע על תוצאה ספציפית של ניסוי להקמתו של פתוגן אנדופיטי כהשפעה סופית. כפי שמוסבר בסרטון זה, שיטת ההקלחה היא אחד מהם; גורמים ביולוגיים שניתן לבחון כוללים את מין הגืช או את הזן שנבחר, ואת בחירת מין הפתוגן של ה-OMA או האיזולט. גורמים נוספים שניתן לשקול לשנות כוללים את ריכוז האינוקולום, גיל הצמח בעת ההקלחה ותנאי גידול הצמח.המטרה הסופית של ניסויים אלה צריכה להיות פיתוח טיפול יעיל המספק עמידות סיסטמית עמידה נגד INE או מחלה. כאשר תהיו מוכנים לבדוק עמידות המתווכת על ידי Endof fight, אנו ממליצים לכם לצפות בסרטון המתאר Herbal Resistance Mechanisms שפורסם גם הוא ב-Journal of Visualized Experiments. שימו לב כי אנדופיטים נפוצים מאוד בצמחים וסביר להניח שהם ישפיעו על יכולתכם לבסס ולזהות באופן עקבי פטריית מטרה פתוגנית כ-endo fight.אנו מקווים שהדגמה זו תהיה לכם לעזר. בהצלחה בניסוייכם.

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מדווחים על השלבים השונים המעורבים בפיתוח המבוסס על ידע של קוטל חיטוי יעיל, כולל הבידוד, הזיהוי, ההקרנה וההבחנה של הפטרייה האנטומופתוגנית ה"מתאימה ביותר ", Metarhium anisopliae , לשליטה על מזיקים לחרקים בחקלאות .

פיתוח של<em&gt; מטריציום anisopliae</em&gt; כמקוטלת חיידקים: מהבידוד לביצועי שדה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

פטריות אנטומופתוגניות צברו חשיבות כחומרי ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. במחקר זה, הייצור ההמוני של מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים הן של Metarhizium robertsii והן של M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים נערך בהצלחה באמצעות מוצרי תבואה חקלאיים.

ייצור המוני של פטריות אנטומופתוגניות, Metarhizium robertsii ו - Metarhizium pinghaense, ליישום מסחרי נגד חרקים מזיקים

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

פרוטוקול זה מציג מערכת ביו-אסאי אופטימלית של עלים מנותקים להערכת היעילות של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נגד כנימת החרדל (Lipaphis erysimi (Kalt.)), חרק פרתנוגנטי. השיטה מתארת את תהליך איסוף הנתונים במהלך ניסויים בצלוחית פטרי, ומאפשרת לחוקרים למדוד באופן עקבי את האלימות של EPF נגד כנימות חרדל וחרקים פרתנוגנטיים אחרים.

הערכת ההשפעה של פטריות אנטומופתוגניות נגד חרק פרתנוגנטי, כנימת חרדל, Lipaphis erysimi (Kalt.)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער ודרך חלופית להעריך את פעילותן האנטומופתוגנית באמצעות חרק מודל קולאופטרן. שיטה זו יעילה ונוחה לחקר משאבים פטרייתיים אנטומופתוגניים ממזיקים חרקים משעממי עץ ביערות טבעיים.

בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

אנו מתארים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה, בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לזהות מוצרים טבעיים מיקרוביאליים המציגים אנטגוניזם נגד פתוגנים פטרייתיים באמצעות הפתוגן Sclerotinia sclerotiorum והדברה ביולוגית Bacillus isolates כמערכת מודל.

זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה

הוקם פרוטוקול בדיקה ביולוגית של עלים מנותקים לגידול המוני של תריפס צ'ילי בשיטת עלים מנותקים שונה במיכלי זכוכית המכילים אגר, מה שמבטיח הישרדות גבוהה והתפתחות מסונכרנת. מערכת זו מאפשרת סינון יעיל של אלימות פטריות אנטומופתוגניות כנגד זחלי כוכב 2 ומספקת אספקת תריפס אמינה להערכות מעבדה, חממה ושדה.

הקמת מערכת גידול תריפס צ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood) לבדיקת אלימות של פטריות אנטומופתוגניות

למד שתי שיטות הדברה ביולוגית באמצעות Beauveria bassiana כאנדופיט בפול הקטני. השיטות מספקות הגנה מפני מזיקים חקלאיים ותורמות לחקלאות ברת-קיימא.

הקמת Entomopathogens פטרייתיים כEndophytes: לקראת ההדברה ביולוגית Endophytic

גלה סרטונים נוספים