כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

מטרת הפרוצדורה הבאה היא להשתמש בתחקיר מולטי-ספקטרלי של הרכבים תאיים מרובי-רכיבים (multiplex) או בסימולציה שלהם כדי לקבוע את תרומתן של אוכלוסיות שונות התגורות במח העצם לפיתוח הסְטוֹמָה של גידולים. דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת תאי גזע ממח העצם המבטאים RFP בעכבר מקבל טרנסגני המסומן ב-GFP. בשלב השני, תאי הגידול המבוקשים מוזרקים לאותו מקבל, ולאחר השתרשותם, הגידול החתוך נחתך לפרוסות, נטמן בפראפין ומסומן באמצעות נוגדנים אימונופלואורסצנטיים.

בשלב הבא, לאחר השלמת ספריית הספקטרום, נוצרת ספריית ספקטרום של כל אורכי הגל ששימשו לרכישת תמונות של חתכי הגידול. בשלב הסופי מצולמים השקופיות ומבוצע ניתוח נתונים כדי לאפשר זיהוי וקישור של דפוסי הצביעה של הסמנים התאיים הרלוונטיים. בסופו של דבר, ניתן לזהות ישויות תאיות או פנוטיפים חדשים על בסיס סימון מולטיפלקס של סמנים חוץ-תאיים ותאיים, כדי להבין טוב יותר את הרכבם של רקמות מורכבות כגון הסביבה המיקרוסקופית של הגידול.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות אימונופלואורסצנציה סטנדרטיות הוא שהניתוח הרב-ספקטרלי מאפשר Multiplex של שבעה פלואורופורים או יותר על אותה שקופית, מה שמאפשר בחינה מדויקת ומפורטת הרבה יותר של ההרכב התאי של מיקרו-סביבת הגידול או של רקמה רגנרטיבית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המקור וההרכב של מיקרו-סביבת הגידול, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון רפואה רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של מערכת החיסון. המדגים של פרוצדורה זו לצד ד"ר Spa הוא כריס בות', עוזר מחקר במעבדתי. בשל הגבלות IU Cook במוסד זה, נדון אך לא נראה מניפולציות ישירות על עכברים.

ניתן למצוא את הליכי מחית העצם ואת טכניקות השבחת הגידול שלנו בעבודתנו הקודמת, כגון kid and others stem cells. 2009. לאחר בידוד תאי מחית העצם מהגפיים האחוריות התואמות, יש להשעות את התאים בריכוז של 2 million cells ל-100 µL של PBS לכל עכבר. השתמש במנורת חימום כדי להרחיב את כלי הדם של עכבר מקבל GFP שהוקרן, והנח את העכבר במכשיר קיבוע להזרקה לווריד הזנב.

הזריקו באופן סיסטמי את תרחיפי התאים לתוך הזנב או לוריד הרטרו-אורביטלי באמצעות מחט בכיסוי (gauge) 29, כאשר הצד האלכסוני של המחט פונה כלפי מעלה. השתמשו בגזה סטרילית כדי להפעיל לחץ קל על הזנב לאחר ההזרקה. ביום ההזרקה, הזריקו לעכבר אחד 100 µL של PBS בלבד כביקורת להשתבשות (engraftment control).

יש להשעות מחדש את תאי הגידול הרלוונטיים ב-PBS בריכוז של 1 מיליון תאים ל-100 µL. לאחר סטריליזציה של הבטן עם 70% ethanol, השתמש ביד אחת כדי להחזיק את העכבר בעורף ובזנב, ואז ביד השנייה, החזק את המחט כאשר פיית המחט פונה כלפי מעלה והזרק את תאי הגידול לחלל הפריטוני של העכבר המקבל.

לאחר 15 עד 30 ימים, יש להקריב את העכברים ולהוציא את הגידול מבטנם. לאחר מכן, יש לקבע את הגידולים ב-10% formalin למשך 24 שעות. לאחר מכן, יש לחתוך את הרקמה המקובעת לפרוסות בעובי של 5 עד 10 micrometer לצורך הליכי צביעה בהמשך.

לאחר קיבוע נתחי הרקמה בפרפין, ייבשו את הדגימות בתנור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 56 °C. לאחר מכן, שטפו את השקופיות לפי הרצף הבא. לאחר שטיפת האתנול האחרונה, שטפו את השקופיות במים למשך שתי דקות, תוך טבילה והרמה איטית של מתקן הצביעה בתוך המים 10 פעמים.

לאחר מכן, הניחו את תחליל סודיום ציטראט במיקרוגל לחימום. לאחר הרתחת השקופיות במשך 20 דקות בתחליל סודיום ציטראט, הניחו לדגימות להתקרר בתחליל למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו במים מיוננים למשך חמש דקות נוספות.

לאחר מכן, נקשו קלות על העגלה כדי לאפשר לטיפות מים גדולות להיגרר החוצה, תוך הקפדה שלא לייבש את נתח הרקמה. השתמשו בטוש למחסום הידרופובי כדי לסמן את השטחים סביב נתחי הגידול, ומיד לאחר מכן הניחו באפר חסימה (blocking buffer) על הדגימה כדי למנוע את התייבשות נתח הרקמה. לאחר שעה, הדגירו את העגלות עם הנוגדן הראשוני הרלוונטי בתוך תיבת לחות על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.

למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBST למשך 10 דקות בכל פעם, תוך ניעור עדין של חתכי הרקמה במהלך השטיפה. דללו את הנוגדנים המשניים ביחס של 1:1000 של נוגדן למסיינר חסימה. לאחר מכן, הדגירו את החתכים בנוגדנים המשניים המתאימים בתוך תיבת לחות מכוסה בנייר אלומיניום, על שייקר מסתובב במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

שטפו את העגיות פעמיים ב-PBST למשך חמש דקות תוך כדי ניעור עדין והגנה מהאור. לאחר מכן, צבעו את העגיה של ה-dappy בלבד ואת עגיות האנליזה ב-DPI למשך דקה אחת, תוך שמירה על העגיות מכוסות במהלך האינקובציה. הניחו זכוכית כיסוי מעל כל דגימה, ואטמו את קצותיה של כל זכוכית כיסוי באמצעות מחזק ציפורניים.

כעת, כדי לבצע את הדימוי הרב-ספקטרלי, השתמש בעדשת שמן כדי לצלם תמונה ראשונית של שקופית האנליזה, וזאת כדי לקבוע את זמני החשיפה המתאימים עבור כל אחד מהטווחים הספקטרליים בספריה הספקטרלית. לדוגמה, טבלה זו מפרטת פרוטוקולים מוצעים לספריה הספקטרית בהתבסס על מספר ה-floor fours שנעשה בהם שימוש בניסוי. לאחר מכן, צלם את השקופית ללא הצביעה עבור שקופית הרקע בספריה הספקטרית עבור ניסוי זה.

בתמונה הבאה, דגמו את השקופית ללא הצביעה כדי להשיג את תמונת הרקע עבור הספרייה הספקטרלית. כעת דגמו כל שקופית של ביקורת עבור רצפה אחת שצובעה, ושמרו את התמונות תחת השם של הנוגדן המשני שנעשה בו שימוש עבור כל שקופית. לאחר השלמת הספרייה הספקטרלית, אספו תמונות של אזורי העניין בשקופית הניתוח כדי לנתח תמונות של רקמות הגידול.

ראשית, ייבאו מבחר מייצג של תמונות ה-nuance שנרכשו באמצעות תוכנת inform. לאחר מכן, פתחו את ספריית הספקטרום הבטוחה בהתאם להנחיות התוכנית. בשלב הבא, זהו את אזורי הרקמה הרלוונטיים (regions of interest) לניתוח.

זהו תאים בודדים על בסיס צביעת DAPI. הציטופלזמה תזוהה באופן אוטומטי בהתבסס על צורת הגרעין. כעת בחרו את קריאת עוצמת הפלואורסצנציה הרצויה עבור כל פרמטר פלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את התמונות שנרכשו, ואפשרו לתוכנה לעבד את הנתונים באמצעות האלגוריתם המוצע.

בסיום עיבוד התמונות, ממזגים את הקבצים שהתקבלו. לאחר מכן, תוך שימוש בטכניקת הדמיה מולטי-ספקטרלית זו לניתוח והצגה גרפית של גידולים במודל עכברי זה של השתלת מח עצם טרנסגנית, זוהו רכיבי גידול סטרומליים ממקור של מח עצם באמצעות ציטומטריה של זרימה שלושה שבועות לאחר השתלת מח העצם. לאחר מכן, שישה שבועות לאחר ההזרקה הראשונית, נותחו חתכים מגידולי שחלה מוזרקים שאינם מסומנים; לאחר יצירת ספריית ספקטרום באמצעות שקופיות ביקורת בצבע בודד, נותחו תמונות של חתך גידול שחלה שצבעו ב-GFP DPI ושני סממנים נוספים.

ניתן להוסיף סמנים נוספים. לדוגמה, מוצגים כאן, באמצעות התוכנה הייעודית, ספריית הספקטרום והתמונה הנלווית של חתך גידול עם שישה סמנים בתוספת צביעה גרעינית. ניתן לסווג את אזורי העניין ברקמה בתוך חתך הגידול, כפי שמוצג בתמונות המייצגות המוצגות כאן.

לדוגמה, תמונה זו מדגימה את סיווג מקטעי הרקמה ולאחריו את סגמנטציית התאים. התהליך מתבסס על צביעת גרעין dpi. ניתן להעריך לאחר מכן את הכמות של הסמנים הפלואורסצנטיים בגרעין ובציטופלזמה של כל תא ולייצא את הנתונים לצורך ניתוח נוסף.

אלגוריתם סגמנטציית הרקמות מסוגל לזהות תתי-סוגים של רקמות על בסיס ארכיטקטורת הרקמה ולא רק על בסיס זיהוי פלואורוצרום, ובכך מספק כלי אנליטי חסון יותר לסיווג הצביעה לאזורי רקמה נפרדים. בתמונה זו, המחשב אומן לזהות חמישה תתי-אזורים על בסיס תבניות ארכיטקטוניות בתוך הרקמה. הרקע מוגדר כשטח ריק.

הגידול ההמוליטי מאופיין בשפע של תאי דם אדומים בתוך הרקמה. הגידול מאופיין בתאים בצפיפות גבוהה. השומן מאופיין במדורות תאיות ריקות, גדולות וסימטריות, והשרירים מאופיינים בתבנית מפסית.

באמצעות שיטה זו, ניתן לנתח אוכלוסיית תאים כפולה-חיובית בהתבסס על סף עצימות פלואורסצנציה שנקבע. לדוגמה, עבור תאים חיוביים ל-GFP וחיוביים ל-alpha smooth muscle actin, כפי שמוצג כאן עבור גילוי ספקטרלי נוסף מעבר לארבעה צבעים, אנא עיינו במסמכי הטיפים והטריקים המקושרים עבור ריבוי (multiplexing) של חמישה גלאים או יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שאיכות התמונות תלויה במידה רבה בשימוש נכון בשבתי בקרה של צבע בודד.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescence in situ hybridization), כדי להשיב על שאלות נוספות הנוגעות למטבולים תאיים ולרקמת המיקרו-סביבה של הגידול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של טכניקת החיקוי שלנו, של החקירה הרב-ספקטרלית של רכיבים רב-תאיים, ובסיומו תבינו לעומק כיצד לזהות מטרות תאיות מרובות על שקופית אחת. תלמדו כיצד לספור באופן ייחודי את המטרות התאיות הללו, ותרכשו הבנה טובה של התפתחות הסטרומה של הגידול, של רקמה רגנרטיבית או של הרקמה המעניינת אתכם.