כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

מטרת ההליך הבא היא להשתמש בחקירה רב-ספקטרלית של קומפוזיציות תאיות מרובות או חיקוי כדי לקבוע את התרומות של אוכלוסיות שונות של מח עצם להתפתחות סטרומה של גידולים. זה מושג על ידי השתלה ראשונה של עכבר נמען עם תווית GFP טרנסגני עם תאי גזע של מח עצם המבטא RFP. בשלב השני, תאי הגידול המעניינים מוזרקים לאותו נמען ולאחר ההשתלה, גידול הכריתה נחתך, מוטבע בפרפין ומסומן בנוגדנים אימונופלואורסצנטיים.

לאחר מכן, נוצרת ספרייה ספקטרלית של כל אורכי הגל המשמשים לרכישת תמונות של קטעי הגידול לאחר השלמת הספרייה הספקטרלית. השקופיות מצולמות בשלב האחרון, ניתוח הנתונים מבוצע כדי לאפשר זיהוי ושיוך של דפוסי הצביעה של הסמנים התאיים המעניינים. בסופו של דבר, ניתן לזהות ישויות תאיות או פנוטיפים חדשים על סמך תיוג מולטיפלקס של סמנים חוץ-תאיים ותאים כדי להבין טוב יותר את ההרכב של רקמות מורכבות כגון מיקרו-סביבת הגידול.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות הוא שהניתוח הרב-ספקטרלי מאפשר לך להכפיל שבעה או יותר רביעיות פלואורו באותה שקופית, מה שמאפשר חקירה מדויקת ומפורטת הרבה יותר של ההרכב התאי של מיקרו-סביבת הגידול או רקמה רגנרטיבית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המקור וההרכב של מיקרו-סביבת הגידול, ניתן ליישם אותה במערכות אחרות כגון רפואה רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה חיסונית. מדגים הליך זה יחד עם ד"ר ספא הוא כריס בות', עוזר מחקר במעבדה שלי עקב מגבלת IU Cook במוסד זה, נדון אך לא נראה מניפולציות ישירות של עכברים על עכברים.

ניתן למצוא את הליכי מח העצם הללו ואת טכניקות השתלת הגידול שלנו בעבודה הקודמת שלנו, כגון תאי גזע של קיד ואחרים. 2009 כדי להתחיל לאחר בידוד תאי מח העצם מהגפיים האחוריות המשקפות, החייאה השעתה את התאים ב-2 מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטר PBS לעכבר. השתמש במנורת חום כדי להרחיב כלים של עכבר GFP נמען מוקרן והנח את העכבר במעצר הזרקת וריד זנב.

באמצעות צד שיפוע מחט 29 כלפי מעלה, הזרקו באופן שיטתי את מתלי התאים לזנב או לווריד הרטרואורביטלי. השתמש בגזה סטרילית כדי להפעיל לחץ קל על הזנב לאחר ההזרקה. הזרקו עכבר אחד עם 100 מיקרוליטר PBS רק כבקרת חריטה ביום ההזרקה.

Re להשעות את תאי הגידול המעניינים ב-PBS במיליון תאים ל-100 מיקרוליטר. לאחר עיקור הבטן עם 70% אתנול. השתמש ביד אחת כדי לרסן את העכבר על ידי קשקוש הצוואר והזנב, ולאחר מכן ביד השנייה, החזק את הצד המשופע של המחט כלפי מעלה והזריק את תאי הגידול לחלל הבין-פריטונאלי של העכבר המקבל.

לאחר 15 עד 30 יום, המתת חסד של העכברים והוצאת הגידול מבטנו. לאחר מכן תקן את הגידולים ב-10% פורמין למשך 24 שעות. לאחר מכן חתכו את הרקמה הקבועה לפרוסות של חמש עד 10 מיקרומטר להליכי הצביעה הבאים.

לאחר קיבוע חלקי הרקמה בפרפין, אופים את הדגימות במשך שעה בחום של 56 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את המגלשות לפי הרצף הבא לאחר שטיפת האתנול האחרונה, שטפו את המגלשות במים למשך שתי דקות. טובלים לאט ומרימים את מתלה הצביעה פנימה והחוצה מהמים 10 פעמים.

לאחר מכן, הכניסו את מאגר הנתרן ציטראט למיקרוגל לחימום. לאחר הרתחת השקופיות במשך 20 דקות במאגר נתרן ציטראט, הניחו לדגימות להתקרר במאגר למשך 30 דקות. לאחר מכן יש לשטוף במים המיוננים למשך חמש דקות נוספות.

לאחר מכן הקש על המגלשה כדי לתת לטיפות מים גדולות להתגלגל, היזהר לא לייבש את חלק הטישו החוצה. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לסמן את החלקים סביב קטעי הגידול ולאחר מכן הנח מיד חיץ חוסם על הדגימה כדי למנוע את התייבשות קטע הרקמה. לאחר שעה, דגרו את המגלשות עם הנוגדן העיקרי המעניין בקופסת תא לחות על שייקר מסתובב לאט בארבע מעלות למשך הלילה.

למחרת בבוקר, שטפו את המגלשות פעמיים ב-PBST למשך 10 דקות בכל פעם עם ניעור עדין בזמן שטיפת החלקים. לדלל את הנוגדנים המשניים ביחס של 1 ל-1000 נוגדנים לחסימה. לאחר מכן דגרו את החלקים בנוגדנים המשניים המתאימים בקופסת תא הלחות המכוסה בנייר אלומיניום על שייקר מסתובב איטי בטמפרטורת החדר לאחר שעתיים.

שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBST למשך חמש דקות בניעור עדין והגנו עליהן מפני אור. לאחר מכן הכתים את השקופית המטופשת בלבד והניתוח מחליק עם DPI למשך דקה אחת, תוך שמירה על השקופיות מכוסות במהלך הדגירה. הנח פתק כיסוי מעל כל דגימה, אטום את הקצוות של כל החלקת כיסוי עם מקשה ציפורניים.

כעת כדי לבצע את ההדמיה הרב-ספקטרלית, השתמש במטרת שמן כדי לצלם תמונה ראשונית של שקופית הניתוח כדי להשיג את זמני החשיפה המתאימים עבור כל אחד מהטווחים הספקטרליים בספרייה הספקטרלית. לדוגמה, טבלה זו מתארת פרוטוקולי ספרייה ספקטרלית המבוססים על מספר ארבע הקומות ששימשו בניסוי. לאחר מכן דמיין את השקופית הלא מוכתמת עבור שקופית הרקע בספרייה הספקטרלית עבור ניסוי זה.

התמונה הבאה, השקופית הלא מוכתמת להשגת תמונת הרקע עבור הספרייה הספקטרלית. כעת דמיין כל בקרה קומה אחת ארבע שקופיות מוכתמות, ושמור את התמונות תחת שם הנוגדן המשני המשמש לכל שקופית. לאחר השלמת הספרייה החשודה, אסוף תמונות של אזורי העניין בשקופית הניתוח כדי לנתח תמונות של רקמות הגידול.

ראשית, ייבא מבחר מייצג של תמונות הניואנסים שנרכשו באמצעות תוכנת מידע. לאחר מכן פתח את הספרייה הספקטרלית הבטוחה לפי הוראות התוכנית. לאחר מכן, זהה את אזורי הרקמה המעניינים שיש לנתח.

זהה תאים בודדים על סמך צביעת DAPI. הציטופלזמה תזוהה אוטומטית על סמך צורת הגרעין. כעת בחר את קריאת עוצמת הפלואורסצנט הנבחרת עבור כל פרמטר פלואורסצנטי, ולאחר מכן התאם את התמונות שנרכשו, ואפשר לתוכנה לעבד את הנתונים באמצעות האלגוריתם המוצע.

בסיום עיבוד התמונה, מזג את הקבצים שנוצרו. לאחר מכן, תוך שימוש בטכניקת הדמיה רב-ספקטרלית זו כדי לנתח ולגרף גידולים במודל עכבר השתלת מח עצם טרנסגני זה, הובחנו רכיבי גידול סטרומלי שמקורם במח עצם על ידי ציטומטריית זרימה שלושה שבועות לאחר השתלת מח עצם. לאחר מכן, שישה שבועות לאחר ההזרקה הראשונית, נותחו קטעים מגידולי השחלות שהוזרקו ללא תווית לאחר יצירת ספרייה ספקטרלית עם שקופיות בקרה בצבע יחיד, נותחו תמונות של קטע גידול השחלות המוכתם ב-GFP DPI ושני סמנים נוספים.

תוספת של סמנים נוספים אפשרית. לדוגמה, כאן, הספרייה הספקטרלית והתמונה הנלווית של קטע גידול עם שישה סמנים בתוספת כתם גרעיני מוצגות באמצעות התוכנה המושכלת. אזורי הרקמה המעניינים בקטע הגידול ניתנים לסיווג כפי שמוצג בתמונות המייצגות המוצגות כאן.

לדוגמה, תמונה זו מדגימה את סיווג מקטעי הרקמה ואחריו פילוח התאים. מבוסס על כתם גרעיני dpi. לאחר מכן ניתן למדוד את כימות התוויות הפלואורסצנטיות בגרעין ובציטופלזמה של כל תא ולייצא לניתוח נוסף.

אלגוריתם פילוח הרקמות מסוגל לזהות עוד יותר תת-סוגים של רקמות על סמך ארכיטקטורת רקמות ולא רק על זיהוי פלואורוכרום, ומספק כלי אנליטי חזק יותר לסיווג הצביעה לאזורי רקמה מובחנים. בתמונה זו, המחשב אומן לזהות חמישה תת-אזורים על סמך הדפוסים הארכיטקטוניים בתוך הרקמה. הרקע מוגדר על ידי רווח ריק.

הגידול המוליטי מוגדר על ידי שפע תאי הדם האדומים בתוך הרקמה. הגידול מוגדר על ידי התאים המאוכלסים בצפיפות. השומן מוגדר על ידי התאים הריקים הסימטריים הגדולים והשרירים המוגדרים על ידי דפוס מפוספס.

בשיטה זו ניתן לנתח אוכלוסיית תאים חיובית כפולה על סמך סף עוצמת פלואורסצנטי שנקבע. לדוגמה, עבור תאים חיוביים ל-GFP ותאי אקטין חיוביים לשריר חלק אלפא, כפי שמוצג כאן לזיהוי ספקטרלי נוסף מעבר לארבעה צבעים, אנא עיין במסמכי הטיפים והטריקים המקושרים לריבוב חמישה בדיקות או יותר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות התמונות מסתמכת במידה רבה על שקופיות בקרת הצבע הבודדות המתאימות המשמשות.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הכלאה פלואורסצנטית באתרה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון תאים תאיים ורקמת מיקרו-סביבה של גידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את טכניקת החיקוי שלנו, החקירה הרב-ספקטרלית של רכיבים רב-תאיים, וכאשר תשלים זאת, תהיה לך הבנה מעמיקה כיצד לזהות מטרות תאיות מרובות בשקופית אחת. כיצד לספור את המטרות התאיות הללו ולהבין היטב את האבולוציה של סטרומה של גידול או רקמה רגנרטיבית, או הרקמה המעניינת שלך.