בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לבודד ולעבד במדויק את החניכיים של ה-mirin לצורך ניתוח המשכי בציטומטריה של זרימה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד כירורגי קפדני של החניכיים. לאחר מכן, הרקמה שהוצאה מעובדת ליצירת תרחיף של תאים בודדים.

לאחר מכן, מתבצע צביעה חוץ-תאית ותוך-תאית באמצעות נוגדנים. לבסוף, הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות אוכלוסיות תאים שונות בחניכיים ושינויים תאיים המתרחשים ברקמה בעקבות חשיפה לפגיעה אימונולוגית באמצעות ניתוח בציטומטריית זרימה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו, על פני שיטות אחרות, כגון בכימיה של OC או בפלואורסצנציה בודדת, הוא שמדובר בשיטה מהירה ופשוטה לניתוח מספר רב של תאים, המאפשרת ניתוח סימולטני של מספר משתנים, כמו גם מיון של סוגי תאים שונים לצורך ניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד מיקרואורגניזמים משפיעים על ההומאוסטזיס החניכי, וכיצד הדבר קשור לאובדן עצם המושרה על ידי דלקת במודל ניסויי של פריודונטיטיס. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו לבחון את תפקידם של תאי RI במהלך פריודונטיטיס. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן טכניקת האצה של הגן GVA קשה ללמידה בשל הגודל הקטן והגישה הבלתי נוחה יחסית ל-MU one J gva.

כדי להתחיל, הכין תמיסות מצע וכלי ניתוח סטריליים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הרדמה והריגה של עכבר, בהתאם לשיטות המאושרות על ידי ועדת רعاية והסנייה של בעלי חיים במוסדך, השתמש במספריים ישרים, חדים אך קהים, כדי לחתוך את שני צדי חלל הפה, כולל הלחיים וענף הלסת התחתונה (mandible ramus), ומשוך מטה את הלסת התחתונה תוך הנחיית מספריים סטנדרטיים בניצב למישור עצם החך.

בשלב הבא, בצעו חתך ברקמות הרכות והקשות, שני מילימטרים מאחורי השיניים החותכות. לאחר מכן, משכו מטה את החלק הקדמי של הפה כדי לחשוף את חלל האף, כאשר המספריים מקבילים לחיך. הניחו גזה אחת בתוך חלל האף והשתמשו בשנייה כדי לבצע חתך במבואה (vestibule), תוך חיתוך עד לחתך האחורי.

חזור על החתך בצדו השני של הלסת העליונה (maxilla) כדי לנתק אותה מהגולגולת. לאחר מכן, חתוך אותה במרכזה וגזום את רקמת החיך מכל חצי לסת עליונה כדי להגיע לעצם האלבולרית באמצעות מספריים ופינצטה. קלף את רקמות החניכיים מהגבול הקדמי והנח אותן בצלחת עם PBS ו-2% fetal calf serum או FCS; כדי לעבד את החניכיים, העבר אותן לצלוחית תרבית עם 1 mL PBS, 2 mg/mL collagenase type two ו-1 mg/mL DNAs.

בצעו חיתוך באמצעות להב כירורגי סטרילי מספר 15. קצצו את הרקמה היטב לפני העברתה למבחנה קונית של 15 milliliter. שטפו את תאי הרקמה שנותרו על הצלחת באמצעות 1 milliliter של P-B-S-F-C-S והעבירו אותם למבחנה.

דגרו את הרקמה באינקובטור נערור שחומם מראש בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של EDTA בריכוז 0.5 M ודגרו למשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן, הוסיפו P-B-S-F-C-S עד לנפח של 12 mL וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C, במהירות של 400 ×g למשך שמונה דקות.

לאחר הסרת הנוזל העליון, השהה את התאים בשני מיליליטר של P-B-S-F-C-S. סנן את הדגימה דרך מסנן תאים של 70 מיקרון לאחר סבוב של התוצר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ו-320 ×g למשך חמש דקות. השהה מחדש את התאים ב-300 µL של P-B-S-F-C-S.

לבסוף, ספרו את התאים בעבודה תחת מנדף בטמפרטורה קרירה וכשכיבוי אורות בנפח כולל של 100 µL, הוסיפו 0.2 עד 0.5 µg מכל נוגדן נבחר לכל 1×10⁶ תאים וערבבו קצרות במערבל Vortex. לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות בחושך, הוסיפו 2 mL של P-B-S-F-C-S וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 320 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. כדי לקבע את התאים, שאבו את העלייה, ולאחר מכן, תוך כדי ערבוב ב-Vortex, השביו אותם לסוספנזיה על ידי הוספה של 500 µL של BD cyto perms קרים בטיפות.

להשגת השפעות ציטולוגיות, הדגרירו את המבחנות בטמפרטורה של 4°C בחשכה למשך 40 דקות לאחר סבב האינקובציה והערבוב בוורטקס. לאחר מכן, הוסיפו בקצרה 1 mL של BD perm wash buffer, וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 800 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך שבע דקות. לאחר חזרה על שלב השטיפה, שאבו את כל הנוזל למעט 300 µL של תמיסת השטיפה.

לאחר מכן, כדי לצבוע את התאים באופן תוך-תאי בנפח כולל של 100 µL, הוסיפו מיקרוגרם אחד מכל נוגדן נבחר לכל 1×10⁶ תאים. ערבבו קצרות במערבל Vortex והדגירו בחושך למשך 30 דקות. לאחר שטיפת התאים פעמיים כפי שבוצע קודם לכן והסרת כל הנוזל העליון (supernatant), השביו את התאים ב-300 µL של BD perm wash buffer קר וטרי.

לאחר ערבול קצר ב-vortex, סננו את התו suspension למבחנות fax. שמרו את המבחנות על קרח או במקרר בחשיכה עד לביצוע אנליזת fax. תאי חניכיים שנאספו במשותף משני עכברים נאיביים.

הבדיקות בוצעו בציטומטר זרימה מדגם LSR two ונולאו באמצעות תוכנת FlowJo. תרשימי ה-side scatter וה-forward scatter המוצגים כאן מדגימים את התפלגות התאים. אסטרטגיית ה-Gating לזיהוי לימפוציטים, מונוציטים, תאי דנדריטיים וגרנולוציטים מצוינת לצורכי השוואה.

איור זה מציג גרף FACS הממחיש תאי חניכיים שנוקו מעכברים שהודבקו ב-P gingivalis כ-21 ימים לאחר מתן דרך הפה (oral gavage) במסגרת פריודונטיטיס ניסויית. ניתן לזהות בקלות עלייה באוכלוסיות תאי חיסון שונות בעכברים המודבקים בהשוואה לעכברים נאיביים המוצגים כאן. תאי חיסון בחניכיים המעובדות מזוהים על ידי בחירת תאים (gating) המבטאים את הסמן ההמטופואטי CD 45.

תאים אלו הופרדו עוד יותר לתאי T חיוביים ל-CD3, כפי שמוצג באיור זה. נויטרופילים זוהו אף הם על פי ביטוי המולקולות LY6G ו-CD11b. לבסוף, תאי לנגרס (Langerhans cells) ותת-אוכלוסייה של תאים דנדריטיים אפיתליאליים זוהו באמצעות gating של תאים חיוביים ל-MHC class II וחיוביים ל-CD11c, וביטוי של EPAM ו-RIN CD207. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש וחצי עד חמש שעות, במידה שהיא מבוצעת כראוי בהתאם לנוהל זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון real-time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים בתא בודד לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לבחון את התגובה המקומית ב-GVA החניכיים לכל פגיעה בתחום המחקר הפריודונטלי. טכניקה זו אפשרה לנו להבהיר את תפקידם של תאים חיסוניים ולא-חיסוניים של ה-G GVA בפתוגנזה של פריודונטיס ניסיונית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הבידוד והעיבוד של GVA משתן במטרה להשיג תרחיף של תאים בודדים, אשר יעבור בהמשך לצביעה של ויראוסים חוץ-ותאית לצורך ניתוח בציטומטריה עם זרימה.