Name: בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למד לבודד ולעבד תאי חניכיים מעכברים לצורך ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו מאפשרת זיהוי אוכלוסיות תאים שונות ומחקר תגובות חיסוניות בחניכיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (מס &#39;1418-1411) לאהה ו( מס&#39; 1933/12) לAW, הקרן גרמנית לחוקרים צעירים (GIF הצעיר) לאהה, ואני ד&quot;ר . קרן תרומות מחקר Cabakoff בבית הספר לרפואת שיניים לאהה וAW-אוניברסיטת הדסה עברית.

להכין מראש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2% FCS עם 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של collagenase סוג II ומ&quot;ג / 1 מ&quot;ל של DNAse סוג I (1 מ&quot;ל לדגימה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירי ניתוח מעוקרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 0.5 M EDTA </li></ul> 1. טכניקת כריתת חניכיים עליונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות הדרכת IACUC אושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את שני הצדדים של חלל הפה, כולל את הלחיים והלסת התחתון Ramus עם מספריים ישרים חדים / קהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כלפי מטה את הלסת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמות הרכות וקשות במ&quot;מ 1 קו דמיוני מאחורי טוחנות שלישים עם מספריים רגילים. לכוון את המספריים בניצב למישור של עצם החך (איור 2 א, קווים כחולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הרקמות הרכות וקשות 2 מ&quot;מ מאחורי החותכות (איור 2 א, קווים כחולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כלפי מטה את החלק הקדמי של הפה. חלל האף ניתן לצפות לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המספרייםבמקביל לחיך, לשים להב אחד לתוך חלל האף, להב השני צריך לחתוך בפרוזדור. לחתוך עד החתך האחורי (איור 2 א, קווים ירוקים). חזור על פעולה זו משני צידי הלסת העליונה. בסוף הלסת העליונה מנותקת משאר הגולגולת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלסת העליונה, לחתוך אותו באמצע התפר (איור 2, קו מקווקו שחור) ולחתוך את רקמת החך של כל אחד, חמי לסת עליונה עד שמגיע לעצם מכתשיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את רקמות חניכיים (הן חמי-maxillae) מהגבול הקדמי שלהם עם Adson מלקחיים (ללא שיניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החניכיים נכרתה בצלחת עם PBS + 2% FCS. </li></ol> 2. חניכיים עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חניכיים נכרתה בצלחת תרבית רקמה (35 x 10 מ&quot;מ) עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS, 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של collagenase סוג II ומ&quot;ג / 1 מ&quot;ל של DNAse סוג I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר היטב את הרקמה עם ° להב כירורגי סטרילי 15 N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfer הרקמה מהצלחת למבחנת חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי רקמה / שנותרו על הצלחת עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS והעברה לאותה מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה באינקובטור שייקר עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד (המלצה: מחמם את החממה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של EDTA 0.5 M ו דגירה במשך עוד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המבחנה עד 12 מ&quot;ל עם PBS + 2% FCS ו צנטריפוגות ב 4 ° C, XG 400 במשך 8 דקות (המלצה: לפני צינת צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי supernatant ו resuspend עם 2 מ&quot;ל PBS + 2% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את המדגם עם 70 מיקרומטר תא מסננת ולשמור לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי supernatant ו resuspend עם + 2% PBS μl 300 FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים (x 10 5 תאים כ 5-10 צפויים מלסת עליונה יחידה). </li></ol> 3. נוגדן תאי ו תאיצביעה לניתוח cytometry זרימה מומלץ לעבוד בתוך מכסה המנוע, עם אורות כבויים. זה קריטי כדי לשמור על התאים בסביבה קרה מתמיד, כמו גם את כל החומרים דרושים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים כנגד מולקולות תאית על ידי הוספת 0.2-0.5 מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות במשך 15 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 2 מ&quot;ל PBS + 2% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספה, טיפה חכמה, 500 BD הקר μl Cytoperm / Cytofix תוך vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות עבור 40 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ&quot;ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant למעט 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאי intracellularly ידיהוספת 1 ​​מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ&quot;ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספת 300 הצפת פרם / לשטוף BD קר μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תוך סינון לצינורות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות בסביבה חשוכה וקרה עד לניתוח. </li></ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

רקמות חניכיימיים לסת עליונות המתקבלות מעכבר אחת מספיקות לניתוח תת אוכלוסיות של לימפוציטים מסוג B וT, כמו גם היכולת שלהם להביע את המולקולות תאיות ו תאית כפי שתארנו בעבר 1. יחד עם זאת, אם אוכלוסיות תאים נדירות הן בעלי העניין (לדוגמא DCs), מומלץ לרקמות בריכת מ 2-3 עכברים. שים לב, אם עדיף, אפשר לקלף שתי רקמות החיך וחניכיים ולאחר מכן לבלו החניכיים (שינוי של צעד 1.8-1.9). זה צריך להיות גם ציינו שיכולות להיות שנאסף mandibular חניכיים, כמו גם, עדיין, הבידוד שלו הוא מורכב יותר ו...

חניכיים היא רקמות רכות המקיפות את החלק הצווארי של השיניים ומכסה את תהליך מכתשיים (איור 1). החניכיים היא סוג של רירית לעיסה שניתן להפריד עוד יותר לתוך אפיתל הרירי ורקמת חיבור (הידוע גם בsubmucosa או propria lamina). המבנה האנטומי של החניכיים ושיניים סמוכות מאפשר לחיידקים לחיות ולפתח פלאק (biofilm) שכל הזמן מאתגר את המערכת החיסונית המקומית. כתוצאה מכך, מתפתחת תגובה דלקתית בחניכיים, אשר בנסיבות מסוימות הופכת להיות הרסני - מצב שמכונה מחלות חניכיים 2. בעיקרון, ניתן לחלק את פתולוגיות חניכיים המושרה פלאק לדלקת חניכיים וחניכיים. דלקת חניכיים מייצגת מצב הפיך של תגובה דלקתית המקומית שמוגבלת לחניכיים. חניכיים, ומצד שני, היא תהליך הרסני בלתי הפיך שבו מנגנון הקובץ המצורף (עצם מכתשיים, חניכייםרצועה, cementum וחניכיים) הוא נהרס 3. החניכיים הוצעה לשרת אתרים גם מפעיל ואינדוקטיבי כמו במחל חניכיים 4. מחקרים בבני אדם הראו כי בתגובה לרובד שיניים, תאי מפעיל חיסוניים ומולקולות דינמי הסתננו או היציאה החניכיים 5-7. פעילות זו הוצגה לשחק תפקיד מרכזי בהרס חניכיים 8,9. אילו נתונים שנוצרו על ידי אותם מחקרים סיפק מידע בעל ערך רב לגבי התהליך הפתולוגי הזה, עבודה עם רקמות אדם בעל מגבלות אתיות, טכנית וניסיון גדולים. הפיתוח של מודלים ניסויים אפשרו experimentations סיבה ותוצאה באמצעות העסקת עכברים הטרנסגניים וin vivo התערבויות 10. כתוצאה מכך, הידע שלנו על המנגנונים המעורבים במחלת חניכיים גדל במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. למרות זאת, בשל המורכבות של מחלות חניכיים, ישדיון מתמשך לגבי אופי התגובה חיסונית מקומית להקל הרס רקמות. יש גם חוסר בהבנה שלנו על התפקוד של תאי מערכת חיסון מרכזיים בחניכיים במהלך מחלות חניכיים. זה חיוני ובכך ללמוד אירועים פתולוגיים דלקתיים המתרחשים ברקמת היעד של המחלה, החניכיים.

<table><tbody><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה קורפ</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי </td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>04-121-1</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מונע ואקום</td> מומת <td>בחום סילון Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן עגול-תחתון צינור</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 70 &mu; m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 35&#215; 10 מ"מ</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD ציטופיקס / ציטופרם</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD11c נגד עכבר</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>שיבוט N418</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45.2 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>נוגדן CD4 נגד עכבר</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Clone GK1.5</td></tr><tr><td>נוגדן CD8a נגד עכבר</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>נוגדן CD3 נגד עכבר</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Clone 17A2</td></tr><tr><td>נוגדן CD326 (Ep-CAM)</td> נוגדן <td>Biolegend</td><td>118219</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר CD207 (לנגרין)</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Clone 929F3.01</td></tr><tr><td>נגד עכבר I-Ad (MHC-II) antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Clone 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo תוכנה v 7.6.5</td><td>כוכב</td><td></td><td></td> עץ</tr></tbody></table>

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים murine

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

פיתחנו טכניקה לבודד בדיוק ולעבד את רקמת חניכיים עכברית עבור cytometry הזרימה ומחקרים מולקולריים. החניכיים היא רקמה ייחודית וחשובה ללמוד מנגנוני חיסון משום שהוא מעורב בתגובה החיסונית נגד מארח biofilm פה שעלול לגרום למחל חניכיים. יתר על כן, קרבתה של החניכיים לרקמת עצם מכתשיים מאפשרת גם לימוד שיפוץ עצם בתנאים דלקתיים. השיטה שלנו מניבה כמות גדולה של תאי מערכת חיסון, המאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות אפילו כגון תאים לנגרהנס ותאי T רגולטוריים כפי שהוכחנו בעבר 1. עכברים המעסיקים ללמוד תגובות חיסוניות מקומיות מעורבות באיבוד עצם מכתשיים במחל חניכיים הוא יתרון בגלל הזמינות של כלים אימונולוגיים וניסיוני שונים. עם זאת, בשל גודלם הקטן והגישה נוחה יחסית לחניכיים העכבריות, מחקרים רבים נמנעו מבחינה של thiרקמה קריטית של. השיטה המתוארת בעבודה זו יכולה להקל על ניתוח חניכיים, אשר תהיה בתקווה להגדיל ממעיט על מערכת החיסון האוראלית ותפקידה במחל חניכיים.

דוגמאות לניתוח cytometry זרימה בתאי חניכיים מוצגות. תאי חניכיים אספו מ2 עכברים לרוץ בcytometer הזרימה השנייה LSR ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. איור 3 א הפגין חלוקת תאי חניכיים מעכברים נאיביים בפיזור צד (SSC) לעומת פיזור עלילה קדימה (FSC). אסטרטגית gating לזהות (i) לימפוציטים (II) / מונוציטים ותאים דנדריטיים (iii) גרנולוציטים מצויינים. לשם השוואה, אנו מציגים גם עלילת FACS ממחישה תאי חניכיים מטוהרים מפ gingivalis נגוע עכברים 21 ימים לאחר gavage האוראלי בהגדר...

מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לבודד ולעבד במדויק את החניכיים של ה-mirin לצורך ניתוח המשכי בציטומטריה של זרימה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד כירורגי קפדני של החניכיים. לאחר מכן, הרקמה שהוצאה מעובדת ליצירת תרחיף של תאים בודדים.לאחר מכן, מתבצע צביעה חוץ-תאית ותוך-תאית באמצעות נוגדנים. לבסוף, הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות אוכלוסיות תאים שונות בחניכיים ושינויים תאיים המתרחשים ברקמה בעקבות חשיפה לפגיעה אימונולוגית באמצעות ניתוח בציטומטריית זרימה.היתרון המרכזי של טכניקה זו, על פני שיטות אחרות, כגון בכימיה של OC או בפלואורסצנציה בודדת, הוא שמדובר בשיטה מהירה ופשוטה לניתוח מספר רב של תאים, המאפשרת ניתוח סימולטני של מספר משתנים, כמו גם מיון של סוגי תאים שונים לצורך ניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד מיקרואורגניזמים משפיעים על ההומאוסטזיס החניכי, וכיצד הדבר קשור לאובדן עצם המושרה על ידי דלקת במודל ניסויי של פריודונטיטיס. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו לבחון את תפקידם של תאי RI במהלך פריודונטיטיס. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן טכניקת האצה של הגן GVA קשה ללמידה בשל הגודל הקטן והגישה הבלתי נוחה יחסית ל-MU one J gva.כדי להתחיל, הכין תמיסות מצע וכלי ניתוח סטריליים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הרדמה והריגה של עכבר, בהתאם לשיטות המאושרות על ידי ועדת רعاية והסנייה של בעלי חיים במוסדך, השתמש במספריים ישרים, חדים אך קהים, כדי לחתוך את שני צדי חלל הפה, כולל הלחיים וענף הלסת התחתונה (mandible ramus), ומשוך מטה את הלסת התחתונה תוך הנחיית מספריים סטנדרטיים בניצב למישור עצם החך.בשלב הבא, בצעו חתך ברקמות הרכות והקשות, שני מילימטרים מאחורי השיניים החותכות. לאחר מכן, משכו מטה את החלק הקדמי של הפה כדי לחשוף את חלל האף, כאשר המספריים מקבילים לחיך. הניחו גזה אחת בתוך חלל האף והשתמשו בשנייה כדי לבצע חתך במבואה (vestibule), תוך חיתוך עד לחתך האחורי.חזור על החתך בצדו השני של הלסת העליונה (maxilla) כדי לנתק אותה מהגולגולת. לאחר מכן, חתוך אותה במרכזה וגזום את רקמת החיך מכל חצי לסת עליונה כדי להגיע לעצם האלבולרית באמצעות מספריים ופינצטה. קלף את רקמות החניכיים מהגבול הקדמי והנח אותן בצלחת עם PBS ו-2% fetal calf serum או FCS; כדי לעבד את החניכיים, העבר אותן לצלוחית תרבית עם 1 mL PBS, 2 mg/mL collagenase type two ו-1 mg/mL DNAs.בצעו חיתוך באמצעות להב כירורגי סטרילי מספר 15. קצצו את הרקמה היטב לפני העברתה למבחנה קונית של 15 milliliter. שטפו את תאי הרקמה שנותרו על הצלחת באמצעות 1 milliliter של P-B-S-F-C-S והעבירו אותם למבחנה.דגרו את הרקמה באינקובטור נערור שחומם מראש בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של EDTA בריכוז 0.5 M ודגרו למשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן, הוסיפו P-B-S-F-C-S עד לנפח של 12 mL וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C, במהירות של 400 ×g למשך שמונה דקות.לאחר הסרת הנוזל העליון, השהה את התאים בשני מיליליטר של P-B-S-F-C-S. סנן את הדגימה דרך מסנן תאים של 70 מיקרון לאחר סבוב של התוצר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ו-320 ×g למשך חמש דקות. השהה מחדש את התאים ב-300 µL של P-B-S-F-C-S.לבסוף, ספרו את התאים בעבודה תחת מנדף בטמפרטורה קרירה וכשכיבוי אורות בנפח כולל של 100 µL, הוסיפו 0.2 עד 0.5 µg מכל נוגדן נבחר לכל 1×10⁶ תאים וערבבו קצרות במערבל Vortex. לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות בחושך, הוסיפו 2 mL של P-B-S-F-C-S וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 320 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. כדי לקבע את התאים, שאבו את העלייה, ולאחר מכן, תוך כדי ערבוב ב-Vortex, השביו אותם לסוספנזיה על ידי הוספה של 500 µL של BD cyto perms קרים בטיפות.להשגת השפעות ציטולוגיות, הדגרירו את המבחנות בטמפרטורה של 4°C בחשכה למשך 40 דקות לאחר סבב האינקובציה והערבוב בוורטקס. לאחר מכן, הוסיפו בקצרה 1 mL של BD perm wash buffer, וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 800 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך שבע דקות. לאחר חזרה על שלב השטיפה, שאבו את כל הנוזל למעט 300 µL של תמיסת השטיפה.לאחר מכן, כדי לצבוע את התאים באופן תוך-תאי בנפח כולל של 100 µL, הוסיפו מיקרוגרם אחד מכל נוגדן נבחר לכל 1×10⁶ תאים. ערבבו קצרות במערבל Vortex והדגירו בחושך למשך 30 דקות. לאחר שטיפת התאים פעמיים כפי שבוצע קודם לכן והסרת כל הנוזל העליון (supernatant), השביו את התאים ב-300 µL של BD perm wash buffer קר וטרי.לאחר ערבול קצר ב-vortex, סננו את התו suspension למבחנות fax. שמרו את המבחנות על קרח או במקרר בחשיכה עד לביצוע אנליזת fax. תאי חניכיים שנאספו במשותף משני עכברים נאיביים.הבדיקות בוצעו בציטומטר זרימה מדגם LSR two ונולאו באמצעות תוכנת FlowJo. תרשימי ה-side scatter וה-forward scatter המוצגים כאן מדגימים את התפלגות התאים. אסטרטגיית ה-Gating לזיהוי לימפוציטים, מונוציטים, תאי דנדריטיים וגרנולוציטים מצוינת לצורכי השוואה.איור זה מציג גרף FACS הממחיש תאי חניכיים שנוקו מעכברים שהודבקו ב-P gingivalis כ-21 ימים לאחר מתן דרך הפה (oral gavage) במסגרת פריודונטיטיס ניסויית. ניתן לזהות בקלות עלייה באוכלוסיות תאי חיסון שונות בעכברים המודבקים בהשוואה לעכברים נאיביים המוצגים כאן. תאי חיסון בחניכיים המעובדות מזוהים על ידי בחירת תאים (gating) המבטאים את הסמן ההמטופואטי CD 45.תאים אלו הופרדו עוד יותר לתאי T חיוביים ל-CD3, כפי שמוצג באיור זה. נויטרופילים זוהו אף הם על פי ביטוי המולקולות LY6G ו-CD11b. לבסוף, תאי לנגרס (Langerhans cells) ותת-אוכלוסייה של תאים דנדריטיים אפיתליאליים זוהו באמצעות gating של תאים חיוביים ל-MHC class II וחיוביים ל-CD11c, וביטוי של EPAM ו-RIN CD207. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש וחצי עד חמש שעות, במידה שהיא מבוצעת כראוי בהתאם לנוהל זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון real-time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים בתא בודד לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לבחון את התגובה המקומית ב-GVA החניכיים לכל פגיעה בתחום המחקר הפריודונטלי. טכניקה זו אפשרה לנו להבהיר את תפקידם של תאים חיסוניים ולא-חיסוניים של ה-G GVA בפתוגנזה של פריודונטיס ניסיונית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הבידוד והעיבוד של GVA משתן במטרה להשיג תרחיף של תאים בודדים, אשר יעבור בהמשך לצביעה של ויראוסים חוץ-ותאית לצורך ניתוח בציטומטריה עם זרימה.

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד של בתאי גזע מבלוטת הרוק עכבר מתואר. שיטה מעסיקה עיכול אנזימטי מכני, והיתרי הבידוד של salispheres המכילה תאים בעלי מאפיינים של בתאי גזע.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד של רשת תאי החיסון של חניכיים ממודל עכבר. העיכול האנזימטי משחרר את רקמת החניכיים מהשיניים והעצם המצורפות, אשר מתעכלת באופן מכני נוסף, ומשחרר תאים חיסוניים מהחניכיים. התאים המבודדים מוכנים לניסויים אימונולוגיים.

בידוד רשת תאי מערכת החיסון של חניכיים מחסימות שיניים מורין

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, יעילה ועדינה לבידוד תאים בודדים המתאימים לניתוח RNA-seq חד-תאי משיניים שיניים חד-תאיות של עכבר, שיניים שיניים לבנות עכבר ושיניים אנושיות הגדלות ללא הרף.

בידוד מהיר של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות

למד לבודד ולעבד תאי חניכיים מעכברים לצורך ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו מאפשרת זיהוי אוכלוסיות תאים שונות ומחקר תגובות חיסוניות בחניכיים.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

גלה סרטונים נוספים