אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic
6 במאי 2013
אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום במהירות לסוכרת מסוג 1 בעכברים על ידי העברת תאי T סוכרתיים מעכברים טרנסגניים לעכברים, שחסרים תאי T ו-B אנדוגניים. התחל בקצירת הטחול ובלוטות הלימפה מהעכברים התורמים וטיהור ארבעת תאי ה-T החיוביים של CD. לאחר מכן, העבירו את תאי ה-T המטוהרים של התורם לעכברים ללא החלקה.
לאחר מכן עקוב אחר העכברים הנמענים להתפתחות סוכרת מסוג 1. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור פתוגנזה של סוכרת ולחקור התערבויות טיפוליות בהשוואה לשיטות אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו של העברת תאי T חיוביים BDC 2.5, CD ארבעה לנמענים שאינם מחליקים, הוא התפתחות מהירה וניתנת לשחזור של סוכרת מסוג 1.
עבור תורמי CD סוכרתי, ארבעה תאי T חיוביים משתמשים בעכברי BDC 2.5 נקבות טרום סוכרתיות בנות שישה שבועות שנקבעו כנקביות ללא סוכרת על ידי מדידת גלוקוז בשתן. כדי להסיר את הטחול ובלוטות הלימפה, יש להשרות את הפרווה באתנול 70%, ואז לחתוך את העור, למשוך את העור עד לחשיפת שרירי הגפיים הקדמיות. בסמוך לבסיס הגפיים הקדמיות צריכות להיות גלויות שתי בלוטות לימפה מכל צד אחוז בזהירות בכל בלוטת לימפה בפינצטה קטנה והסר אותה על ידי חיתוך רקמת החיבור.
לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר אחד בצפק בעזרת המספריים הקטנים. עכשיו תפסו בעדינות את הטחול במרכז. חתוך בזהירות את רקמת החיבור ואת השומן המצורף.
לאחר מכן הסר את הטחול, התחרה, הטחול ובלוטות הלימפה ב -10 מיליליטר DMEM על קרח. עם קצה בוכנת מזרק סטרילית של 10 מיליליטר, לחץ בעדינות על איברי הלימפה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. כדי להשיג תרחיף תא בודד.
שטפו כל מסננת במיליליטר אחד של DMEM מספר פעמים כדי למקסם את התאוששות התאים. לאחר מכן העבירו את התאים שנאספו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-400 גרם למשך שבע דקות. בטמפרטורת החדר, השעו מחדש את גלולת התא בשלושה מיליליטר של מאגר CK.
כעת דגרו על כל טמפרטורת החדר למשך חמש דקות. כדי להוציא את כדוריות הדם האדומות מוסיפים כעת 12 מיליליטר של DMEM וכדורים את התאים על ידי צנטריפוגה. שטפו את כדור התא פעם ב -10 מיליליטר DMEM.
לאחר מכן, אנו משעים את התאים בחמישה מיליליטר של מאגר צביעת עובדות, ומשתמשים במיקרוסקופ ניגוד פאזה ובציטומטר המו כדי לספור את מספר התאים הקיימאים. כעת הסר בערך 10 פעמים 10 מתוך ששת התאים לכל בקרת צביעה. כמו כן, לצבוע את התאים בנוגדנים חד-שבטיים של עכבר כדי למיין תאי CD טרנסגניים לא פעילים ארבעה תאי T חיוביים.
דגרו על כל הדגימות האלה בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות. כעת שטפו את התאים בנפח הצביעה פי שלושה ממאגר הפקס והשעו מחדש את התאים במאגר פקס אחד עד פעמיים 10 לשבעה תאים למיליליטר למיון דגימה ו-300 מיקרוליטר לבקרות כתמים בודדים. לאחר מכן, העבירו את דגימת התא דרך צינור מכסה מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר.
כדי להסיר גושי תאים לעבד את הדגימות עבור סדרן תאים עם מפעיל מיומן אפשר כשלוש שעות, כולל זמן התקנה למיון בערך 1.5 כפול 10 עד השמיני סה"כ CD נאיבי טרנסגני ארבעה תאי T חיוביים. אתה יכול לצפות בערך 2.5 כפול 10 מתוך ששת התאים לעכבר וקצב המיון יהיה בערך פי שניים פי 10 מהאירועים הרביעיים בשנייה במכשיר כמו BD Fox Aria. אסוף את התאים הממוינים לשלושה מיליליטר של DMEM.
רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים וצנטריפוגה אותם למשך שבע דקות. ב-400 גרם, אנו משעים את כדורי התא במי מלח סטריליים עם פוספט לצורך העברת תאי T מאמצים. בעזרת מזרק מיליליטר אחד במחט בגודל 18, השהה בעדינות את ה-CD המטוהר בפקס ארבעה תאי T חיוביים.
טען את המזרק של מיליליטר אחד ואז לקראת ההזרקה, חבר מחט 27 נקודות חצי מד למזרק. רסנו את העכברים המקבלים החלקה על הקשר ונגבו את זנבם באתנול 70% כדי לחטא את מקום ההזרקה. לאחר מכן הזריק פעם עשירית מתוך ששת ה-CD המטוהר, ארבעה תאי T חיוביים לכל עכבר לכל אחד מוורידי הזנב הצדדיים.
כשאתה מבצע את הזרקות וריד הזנב שלך, וודא שאתה לא מכריח את הבוכנה. אם המחט אכן נמצאת בווריד, ההזרקה שלך אמורה להתרחש כמעט ללא התנגדות החל מחמישה ימים לאחר העברת תאי ה-T. עקוב אחר העכברים המקבלים החלקה מדי יום להתפתחות סוכרת מסוג 1.
מדוד את רמת הגלוקוז בשתן באמצעות רצועות ריאגנטים בהתאם ליצרנים ולהוראות. שימו לב שעכברים עם שתי קריאות גלוקוז רצופות בשתן של יותר מ-250 מיליגרם לדציליטר נחשבים לסוכרתיים. בניסוי טיפוסי, כל עכבר תורם BDC 2.5 מניב בערך פי שניים וחצי פי 10 מתוך ששת תאי ה-CD הטרנסגניים הנאיביים ארבעה תאי T חיוביים לאחר מיון תאים לאחר העברה מאמצת של CD סוכרתי ארבעה תאי T חיוביים, העכברים היו במעקב אחר ריכוזי הגלוקוז בשתן.
העברה מאמצת של מספר קטן של תאים מעכברים תורמים BDC 2.5 גרמה לסוכרת מסוג 1 בכל המושתלים ללא החלקה עד היום ה-11. כאשר היא נעשית כראוי, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כשמונה שעות מקצירת האיברים ועד להעברת תאי T.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה הניתנת לשחזור להשראת סוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים, באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T CD4+ ראשוניים הספציפיים לאנטיגן של אייlets.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- חקר סוכרת
- מודלים של עכברים טרנסגניים
רקע
- סוכרת מסוג 1 היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בהרס של תאי בטא המייצרים אינסולין.
- הבנת המנגנונים של T1D עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
- שיטות נוכחיות להשראה של T1D עשויות להיות גוזלות זמן ומשתנות.
- מחקר זה שואף לספק מודל יעיל יותר לצורכי מחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה וניתנת לשחזור להשראה של T1D בעכברים.
- סיוע בחקר הפתוגנזה של סוכרת.
- בחינת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות עבור T1D.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר טחולים וקשרי לימפה מעכברי תורמים.
- טיהור תאי T מסוג CD4+ מהרקמות שנקצרו.
- העברה אדופטיבית של תאי ה-T המטוהרים לעכברי רקב שחסרים תאי T ו-B אנדוגניים.
- מעקב אחר עכברי הרקב לצורך זיהוי התפתחות של סוכרת מסוג 1.
תוצאות עיקריות
- השיטה השחילה בהצלחה T1D בעכברי מקבל תוך שבועיים.
- הוכחשה הדירות (reproducibility) בפיתוח הסוכרת.
- סופקו תובנות לגבי תפקידן של תאי CD4+ T בפתוגנזה של הסוכרת.
- השיטה סייעה למחקרים נוספים על התערבויות טיפוליות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע גישה מהימנה לחקר T1D בעכברים.
- ניתן להשתמש בו כדי לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס הסוכרת.
- השיטה עשויה לקדם את פיתוחן של תרפיות חדשות עבור T1D.
שאלות נשאלות השכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השראה מהירה של סוכרת מסוג 1 בעכברי NOD.SCID באמצעות העברה אדופטיבית של תאי CD4+ T מטוהרים וספציפיים לאיילטורים, מאפשרת הערכה מואצת של מנגנוי המחלה והתערבויות טיפוליות. מודל זה מייעל את שלבי הגילוי המוקדמים והפחתת הסיכונים המכניסטיים על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור ויעילה מבחינת זמן למחקר סוכרת אוטואימונית. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הפחתת השונות הניסויית וזמני המחזור בקווי מחקר של אימונולוגיה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מנגנונים אוטואימוניים המניעים את הרס תאי הבטא.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות T-cell דיאבטוגניות in vivo.
- תומך בביטחון חיזוי לגבי קשרי גומלין בין מטרה למסלול ב-T1D.
- מאיץ את מיון האסטרטגיות האימונו-מודולטוריות בתיקי פיתוח בשלבים מוקדמים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo סטנדרטית עם התחלה מהירה להערכת התערבויות מועמדות.
- מבטיח השראה עקבית של המחלה, התומכת באמינות ובניתבנות של הבדיקה.
- מאפשר ניטור כמותי של הופעת הסוכרת באמצעות ספי סוכר בשתן.
- מכין מודלים של בעלי חיים שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקת תרכובות המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים חיסוניים הרלוונטיים למחלה שנצפו ב-T1D בבני אדם.
- תומך ברציפות משלב הגילוי המכניסטי ועד לתיקוף טיפולי פרה-קליני.
- מקצר את הזמן להשגת נתונים ברי-ביצוע עבור החלטות קידום מותאמות סיכון.
- מקל על פיתוח סמנים ביולוגיים על ידי אפשור השראה מבוקרת של המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מודל העברה אדופטיבי זה מגשר בין השלב המוקדם של הגילוי לבין התיקוף הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להשראה מהירה וניתנת לשחזור של סוכרת אוטואימונית in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי הרס תאי בטא המתווך על ידי תאי T ומעורבות של מסלולים חיסוניים.
- סריקה: מספק פלטפורמה חסונה להערכת תרכובות immunomodulatory ותכשירים ביולוגיים.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות כמותיות של הופעת המחלה והתקדמותה באמצעות מדידות גלוקוז בשתן.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה למנגנוני מחלה אנושיים לצורך המשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה ניתנת להרחבה באותו יום, הניתנת להתאמה בין צוותי מחקר באימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודלים של סוכרת המונעת על ידי תאי T ובאימות מטרות.
- ערך תפעולי: מקצר את משך הפרוטוקול ומבטל את הצורך בהקרנה, ובכך משפר את התפוקה ואת השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) עבור נכסים אימונולוגיים ומועמדים תרפויטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות אספקת נתוני יעילות in vivo מהירים ואמינים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאי T, ציטומטריית זרימה וטיפול בבעלי חיים.
- נדרשת גישה למכשור למיון תאים ולמתקני בעלי חיים מאושרים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת תאים ולניטור סוכרת.
- התאמה למודלים אוטואימוניים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל לזני מקבלים עם חסר חיסוני ולתורמים טרנסגניים עם TCR ספציפי לאיילטורים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Isolation of T Cells from Spleen and Lymph Nodes of BDC2.5 Mice
2:52
Fluorescence-activated Cell Sorting of Diabetogenic CD4+ T Cells from BDC2.5 Mice
4:28
Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells from BDC2.5 Mice
5:12
Monitoring Recipient Mice for Hyperglycemia and T1D
5:36
Results: Adoptive T-cell Transfer
6:10
Conclusion
