Name: אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: למד אינדוקציה מואצת של סוכרת סוג 1 בעכברים באמצעות העברת מאמצת של תאי CD4+ T ספציפיים לאנטיגן האיי. שיטה זו מאפשרת פיתוח מהיר וחוזר של מחלת הסוכרת תוך שבועיים, ומסייעת לחוקרים לחקור את מנגנוני המחלה ואת אפשרויות הטיפול בה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. רוברט בונו וניל כריסטנסן על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מכללת פנסילבניה סטייט של קרנות רפואה.

1. בידוד של תאי T מטחול ובלוטות לימפה של עכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש BDC2.5 נקבות עכברים טרום סוכרת 6 בן שבוע כתורמים של CD4 + T תאי diabetogenic. עכברים צריכים להיות חופשיים, כפי שנקבעו על ידי סוכרת מדידת גלוקוז בשתן (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל עכבר באמצעות חנק CO 2 ולהסיר את בלוטות הלימפה בטחול, בבית השחי וזרוע בתנאים סטריליים. כדי להסיר את הטחול, יש להשרות את הפרווה עם 70% אתנול, ואז לחתוך ולחזור בו עור. הטחול יהיה גלוי כאיבר אדום כהה בצדו השמאלי של העכבר. ביצוע חתך 1 אינץ&#39; בצפק באמצעות מספריים הקטנים ולתפוס בעדינות את הטחול במרכז עם פינצטה קטנה. לקצץ בזהירות את רקמות חיבור ושומן מצורף ככל האפשר ולהסיר את הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הטחולים ובלוטות לימפה ב10 מ&quot;ל בינוני של Dulbecco&#39;s-Modified הנשר (DMEM) בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעיה תא בודדת באמצעות הסוף הדואר של בוכנת מזרק 10 מ&quot;ל סטרילי ללחוץ את האיברים הלימפה בעדינות דרך מסננות 70 מיקרומטר תא (אחד טחול למסננת ו4-6 בלוטות הלימפה במסננת) לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li></ol> במהלך התהליך, יש לשטוף את כל מסננת עם 1 מ&quot;ל DMEM מספר פעמים על מנת למקסם את ההתאוששות של תאים מהמסננת. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים שנאספו מצינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטי ב300-400 XG במשך 7 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse תאי דם אדומים, לבטל את supernatant, מחדש להשעות את התאים ב5 מיליליטר אמוניום-כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (pH 7.2), ודגירת ההשעיה ACK התאים ב RT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של DMEM להשעית ACK-תא וצנטריפוגות הצינור כאמור לעיל. שטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מ&quot;ל DMEM. </li></ol> 2. מיון תא הקרינה המופעל מסוג CD4 + T Diabetogenic תאים מהעכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מחדש להשעות ב5 מ&quot;ל FACS שלTaining חיץ ולספור את מספר תאי קיימא (באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב וhemocytometer) על ידי הרחקת trypan הכחולה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחיץ FACS, להתאים את עוצמת קול ההשעיה תא 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. הסר ~ 1 x 10 6 תאים לכל שליטה מכתים (1 מס 3 כתמי כתם, בודדים). כתם המדגם עבור CD4 המהונדס שאינם מופעל + תאי T מסוג CD4 עם אנטי (APC), אנטי TCR Vβ4 (FITC) ונוגדנים נגד CD62L (PE) חד שבטיים (מב) בצינור 15 מ&quot;ל. לבצע מכתים תא באמצעות ריכוזי מב שהוצעו על ידי היצרן עבור 20-30 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פקדי כתם בודדים מדגם ועם חיץ FACS ב&gt; 3X נפח התגובה מכתים. צנטריפוגה צינור ב300-400 XG, להסיר את supernatant, מחדש להשעות את התאים בFACS חיץ (1-2 x 10 7 תאים / מ&quot;ל למיון והמדגם 300 μl עבור פקדי כתם יחידים) ולאחסן על קרח עד למחרת צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת התא דרך מיקרומטר תא 35צינור כובע מסננת כדי להסיר גושי תאים. מיין את דוגמאות לסוג CD4 + TCR Vβ4 + + CD62L תאים בסדרן תא עם מפעיל מיומן. לאסוף את התאים הממוינים ל3 מ&quot;ל DMEM בצינור 15 מ&quot;ל. לאפשר 2.5-3 שעות, כולל התקנה, כדי למיין 1.5 x 10 8 תאים (מספר המשוער של תאים המתקבלים מ3 עכברים תורמים) בשיעור סוג של 2 x 10 4 אירועים / שני בסך הכל. מצפה ~ 2.5 x 10 6 CD4 מהונדס שאינם מופעל + T תאים לכל עכבר לאחר מיון תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף המיון וצנטריפוגות ל7 דקות ב 300-400 x גרם. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים (2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) בסטרילי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + חינם) להעברת תא T המאמצת. </li></ol> 3. העברת מאמצת של CD4 + T Diabetogenic תאים מעכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ומחט מד ½ 18-1, בעדינות מחדש להשעות את הסוג CD4 +-FACS מטוהרתאי T ולטעון את מזרק 1 מ&quot;ל. כהכנה להזרקה, להחליף 18-1 ½ מחט מד עם 27 ½ מחט מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף 6-8 עכברי נמען NOD.SCID נשיים בן שבוע למנורת חימום עד שהם מפגינים טיפוח התנהגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן עכברי נמען בעוצר ולנגב הזנב שלהם עם 70% (V / V) אתנול לחיטוי אזור ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1-2 x 10 תאים ממוינים / עכבר 6 FACS (בעד 500 PBS μl) לאחד מורידי הזנב לרוחב. </li></ol> אל תדחף את הבוכנה. אם המחט ממוקמת כראוי בווריד, ההזרקה תתקיים כמעט ללא התנגדות. 4. ניטור עכברים נמען ליפרגליקמיה וT1D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחמישה ימים לאחר ההעברה לתא T, עכברי נמען NOD.SCID מנוטרים יומיים לרמת סוכר גבוה בשתן באמצעות רצועות מגיב (באייר Diastix) על פי הוראות היצרן. עכברים עם שתי ברציפות אוריןקריאות סוכר E&gt; 250 מ&quot;ג / ד&quot;ל נחשבות סוכרתית. </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

כל העכברים שוכנו בפן סטייט קולג&#39; למתקן נטול הפתוגן ספציפי רפואה (SPF) בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדיים פן סטייט והשתמש בועדה. החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יכול להיגרם T1D בעכברי נמען ביעילות משתנה על ידי העברת מאמצת של תאים שלמים טחול או תת תאי T מעכברי NOD סוכרתיים או עכברים מהונדסים לTCRs נגזר משיבוטי תא T diabetogenic. אנו מדווחים בזאת שיטה לשחזור כדי לגרום T1D בעכברי נמען בתוך שבועיים ב -100% שכיחות ידי העברת CD62L + BDC2.5 CD4 מהונדס FACS המטוהר + T תאים לעכברים NOD.SCID. יתרונות ספציפיים של מודל העברת תא T BDC2.5 מתואר כאן כוללים האינדוקציה זמן הקצר מאוד של T...

עכבר NOD מפתחת סוכרת אוטואימונית באופן ספונטני וכבר בשימוש נרחב כמודל חיה ל1,2 T1D האנושי. פתוגנזה של T1D בעכברי NOD מאופיינת בחדירה, החל משעת 3-4 שבועות של גיל, של איי הלבלב לנגרהנס על ידי תאי דנדריטים ומקרופגים, ואחריו T ותאי B. שלב זה של הלא הרסני פרי insulitis מוביל להרס איטי, הדרגתי של תאי β בלבלב, ייצור אינסולין, וכתוצאה מהסוכרת גלויה על ידי 4-6 חודשים של גיל 3. העברת splenocytes 4,5, מסוג CD4 + 6,7 או CD8 + 8,9 תאי T מעכברי NOD סוכרתיים הוכחו לתווך סוכרת בעכברי NOD חיסון, מצביע על כך שתאי T איון-reactive לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה T1D. בהתאם לתנאי הניסוי, פיתחה סוכרת בעכברי נמען לאט, במשך מספר שבועות במחקרים אלה. באופן דומה, שיבוטים תא T שונים, שהופקו על ידי זמן רב ויקרהculturing של תאי T diabetogenic, דווח לתווך סוכרת מספר שבועות לאחר העברה לעכברים נמען 7,10. עם הזמינות של עכברים הטרנסגניים לבטא TCRs נגזר מסוג CD4-או שיבוטים תא T diabetogenic CD8 מוגבלים, מספר מעבדות שלאחר מכן הראה כי תאי T טחול מעכברים כאלה היו מסוגלים להעביר את הסוכרת לנמענים 11-13. באופן ספציפי, BDC2.5 עכברי NOD הם מהונדס לBDC2.5 TCR, שהוא ספציפי לchromogranin, חלבון בתאים בטא בלבלב 14-16. העברת בשלם או מופרדים תאי טחול בלתי פעילים מBDC2.5 עכברי גלוי סוכרת או סוכרת prediabetic הועברו לעכברים NOD ילוד או immunodeficient ביעילות משתנה 11,17-19 מבחנה המופעל או. אנו מתארים שיטה פשוטה שמנצלת מסוג CD4 + T מהונדס מטוהרים תאים מעכברי BDC2.5 טרום סוכרת לגרום T1D בעכברי נמען ביעילות וconsiste גבוהיםncy. מספר גדול של CD4 נאיבי, איון אנטיגן ספציפי + T תאים מבודדים מעכברים אלה על ידי מיון תא הקרינה המופעל (FACS) לסוג CD4 + CD62L + T תאים המבטאים את השרשרת המהונדס TCR Vβ4. מטוהרים תאי T מהונדסים מועברים לאחר מכן ללא הפעלה לעכברים NOD.SCID, אשר חוסר T תפקודי ותאי B ו-הם insulitis וסוכרת חופשי 20. את עכברי הנמען מנוטרים לריכוזים גבוהים של גלוקוז בשתן מעידים T1D, אשר מתפתח במהירות תוך שבועיים לאחר העברת תאי T. בניגוד לשיטות אחרות שיעביר תאי T diabetogenic עם ספציפיות הטרוגניים, הפרוטוקול שלנו משתמש FACS-ממוין CD4 + תאי T שכמעט אך ורק מבטאים את BDC2.5 TCR diabetogenic. בשל ההומוגניות שלהם, רק מספר קטן של תאי T שהועברו (~ 1x10 6 תאים / עכבר) נדרשים לפיתוח T1D מהיר בתוך 2 שבועות ב 100% פגיעה. יתרון נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא שirradiation של עכברי נמען אינו הכרחית כפי שהיא לכמה שיטות אחרות. הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא שהיא אינה מאפשרת חקירת התרומה של CD4 ו CD8 תת תאי T או תאי T CD8 במיוחד בסוכרת. הפרוטוקול המתואר יהיה שימושי לחקר התפתחות T1D מהיר, בתיווכו של נאיבי, מסוג CD4 + monospecific תאי T, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות להתערב בביות של תאי ה איון אנטיגן ספציפיים לאיבר המטרה.

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR עכברי NOD טרנסגניים (NOD. Cg-Tg (TCR ואלפא; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td> <td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>הנהון. עכברי SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה כירורגית</td><td></td><td></td><td></td>סטרילית</tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>זוג קטן סטרילי</tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>זוג גדול סטרילי</tr><tr><td>70 &mu; מסנני תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m צינורות מכסה מסננת תאים</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ</td><td></td><td></td> אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) <td>0.15 מ' NH<תת>4</תת>Cl, 1 מ"מ KHCO<תת>3, </תת>0.1 מ"מ Na2EDTA, pH 7.2 בנוזל נדן dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM</td> נוזל נדן <td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> <td>צביעה FACSPBS, 0.2 מ"מ EDTA, 0.5% BSA/FCS,</td></tr><tr>מיקרוסקופ <td></td><td></td><td></td><td>ניגודיות פאזה</td></tr> מעוקר מסנן <tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כחול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפן אנטי-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>שיבוט RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946; 4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>שיבוט KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט 553151</td><td>MEL-14</td></tr><tr><td>סדרן תאים</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>למשל BD FACSAria III</td></tr><tr><td>מנורת</td><td></td><td></td><td></td>חום</tr><tr><td>מסנן</td><td></td><td></td><td></td>עכבר</tr><tr><td>1 מ"ל</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; מחטי מד (סטריליות)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; מחטי מד (סטריליות)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של cd4 + t תאי diabetogenic

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

סוכרתי עכבר nonobese (NOD) באופן ספונטני מתפתח סוכרת אוטואימונית לאחר 12 שבועות של גיל והוא מודל החיה נחקר רב ביותר מסוג אנושי סוכרת 1 (T1D). מחקרי תא העברה בעכברי נמען מוקרנים קבעו כי תאי T הם מרכזי בפתוגנזה T1D במודל זה. במסמך זה אנו מתארים שיטה פשוטה למהירות לגרום T1D ידי העברת מאמצת של מטוהרים, מסוג CD4 + T תאים ראשוניים מעכברי NOD טרום סוכרת מהונדסים לקולט איון הספציפי לתא T (TCR) BDC2.5 לעכברים נמען NOD.SCID. יתרונותיו העיקריים של טכניקה זו הם שבידוד והעברת מאמצת של תאי T diabetogenic יכולה להסתיים בתוך באותו היום, קרינה מהמקבלים אינה נדרשת, ושכיחות גבוהה של T1D הוא הושרה בתוך 2 שבועות לאחר העברת תאי T. כך, מחקרים של הפתוגנזה והתערבויות טיפוליות בT1D יכולים להמשיך בקצב מהיר יותר מאשר עם שיטות המסתמכות על אוכלוסיות תאי T הטרוגניים או שיבוטיםנגזר מעכברי NOD סוכרתיים.

התוצאות שלנו מראות את הבידוד של תאים מהונדסים המבטאים BDC2.5 CD62L, שהוא קריטי לתאי T לבית לאיברים משניים הלימפה, כגון בלוטות לימפה בלבלב. הממצאים שלנו עוד יותר להפגין את היכולת חזקה של אוכלוסיית תאי T monospecific זה כדי להעביר במהירות וביעילות T1D לעכברים נמען NOD.SCID. בידוד של CD4 + T תאי diabetogenic מBDC2.5 עכברים מוצג באיור 2. כ 5 10 x 7 תאים מטחול ובלוטות לימפה ונקווה התקבלו לכ...

אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשרות במהירות סוכרת מסוג 1 בעכברים על ידי העברה של תאי T דייבטוגניים מעכברים טרנסגניים לעכברים החסרים תאי t ו-b אנדוגניים. התחילו באיסוף הטחולים וקשרי הלימפה מהעכברים התורמים ובניקוי של תאי T חיוביים ל-CD ארבע. לאחר מכן, העבירו באופן אדופטיבי את תאי ה-T המנוקים מהתורם לעכברי רסיפיינט מסוג non skid.לאחר מכן, יש לעקוב אחר התפתחות של סוכרת מסוג 1 בעכברי המקבלים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את הפתוגנזה של סוכרת ולבחון התערבויות טיפוליות בהשוואה לשיטות אחרות. היתרון המרכזי של טכניקה זו, של העברת תאי T חיוביים ל-CD4 מסוג BDC 2.5 למקבלים שאינם skid, הוא הפיתוח המהיר והניתן לשחזור של סוכרת מסוג 1.עבור תורמים של תאי T חיוביים ל-CD4 דיאבטוגניים, השתמשו בעכברים נקביים מסוג BDC 2.5 פרה-דיאבטיים בני שישה שבועות, אשר נקבע כי הם נקיים מסוכרת באמצעות מדידת גלוקוז בשתן. כדי להוציא את הטחול ואת קשרי הלימפה, השרו את הפרווה ב-70% ethanol, לאחר מכן חתכו את העור והסיטו אותו עד לחשיפת שרירי הגפיים הקדמיות. בבסיס הגפיים הקדמיות, שני קשרי לימפה בכל צד אמורים להיות גלויים. אחזו בזהירות בכל קשר לימפה בעזרת פינצטה קטנה והוציאו אותו על ידי קיצוץ הרקמה החיבורית.בשלב הבא, בצעו חתך של one inch בפריטונאום באמצעות המספריים הקטנים. כעת, אחזו בעדינות בטחול במרכזו. הסִירו בזהירות את רקמת החיבור ואת השומן הצמוד.לאחר מכן הוצא את הטחול, שطف את הטחול ואת קשרי הלימפה ב-10 milliliters של DMEM על קרח. בעזרת קצהו של בוכנת מזרק סטרילית של 10 milliliters, לחץ בעדינות את האיברים הלימפוידיים דרך מסננת תאים של 70 micrometer, כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים.שטפו כל מסננת עם מיליליטר אחד של DMEM מספר פעמים כדי למקסם את התשוא של התאים. לאחר מכן, העבירו את התאים שנאספו למבחנה קונוית של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך שבע דקות. בטמפרטורת החדר, השביו את משקע התאים בשלושה מיליליטר של CK buffer.כעת דגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. כדי להמיס את כדוריות הדם האדומות, הוסיפו כעת 12 milliliters של DMEM ורסבו את התאים באמצעות סבוב בצנטריפוגה. שטפו את משקע התאים פעם אחת ב-10 milliliters של DMEM.בשלב הבא, נשעיה את התאים בחמישה מיליליטר של תמיפת צביעה (staining buffer), ונשתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה ובסופר תאים (hemocytometer) כדי לספור את מספר התאים החיוניים. כעת נסיר כ-1×10⁶ תאים עבור כל בקרת צביעה. כמו כן, נסמן את התאים באמצעות נוגדנים מונוקלונליים של עכבר כדי למיין תאי T חיוביים ל-CD4 טרנסגניים שאינם מופעלים.דגרו את כל הדגימות הללו בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך 30 דקות. כעת שטפו את התאים בשלושה מכפי נפח הצביעה של FACS buffer והשביו את התאים לתרחיף ב-FACS buffer בריכוז של 1-2 × 10⁷ תאים ל-mL עבור דגימת המיון ו-300 µL עבור בקרות צביעה בודדת. לאחר מכן, העבירו את דגימת התאים דרך שפופרת עם מסנני תאים של 35 µm.כדי להסיר גושי תאים, יש לעבד את הדגימות עבור מיין תאים (cell sorter) עם מפעיל מיומן. הקציאו כשלוש שעות, כולל זמן ההגדרה, כדי למיין כ-1.5 × 10⁸ תאי T נאיביים טרנסגניים CD4 חיוביים בסך הכל. ניתן לצפות לכ-2.5 × 10⁶ תאים לעכבר, וקצב המיון יהיה כ-2 × 10⁴ אירועים לשנייה במכשיר כגון ה-BD FACS Aria. אספו את התאים הממוינים לתוך 3 mL של DMEM.רשמו את המספר המוחלט של התאים הממוינים וסבבו אותם בצנטריפוגה במשך שבע דקות. ב-400 Gs, נשעה את משקעי התאים ב-phosphate buffered saline סטרילי לצורך העברה אדופטיבית של תאי T. באמצעות מזרק של 1 mL ומחט בכיול 18 gauge, שעה בעדינות את תאי ה-T חיוביים ל-CD4 שפוייו בשיטת FACS.מלאו את המזרק בנפח של 1 mL, ולאחר מכן, כהכנה להזרקה, חברו למזרק מחט במידה של 27.5 gauge. רסנו את העכברים המיועדים לקבלת ה-knot skid ונגבו את זנבם ב-70% ethanol כדי לחטא את נקודת ההזרקה. לאחר מכן, ההקיקו 1×10⁶ תאי T חיוביים ל-CD4 מטוהרים לכל עכבר לאחד מוורידי הזנב הלטרליים.בעת ביצוע ההזרקות לווריד הזנב, ודאו שאינכם דוחפים את הבוכנה בכוח. אם המחט נמצאת אכן בתוך הווריד, ההזרקה אמורה להתבצע כמעט ללא התנגדות. החל מחמישה ימים לאחר העברת תאי ה-T, עקבו מדי יום אחרי העכברים המקבלים (nod skid) כדי לזהות התפתחות של סוכרת מסוג 1.מדדו את רמת הגלוקוז בשתן באמצעות רצועות בדיקה בהתאם להוראות היצרן. שימו לב כי עכברים עם שתי מדידות רצופות של גלוקוז בשתן הגבוהות מ-250 milligrams per deciliter נחשבים לסוכרתיים. בניסוי טיפוסי, כל עכבר תורם מסוג BDC 2.5 מניב כ-2.5 × 10⁶ תאי T נאיביים טרנסגניים מסוג CD4 positive לאחר מיון תאים; לאחר העברה אדופטיבית של תאי T מסוג CD4 positive דיאבטוגניים, העכברים נוטרו מבחינת ריכוזי הגלוקוז בשתן.העברה אדופטיבית של מספר קטן של תאים מעכברי תורם מסוג BDC 2.5 גרמה לסוכרת מסוג 1 בכל מקבלי השתל שאינם skid עד היום ה-11. כאשר טכניקה זו מבוצעת כראוי, ניתן להשלימה תוך כשמונה שעות מרגע קצירת האיבר ועד להעברת תאי ה-T.

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול שלנו פותחה כדי נקייה בקלות לספק איים או תאים תחת הקפסולה הכליה של עכברים. תאים מרוכזים לתוך כדורי בצינור הסופי משמש השתלת התאים תחת הקפסולה כליות. הקלות של טכניקה זו מפחיתה את הלחץ על התאים ואת העכבר.

השתלת איי הלבלב לקופסית הכליה בעכברים סוכרתיים של

אנו מתארים היווצרות כבדה הניא איון בSTZ (streptozotocin)-מושרה עכברים סוכרתיים על ידי העברת גנים מNeurogenin3 (Ngn3) וBetacellulin (BTC) באמצעות וקטור עוזר תלוי adenoviral (HDAd) והיפוך של היפרגליקמיה. השיטה שלנו לוקחת את היתרונות של וקטורי adenoviral עוזר תלויים עימם היעיל ביותר בתמרת vivo וביטוי הגנים לאורך זמן.

כינון ניאו איילט בכבד של עכברים סוכרתיים על ידי העברת גני Helper תלוי adenoviral וקטור בתיווך

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת הדמיה לדמיין תאי בטא מושתלים המבטאים לוציפראז בעכבר שאינו סובל מהשמנת יתר. הכנסת טחול מעכבר סוכרתי מובילה להרס מתקדם של תאי בטא, המאושר חזותית על ידי ירידה בעוצמת האור לאחר החדרת המצע.

הדמיה של תאי בטא טרנסגניים בעכבר מדוכא חיסון המאותגר בטחול סוכרתי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזעיר פולשנית להשתלה והדמיה של תאי NIT-1 בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) - עכברים משולבים בעלי כשל חיסוני חמור המאותגרים בטחול מטוהר מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים.

ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

מבחני cytotoxicity למדוד טבעי התא הרוצח התגובות ממס ל-HIV נגועים בתאי מוגבל על ידי טוהר התאים היעד. אנו מדגימים כאן את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 נגוע T-cell תקיעות ראשונית על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

למד אינדוקציה מואצת של סוכרת סוג 1 בעכברים באמצעות העברת מאמצת של תאי CD4+ T ספציפיים לאנטיגן האיי. שיטה זו מאפשרת פיתוח מהיר וחוזר של מחלת הסוכרת תוך שבועיים, ומסייעת לחוקרים לחקור את מנגנוני המחלה ואת אפשרויות הטיפול בה.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

גלה סרטונים נוספים