קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא לבצע בדיקה מהירה של פעילות אנזימים מיקרוביאליים חוץ-תאיים במגוון סביבות טבעיות. דבר זה מושג על ידי הוספת דגימות של מים או תגליאיי קרקע למיקרו-פלטה כדי להשיג חזרות מספיקות. כשלב שני, מתווסף לבארות המיקרו-פלטה סובסטרט כולורמטרי או פלואורומטרי סינתטי, המאפשר את התרחשות התגובות האנזימטיות. לאחר מכן, נמדדים הבליעה (absorbance) או הפלואורסצנציה כדי לקבוע את כמות תוצר הסיום ששוחרר במהלך התגובה.

התוצאות מראות הבדלים בפעילות אנזימים חוץ-תאיים בין דגימות, בהתבסס על הבליעה או הפלואורסצנציה של התגובה הסופית. היום נדגים כיצד למדוד פעילות אנזימים חוץ-תאיים בסביבות טבעיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באקולוגיה מיקרוביאלית, כגון קצבי עיבוד חומר אורגני ומנרליזציה של חומרים מזינים בקרקעות, במשקעים ובמים. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בשימוש בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים בשל הקושי להפריד חלקיקים מתמיסת התגובה, במיוחד בעת בדיקת מספר רב של דגימות.

הדגמה חזותית של הליך זה היא קריטית, כיוון שסידור הפלטה עשוי להיות קשה ללמידה, ובמידה ונלקחות מדידות במספר נקודות זמן, ההליך הופך למאתגר יותר. אנליזה כולורית של פעילות אנזימטית חוץ-תאית עבור קרקעות ומשקעים מתחילה בהכנת באפר של תסביס ותמיסות סטנדרט כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט עבור קרקע; הכינו תמיסת בוץ (slurry) של כל דגימה המיועדת לבדיקה בתוך מבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 milliliter. הוסיפו ריכוז של כ-one gram per milliliter תוך שימוש ב-50 millimolar acetate buffer עבור משקעים.

הוסף מספיק בופר אצטט כדי להפוך את התעלה לנזילה בקלות. הנפח המדויק של התעלה הדרוש ישתנה בהתאם למספר האנזימים הנבדקים, אך מומלץ נפח מינימלי של five milliliters. ערבב כל תעלה ב-Vortex עד שכל גושי האדמה או המשקעים יתפזרו.

שימו לב לנפח הסופי. גזרו את קצות קצות השפיפטים בעזרת מספריים לפני השאיבה. מכיוון שתמיסורי קרקע נוטים לסתום את השפיפטים, ערבבו שוב כל תמיסור במערבל (vortex) ושאבו מיד 150 microliters לכל אחד מששת הבארות.

בבלוק באריים עמוקים של 96 בארות. חשוב לבצע ערבול (vortex) יסודי ותכוף. כדי לשמור על חלקיקי קרקע במצב של תליה, השאירו לפחות שתי בארות ריקות בכל בלוק כדי שישמשו כביקורת תשתית.

הכינו בלוק של 96 בארות עבור כל אנזים שייבדק. שפכו כחמישה מיליליטרים של באפר אצטט למאגר פיפט (pipette reservoir) והשתמשו בפיפט רב-ערוצי (שמונה ערוצים) כדי להוסיף 150 microliters של הבאפר לשתי הבארות האחרונות של כל דגימה.

עבור בקרות תחליל הדגימה ושני בארי הבקרת הסובסטרט. מזגו כ-10 מיליליטר של תמיסת p-nitro phenyl phosphate או תמיסת סובסטרט PNP המתאימה למאגר פיפטה, והשתמשו בפיפטה בעלת שמונה ערוצים כדי להוסיף 150 µL של תמיסת הסובסטרט לארבעת הבארים הראשונים של כל דגימה ולשני בארי בקרת הסובסטרט. רשמו את הזמן עם תחילת התגובה, מיד עם הוספת תמיסת הסובסטרט.

דגרו את הפלטות בטמפרטורת החדר למשך 0.5 עד ארבע שעות. זמן הדגירה המדויק ישתנה בהתאם לרמת הפעילות בדגימות ולאנזים הנבדק. בזמן דגירת הבדיקות, הכינו פלטה שקופה אחת בעלת 96 בארות (microplate).

עבור כל בלוק בארות עמוקות, לצורך קריאת הספיגות, העבירו באמצעות פיפט 190 µL של מים מזוקקים ו-10 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M לכל בארה במיקרופלטה. נתרן הידרוקסיד מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את ה-pH, מה שמעצים את צבע ה-PNP המשוחרר במהלך התגובה לאחר הדגירה. סבבו את בלוקי 96 הבארות בצנטריפוגה ב-2000 עד 5,000 ×g למשך חמש דקות כדי לשקע את חלקיקי הקרקע.

הסרת הנוזל מבלי להפר את המשקע עלולה להיות מאתגרת. יש להימנע משימוש בכמות גדולה מדי של דגימת קרקע בשלב הראשוני. ודאו שביצעתם סרכוז למשך זמן מספיק, והשתמשו בתנועה זהירה אך בטוחה כדי לשאוב את הנוזל.

השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לשאוב 100 µL מכל באר, תוך הקפדה להימנע מהמשקע. העבירו את הנוזל לבאר המתאימה בפלטת מיקרו שקופה של 96 בארות שהוכנה מראש. הפעילו את קורא הפלטחות (Microplate reader) והגדירו את התוכנה הדרושה. רשמו את הבליעה באורך גל של 410 nm. לאחר קביעת המסה היבשה של הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, חשבו את הבליעה הסופית של כל דגימה על ידי חיסור הבליעה של בקרת הדגימה מהבליעה של בדיקת הדגימה.

אם לבקרי התסבסאט יש בליעה גבוהה של יותר מ-0.060, יש להפחית ערכים אלו. לאחר מכן, המשיכו בחישוב הפעילות האנזימטית במיקרומול לשעה לגרם של מסה יבשה באמצעות משוואה זו. לאחר ארגון של מיקרופלט שחור עבור כל אנזים בהתאם לדוגמה המוצגת בפרוטוקול הטקסט, שפכו כחמישה מיליליטר של דגימת המים הראשונה למאגר של פפטה והשתמשו בפפטה בעלת שמונה ערוצים כדי להעביר 200 microliters לכל אחת מהבארות.

בעמודה הראשונה של המיקרופלטה, השליכו את קצות הפפטה המשומשים וחזרו על הפעולה לפי הצורך עבור כל דגימת מים, כדי למלא את עמודות אחת עד תשע. הגדירו בקרות לתיקון הדגימות, הסטנדרטים, הסובסטרט והכיבוי (quenching) באותה מיקרופלטה שחורה שבה נמצאות הדגימות. בקרות הדגימות מכילות מי דגימה ותמיפת בופר ביקרבונט ואינן משמשות לחישוב הפעילות, אך הן ישמשו להדגמת עקביות הקריאות לאורך הניסוי.

בקרות הכיבוי (quench controls) מורכבות ממי דגימה ומכמות סטנדרטית של התג הפלואורסצנטי, ומשמשות למדידת הדיפרקציה של הפלואורסצנציה. בקרות התסבכת (substrate) וסטנדרט במי דגימה מורכבות או מתסבכת מקושרת או מהתג הפלואורסצנטי הסטנדרטי, בהתאמה, ומבופר ביקרבונט. שפכו כ-5 מיליליטר של בופר ביקרבונט בריכוז 5 מילימולרי למאגר פיפטה נקי.

טפטף 50 µL של בופר לבארות 1 עד 9 בשורות d ו-e במיקרופלטה כדי ליצור שתי בארות משכפלות של בקרות דגימה לכל דגימה; החלף את טיפי הפ pipette, ולאחר מכן העבר 200 µL של בופר ביקרבונט לבארות 10 עד 12 בשורות A ו-H. למרות שבהדגמה זו התאורה נשארת חזקה לצורכי צילום, יש להפחית את התאורה הסביבתית על ידי עמעום או כיבוי האורות, מכיוון שהסטנדרט הפלואורסצנטי רגיש לאור. שפוך כ-5 mL של 10 µM של 4-methylumbelliferone או MUB למכל פ pipette נקי, וטפטף 50 µL לבארות 1 עד 12 בשורה H. לאחר מכן, טפטף 50 µL לבארות 1 עד 9 בשורות G ו-F כדי ליצור שלוש משכפלות של בקרות כיבוי (quench controls) לכל דגימה ובקרות סטנדרט כלליות. הנח את המיקרופלטה בחושך או כסה אותה במכסה אטום כדי להפחית את הפירוק של MUB כתוצאה מחשיפה לאור, הדלק את הפלואורימטר והגדר את התוכנה הדרושה כדי שתהיה מוכנה לקריאה לפני הוספת הסובסטרט.

העבירו כ-5 milliliters של תת-מצע מתאים מצופה MUB למאגר פיפטה נקי, והשתמשו בפיפטה של 12 ערוצים כדי להעביר 50 microliters לבארות 1 עד 12 בשורה A ולבארות 1 עד 9 בשורות B ו-C, ליצירת שלושה מבחנים חוזרים עבור כל דגימה ושלוש בקרות תת-מצע; לאחר מכן, רשמו את הפלואורסצנציה באופן מיידי. קראו את הפלואורסצנציה הראשונית מיד לאחר הוספת תת-המצע למיקרופלטה. לאחר הקריאה, הדגירו את המיקרופלטה בטמפרטורת החדר, בחושך או תחת מכסה אטום.

על מנת להפחית את הפירוק של MUB עקב חשיפה לאור. זמן האינקובציה הנדרש למדידת הפעילות האנזימטית הפוטנציאלית המקסימלית תלוי בריכוז האנזים בדגימה. מכיוון שנתון זה אינו ידוע, לפני בדיקת הדגימה, יהיה צורך לקרוא את המיקרופלטה במספר נקודות זמן.

עבור רוב האנזימים, מרווחי זמן של 10 עד 15 דקות לאורך שעה הם הולמים, אם כי דגימות מסוימות בעלות ריכוזים גבוהים יגיעו לשיא לפני 10 דקות. המשיכו לקרוא את הפלואורסצנציה במיקרו-פלטה במרווחי הזמן שנקבעו למשך שעה אחת לפחות. הקפידו להשאיר את המיקרו-פלטה מכוסה או בחשכה בין הקריאות.

עבור כל דגימה בכל רווח זמן, חשבו את ממוצע הפלואורסצנציה הראשונית של הדגימה, ממוצע הפלואורסצנציה הסופית של הדגימה, ממוצע הפלואורסצנציה הסטנדרטית וממוצע פלואורסצנציית בקרת המעכבה (quench control) עבור כל רווח זמן. חשבו את פעילות האנזים ביחידות של m לשעה למיליליטר, באמצעות המשוואה המופיעה בפרוטוקול הכתוב.

בחן את ערכי הפעילות שחושבו עבור כל שלב זמן, וקבע את הפעילות הפוטנציאלית הסופית מתוך שלב הזמן בעל הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי הפעילות ממשיכים לעלות, ייתכן שיהיה צורך בשלבי זמן מאוחרים יותר. אם ערכי הפעילות יורדים לאורך מהלך הריצה, הרץ את התהליך שוב עם שלבי זמן קצרים יותר.

בקרקעות ובמשקעים מימיים קיימות בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזימטית חוץ-תאית כתוצאה מקהילות מיקרוביאליות הצמודות לגשמי החלקיקים. איור זה מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל החלקיקים שהושגו ממשקע הפני השטח של נחל מסדר שלישי בצפון מיסיסיפי, ארה"ב. מחקר קודם הראה כי ניתן לחלק את הקהילות הבקטריאליות על חלקיקי המשקעים מנחל זה לשלוש קבוצות נפרדות, בהתבסס על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהן.

אלו על חלקיקים של 0.063 millimeter, אלו על חלקיקים של 0.1 2 5, 0 0.25 ו-0.5 millimeter ואלו על חלקיקים של one millimeter. ניתוח של דפוסי הפעילות של אנזימים חוץ-תאיים תומך במסקנה זו, כאשר פעילות הפוספטאז דומה בחלקיקים של 0.1 2 5, 0 0.25 ו-0.5 millimeter, אך גבוהה בהרבה בפרקציות של one ו-0.063 millimeter כאשר היא נמדדת באמצעות טכניקת ה-PNP linked substrate. אנזימים אחרים, כגון beta glucco ו-n AGAs, מראים שיאים דומים בחלקיקים העדינים ביותר, אך אינם מוגברים בחלקיקים של one millimeter.

הדגיש את העובדה שאנזימים שונים עשויים להראות התפלגויות סביבתיות שונות, וניתן להבהירן באמצעות בדיקה זו. פס השגיאה הנמוך יחסית מראה שבדיקות כולורומטריות של פעילות אנזימטית במשקעים הן הדירות ולכן מתאימות לניתוח סטטיסטי. כאשר משווים דגימות סביבתיות שונות, למים טבעיים נוטה להיות פעילות אנזימטית חוץ-תאית נמוכה יותר למילליטר מאשר לקרקעות או למשקעים לגרם.

לפיכך, יש לבחון אותם פלורומטרית באמצעות סובסטרטים מקושרים ל-MUB. איור זה מראה כיצד הפעילות של האנזימים, phosphatase, beta-glucco ו-NGAs, משתנה עם העומק. באגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה"ב, האגם ידוע כדל בחומרים מזינים, דבר שבא לידי ביטוי גם בפעילות הגבוהה יחסית של הפוספטאז והאנזימים שמיקרואורגניזמים מייצרים כדי להשיג פוספט מתרכובות אורגניות.

עבור שלושת האנזימים, דגימות בדיקה שנאספו מפני השטח של המים ומעומק של 50 סנטימטרים הראו פעילות דומה. בעוד שהפעילות הייתה מוגברת בדגימה מ-100 סנטימטרים, דגימה זו נלקחה למעשה מממשק המים-משקעים, ונוכחותן של חלקיקי משקעים בדגימה היא ככל הנראה הגורם לפעילות הגבוהה יותר שנצפתה, במיוחד עבור beta glucco ו-n AGAs. בדומה לתשתי פני PNP, פסי השגיאה הנמוכים מראים כי גם עם שלושה קריאות חוזרות בלבד, רמת השחזור של בדיקות פלואורימטריות המשתמשות בתשתי MUB היא גבוהה.

שימו לב כי היחידות עבור פעילות אנזימים בדגימות מים הן ננומול של סובסטרט שנצרך, בעוד שהיחידות עבור פעילות אנזימים על חלקיקי משקע הן מיקרומול של סובסטרט שנצרך, אף על פי שהיחס ליחידת גודל הוא דומה. נתון זה מדגיש את העובדה שקרקעות ומשקעים נוטים להפגין פעילות חוץ-תאית גבוהה בהרבה מזו של מים טבעיים. הדבר ממחיש גם את הרגישות המוגברת של טכניקת הסובסטרט המקושר ל-MUB ואת הצורך להשתמש בטכניקה זו לבדיקת פעילות אנזימים חוץ-תאית בדגימות מים, ברגע שהיא נלמדת במיומנות.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק תשע דגימות מים לנוכחות אנזימים בפרק זמן של מעט יותר משעה. בעת ביצוע הליך זה עבור קרקעות ומשקעים, חשוב להשתמש בחומר בעל מסה ידועה כדי שניתן יהיה להביע את הפעילות על בסיס משקל יבש. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד פעילות אנזימטית חוץ-תאית במגוון סביבות טבעיות, תוך שימוש בטכניקות קולורימטריות או פלואורימטריות.