Name: קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: למדו לבצע ניתוח פעילות אנזימים מיקרוביאליים בדגימות מים, קרקע ומשקעים באמצעות שיטות צבעניות ופלואורומטריות במיקרופלטה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של פעילות אנזימטית בסביבות טבעיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון להיבטים של עבודה זו סופק על ידי מקורות שונים, כולל ארצות הברית מחלקת חקלאות ההסכם שיתופי ספציפי 58-6408-1-595 והקרן הלאומית למדע (הפרס 1,049,911).

ניתוח Colorimetric של תאית אנזים פעילות בקרקעות ומשקעים 1. הכנת התשתית ופתרונות הצפת לניתוח Colorimetric של אנזים פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H להכין 50 מ&quot;מ אצטט חיץ (pH 5.0-5.5) על ידי ערבוב חומצת 50 מיליליטר 0.1 M אצטית (2.87 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ב500 מיליליטר מים), 150 מיליליטר 0.1 נתרן אצטט M, ו200 מיליליטר מזוקק 2 O. התאם ל-pH 5.0-5.5 עם 0.1 M חומצה אצטית במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של הידרוקסיד 1 M נתרן (NaOH) במזוקקי H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות מצע צמוד NP p ב50 מ&quot;מ חיץ אצטט. לassay phosphatase להכין NP-פוספט עמ &#39;5 מ&quot;מ ב50 מ&quot;מ אצטט חיץ; לassay β-glucosidase להכין NP-β-glucopyranoside עמ&#39; 5 מ&quot;מ; לassay Nagase להכין 2 מ&quot;מ PNP-β-N-acetylglucosaminide. הכן את כל הפתרונות במצע 15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. ניתן לאחסן את הפתרונות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות. </li></ol> 2. קביעת תקן להמרה ספיגת לריכוז NP p <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות סטנדרטיים של p-nitrophenol ב50 מ&quot;מ חיץ אצטט. ריכוזים צריכים לנוע .025-1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה שלושה משכפל של כל ריכוז 100 μl לmicroplate 96, גם ברור. הוסף 10 μl 1 M NaOH ו190 μl מזוקק H 2 O היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הספיגה ב 410 ננומטר באמצעות קורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזי כפל בעקומת הסטנדרט ידי 0.3 לקבל NP p μmoles ל300 μl עוצמת תגובה. עלילה עקומה של הספיגה לעומת μmole של NP p. שיפוע העקום משמש כמקדם ההמרה (C) שיתייחס לספיגת μmole של NP עמ &#39;בכל תגובת אנזים. </li></ol> 3. ניצוח Assay האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קרקע, להכין את התרחיף של כל דגימה להיות assayed בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי בconcentration של כ 1 גר &#39;/ מיליליטר -1 באמצעות 50 מ&quot;מ חיץ אצטט. למשקעים, להוסיף מספיק חיץ אצטט לעשות slurry קלות pipettable. נפח תרחיף צורך המדויק ישתנה בהתאם למספר האנזימים assayed, אבל מינימום של 5 מיליליטר מומלץ. ורטקס כל slurry עד שכל הגושים של אדמה או משקעים התפזרו ולב הנפח הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מערבולת כל slurry ו פיפטה מייד 150 μl לכל אחד משש בארות בגוש 96 היטב deepwell (איור 1). חשוב מערבולת ביסודיות ולעתים קרובות על מנת לשמור על חלקיקי קרקע בהשעיה. להשאיר לפחות שתי בארות לכל בלוק ריקים כדי לשמש שליטת מצע. הערה: קליפ סוף הטיפים פיפטה עם מספריים לפני pipetting כslurries אדמה נוטה לסתום טיפים. הכן את בלוק 96 היטב אחד לכל אנזים להיות assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של חיץ אצטט לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של החיץ לליטרAST שתי בארות של כל דגימה (אלה יהיו פקדי חיץ מדגם) ושתי בארות שליטת מצע (איור 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 10 מיליליטר של פתרון NP-מצע p המתאים למאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של פתרון המצע לארבע הבארות הראשונות של כל דגימה ושתי בארות שליטת מצע (איור 1). שים לב לזמן כתגובה מתחילה ברגע שפתרון המצע הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 0.5-4 שעה. זמן דגירה מדויק משתנה בהתאם לרמת פעילות בדגימות והאנזים להיות assayed. עבור רוב הקרקעות ומשקעים, phosphatase וβ-glucosidase דורשים פעמים דגירה של 0.5-1.5 שעה, ואילו Nagase ואנזימים אחרים דורשים פעמים דגירה של&gt; 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מבחני דוגרים להכין 96 היטב ברור microplates לקרוא הספיגה. הכן microplate אחד עבור כל בלוק deepwell (כלומר עבור כל דוארnzyme assayed). פיפטה 10 μl 1 M NaOH ו190 μl של מים מזוקקים לתוך באר כל microplate. הערה: NaOH מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את רמת החומציות אשר משפרת את הצבע של NP p שוחרר במהלך התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות בלוקים 96 היטב ב2,000-5,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חלקיקי קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה רבה לסגת 100 μl מכל באר, להיות זהיר, כדי למנוע את הכדור, ולהעביר אותו למתאים גם בmicroplate 96, גם ברור שהוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קורא microplate ולהגדיר כל תוכנה נחוצה. שיא הספיגה ב 410 ננומטר. אם הספיגה טובה במיוחד היא מעל לגבול גילוי ליניארי של קורא הצלחת, לדלל היטב כי 01:01 עם מים ומחדש מידה. אם הספיגה היא עדיין גבוהה מדי, assay יש לחזור עם זמן דגירה קצר יותר. </li></ol> 4. קביעת יבש ההמונית של דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מיליליטר של כל sampl<html> תרחיף דואר לתוך מחבת אלומיניום preweighed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בתנור ייבוש 75 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולשקול. הפחת את המשקל של את המחבת מהערך הזה כדי להשיג את המסה היבשה של אדמה או משקעים ב 1 מיליליטר של התרחיף. תכפיל בפקטור של 0.15 כדי לקבוע את המסה היבשה של מדגם בμl 150 מתווסף גם כל בassay האנזים. </li></ol> 5. חישוב פעילות אנזים ליבש המוני של קרקע או משקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הספיגה סופית של כל דגימה על ידי הפחתת ספיגת שליטת מדגם מספיגת assay המדגם. אם יש לי פקדי מצע גבוהה הספיגה (בערך&gt; 0.060) אחר כך להפחית אותם גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב פעילות אנזים במסה יבשה μmoles גרם -1 שעה -1 מהמשוואה: </li></ol> פעילות אנזים = הספיגה סופית / (מסת x C מדגם x זמן דגירה יבשה) ניתוח של פלורסנט התאי אנזים פעילות בטבע ווטרס פתרונות TLE &quot;&gt; 1. הכנת המצע, רגיל, והצפה לניתוח fluorometric של אנזים פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מיקרומטר פתרונות של מצעי MUB צמודים (למשל 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB פוספט, 4-MUB-N-אצטיל-β-D-glucosaminide) על ידי המסת המצע המתאים בסטרילי (autoclaved) מזוקק H 2 O ב15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. לעטוף את הצינורות בנייר אלומיניום, כדי להוציא לאור ולאחסן במקרר לפני השימוש. מצעים צריכים להיות יציבים במשך שבוע לפחות 1 אם מאוחסנים בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סטנדרטי MUB על ידי ביצוע פתרון מניות של 100 מיקרומטר 4-methylumbelliferone בסטרילי H מזוקק 2 O. חנות בקירור בענבר או בקבוק עטוף בנייר אלומיניום. מייד לפני השימוש, לדלל את פתרון 100 המניה מיקרומטר ידי 1/10 לסטרילי H 2 O כדי להפוך את פתרון עבודה של 10 מיקרומטר עבור מבחני אנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של 100 חיץ ביקרבונט מ&quot;מ על ידי המסת 8.4 גרם של NaHCO &lt;תת&gt; 3 לתוך 1 LH 2 O ומעוקר. לדלל פתרון מניות זה 1/20 לסטרילי H 2 O לפי צורך כדי להפוך את פתרון עבודה של 5 מ&quot;מ עבור מבחני אנזים. </li></ol> 2. דגימות מים ארגון על 96, גם השחורה Microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן microplate לכל אנזים בעקבות הדוגמא שמוצגת באיור 2. שים לב שמאפשר שכפול נאות, סטנדרטים, ופקדים, הליך זה יכול assay את פעילותו של אנזים בודד לתקופה של עד תשע דגימות מים על microplate השחור 96 היטב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של המדגם הראשון לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים לpipette200 μl לכל הבארות בטור 1 של microplate (ים). מחק טיפים פיפטה משומשים וחזור לפי צורך עבור כל דגימת מים כדי למלא עמודי 1-9. </li></ol> 3. הגדרה לדוגמא, תקן, להרוות, ובקרת תשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת בקרות לחשבון עבור דגימות, סטנדרטיותים, מצע ומרווה באותו microplate השחור כמו הדגימות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקדים לדוגמא מכילים מים מדגם חיץ ביקרבונט, ואינם משמשים בחישובי הפעילות אבל ידגימו קריאת עקביות לאורך כל תקופת הניסוי. הפקדים להרוות מורכבים ממי מדגם וכמות סטנדרטית של תג הניאון ומשמשים למדידה העקיפה של הקרינה במים לדוגמא. מצע ופקדים סטנדרטיים מורכבים מחיץ או צמוד מצע או תג הניאון הסטנדרטי, בהתאמה, וסודה לשתייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של 5 מ&quot;מ חיץ ביקרבונט למאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl של חיץ לתוך בארות microplate 1 עד 9 בשורות D ו-E ליצירת שני לשכפל בארות מדגם פקדים לדגימה. הטיפים פיפטה השינוי לאחר מכן להעביר 200 μl של חיץ ביקרבונט לבארות 10 דרך 12 בשורות וה &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית תאורה מפוזרת על ידי עמעום או כיבוי lights כתקן הניאון הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של 10 מיקרומטר 4 methylumbelliferone-לתוך מאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה H, ולתוך בארות 1 עד 9 לתוך שורות G ו F כדי ליצור שלושה משכפל של בקרות להרוות לדגימה ופקדים סטנדרטיים הכלליים. כך או למקם microplate בחושך או לכסות עם מכסה אטום כדי להפחית השפלה אור MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את fluorometer והגדרה כל תוכנה נחוצה כדי להיות מוכן לקריאה לפני הוספת המצע. שים לב: כמה נורות fluorometer עשויות לדרוש זמן חימום של 3 דקות או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של המצע המתאים MUB הצמוד (למשל 4-MUB פוספט) לתוך מאגר פיפטה נקי. השתמש pipettor 12 ערוצי פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה, ולתוך בארות 1 עד 9 בשורות B ו-C כדי ליצור שלושה מבחני לשכפל עבור כל דגימה ושלושה פקדי מצע. Immediately המשך לשלב 4.1, הקרינה הקלטה. </li></ol> 4. הקרינה הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הקרינה הראשונית מייד לאחר בנוסף מצע לmicroplate. אחרי שקראתי את הקרינה, דגירה microplate ב RT (22 מעלות צלזיוס) או בחושך או מכוסה במכסה אטומה כדי להפחית השפלה אור MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה הנדרש כדי למדוד את פעילות האנזים הפוטנציאלית המרבית בדגימת מים יהיה תלוי בריכוז האנזים בתוך המדגם. מכיוון שזו אינה ידועה לפני assay הושלם, microplate יצטרך לקרוא בצעדי זמן מרובים. בדרך כלל, קריאה במרווחים של 10-15 דקות במשך 1 שעות מקובלת לאנזימים רבים, אם כי דגימות עם פעילות גבוהה מאוד על אנזימים מסוימים עשויות להגיע לשיא לפני 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קריאת הקרינה בmicroplate במרווחי הזמן המיועד שלך במשך שעה לפחות 1. הקפד לשמור מכוסה microplate או בחושך בין הקריאהs. </li></ol> 5. חישוב פעילות האנזים לנפח מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה בכל מרווח זמן לחשב את: אומר הקרינה מדגם ראשונית (בארות D ו-E), הקרינה הממוצעת הסופית המדגם (בארות AC), הקרינה הממוצעת סטנדרטית (בארות H10-11), ומתכוונים להרוות את הקרינה שליטה (הבארות FG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מרווח זמן, לחשב פעילות אנזים בשעת nmoles -1 מיליליטר -1 מהמשוואה: </li></ol> פעילות אנזים = (כלומר הקרינה מדגם - כלומר הקרינה מדגם ראשונית) / ((x אומר הקרינה / 0.5 mol הסטנדרטי) (מתכוון להרוות את הקרינה שליטה / אומר x הקרינה הסטנדרטי) (0.2 מיליליטר) x (פעם בשעה)) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ערכי הפעילות מחושבים לכל שלב זמן. קבע פעילות פוטנציאל סופית מהצעד הזמן עם הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי פעילות ימשיכו לעלות ולאחר מכן צעדי מועד מאוחר יותר ייתכן שיידרשו, אם ערכי פעילות ליפול througהאוט במהלך הריצה, ולאחר מכן להפעיל שוב עם צעדי זמן קצרים יותר. הפעילות האחרונה היא בnmoles של מצע נצרך שעה -1 מיליליטר -1 אך ניתן לשנותם עד כדי להביע כμmoles שעה -1 L -1. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

קביעת הפעילות של מגוון רחב של אנזימים תאיים של חיידקים בקרקעות ומשקעים יכולות לספק תובנות שימושיות לשיעורים של מינרליזציה התזונתית ועיבוד חומר אורגני 17. עם זאת, קרקעות יכולות להשתנות ברמות הלחות שלהם, ולכן חשוב לבצע סטנדרטיזציה של פעילות למשקל יבש אדמה. זה דורש צעד נוסף ייבוש (בדרך כלל של שני ימים) מעבר פשוט מדידת פעילות אנזים. לפיכך, בניגוד למבחנים של פעילות אנזים בדגימות מים המספקות ליד תוצאות מיידיים, מבחני אמינים של פעילות אנזים באדמה ומשקעים לקחת כמה ימים. עבור חל...

מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופטריות להשיג חומרים מזינים ופחמן מתרכובות אורגניות מורכבות באמצעות הייצור של אנזימים תאיים. אנזימים אלה בדרך כלל hydrolyze פולימרים ליחידות משנה קטנה יותר שאפשר לקחת אל תוך התא. לכן, ברמה אקולוגית, אנזימים תאיים של חיידקים אלו אחראים לחלק גדול ממינרליזציה התזונתית ופירוק חומר אורגני המתרחש בסביבות טבעיות. אנזימים כגון cellobiohydrolase (CBH) וβ-glucosidase חשובים לפירוק תאית ועבודה ביחד כדי לזרז הידרוליזה של תאית לגלוקוז 1,2, המספקת מצע פחמן לניצול לספיגה והטמעה של חיידקים. Phosphatase האנזים משחרר מסיסי קבוצות אורגניות פוספט מזרחנים אורגניים, במהות mineralizing פוספט והופך אותו זמין לשימוש על ידי רוב האורגניזמים 3. אנזימים אחרים, כגון N-acetylglucosaminidase (Nagase), הם importanלא בשפלת כיטין והוא יכול לעשות את שני פחמן וחנקן זמין לרכישת חיידקים 4. אחד מההליכים עבור assay של פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות טבעיות הוא השימוש בp-nitrophenyl המלאכותי מצעים (NP עמ &#39;) מקושרים, גישה שפותחה במקור כדי לזהות פעילות phosphatase אדמת 5. גישה זו מסתמכת על זיהוי של מוצר בצבע תום, p-nitrophenol, המשתחרר כאשר המצע מלאכותי הידרוליזה על ידי האנזים המתאים. P-nitrophenol ניתן לכמת בהמשך colorimetrically ידי מדידת הספיגה שלה בסביבות 400-410 ננומטר. שיטה זו מאז הוחל לזהות אנזימים אחרים כגון Nagase 6, וכבר נעשה שימוש במחקרים שונים מסתכלת על פעילות אנזים תאית של חיידקים בקרקעות ומשקעים 7-9. גישה חלופית שהייתה originally פותח כדי להעריך את פעילות glucosidase תאית בסביבות מימית 10,11 עושה שימוש 4 methylumbelliferone-(MUB) מצעים מקושרים. המוצר הסופי שפורסם (4-methylumbelliferone) הוא ניאון מאוד וניתן לאתר באמצעות fluorometer עם הגדרת עירור / פליטה סביב 360/460 ננומטר. מגוון מצעים מלאכותיים MUB צמודים זמין, המאפשר מדידת fluorometric של הפעילות של אנזימים לפחות כמו רבים (למשל β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase) כפי שניתן assayed באמצעות הליך colorimetric NP-מצע p. אנזימים אחרים חיידקים תאיים, כגון aminopeptidase לאוצין החלבון משפיל, יכולים להיות assayed fluorometrically באמצעות 7-אמינו-4-methylcoumarin (COU) מצעים מקושרים. שני MUB ומצעי COU צמודים היו בשימוש כדי לקבוע פעילות אנזים בדגימות יבשתית ומימיות שונות 12,13. בעוד שהמחקרים קודמים descrmicroplate fluorometric או colorimetric ibed גישות כדי לקבוע פעילות אנזים תאית 14, יש צורך בהצגה ברורה של איך לנהל מבחני כאלה. כאן אנו מדגימים נהלים לביצוע טכניקות microplate תפוקה גבוהות לניתוח פעילות אנזים תאי בקרקעות ומשקעים בגישת מצעים צמודים NP p colorimetric ובמים הטבעיים באמצעות טכניקת מצעי MUB צמודת הניאון. אנו מתמקדים במדידה של הפעילות של β-glucosidase, Nagase, וphosphatase כיכולים להיות קשורים אנזימים אלה לפחמן, חנקן, זרחן ורכיבה על אופניים, בהתאמה. עם זאת, ניתן ליישם הנהלים שתוארו כאן כדי המדידה של אנזימים תאיים אחרים באמצעות מצעים מלאכותיים שונים.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנטים וחומרים</חזקים></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td> אצטית קרחונית <td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td></td><td></td><td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td></td><td></td><td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>p-ניטרופנול</td><td>פישר</td><td>BP612-1</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>p-ניטרופניל (pNP)-פוספט</td><td>סיגמא</td><td>N3234</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetyl glucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p מצע NP</td></tr> שקוף <tr><td>96 בארות מיקרו-פלטות</td><td>פישר</td><td>12-563-301</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>96 בארות עמוקות בארות</td><td>בלוקים Costar</td><td>3958</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>מחבתות</td><td></td><td></td> אלומיניום <td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td> צנטריפוגה סטריליים 15 מ"ל <td>ספקים שונים</td></tr><tr>צינורות <td></td><td></td><td>צנטריפוגה סטריליים 50 מ"ל</td><td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-פוספט</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetyl glucosaminide</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td></td><td></td><td>ספקים שונים</td></tr><tr><td>שחור 96-באר מיקרופלייט</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> פיפטה <td>ספקים</td></tr><tr> שונים<td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה רוטור</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>עבור מיקרופלטות/בלוקים</td></tr> <tr><td>עמוקיםקורא Microplate</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternates זמין</td></tr><tr><td>פלואורומטר Microplate</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>חלופות זמין</td></tr><tr><td>פיפטור</td><td></td><td></td> 8 ערוצים <td>ספקים שונים</td></tr></tbody></table>

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני microplate תפוקה גבוהה

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

חלק גדול מהרכיבה על האופניים מזינים ועיבוד פחמן בסביבה טבעית מתרחש באמצעות הפעילות של אנזימים תאיים שפורסמו על ידי מיקרואורגניזמים. לכן, מדידה של הפעילות של אנזימים תאיים אלה יכול לתת תובנות השיעורים של תהליכים ברמת מערכת אקולוגית, כגון פירוק חומר אורגני או חנקן וזרחן מינרליזציה. מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות סביבתיות בדרך כלל כרוכים חושפים את הדגימות למצעי colorimetric או fluorometric מלאכותיים ומעקב אחר השיעור של הידרוליזה מצע. כאן אנו מתארים שיטות microplate המבוסס על נהלים אלה המאפשרים הניתוח של מספר הגדול של דגימות תוך פרק זמן קצר. דוגמאות מותרת להגיב במצעים מלאכותיים תוך 96 גם microplates או גם עמוקים בלוקים microplate, ופעילות אנזים נקבעה לאחר מכן על ידי קליטה הקרינה או של המוצר הסופי וכתוצאה מכך באמצעות ריד microplate טיפוסיr או fluorometer. נהלי תפוקה גבוהה כגון להקל לא רק השוואות בין אתרים או מערכות אקולוגיות במרחב נפרדים, אלא גם להפחית באופן משמעותי את העלות של מבחני אלה על ידי צמצום כמויות מגיב הכוללות הנדרשות לדגימה.

קרקעות ומשקעים ימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזים תאית כתוצאה מקהילות המצורפות חיידקים (biofilms) גובר על פני השטח של חלקיקים. איור 3 מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל של חלקיקים המתקבלים מהמשקעים של כשליש המשטח זרם כדי שבצפון מיסיסיפי, ארה&quot;ב. מחקר קודם הראה כי קהילות חיידקים על חלקיקי משקעים מהזרם הזה ניתן להפריד לשלוש קבוצות מובחנות המבוססות על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהם: אלה ב0.063 חלקיקי מ&quot;מ, אלה על 0.125, 0.25, ו0.5 מ&quot;מ ח...

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא לבצע בדיקה מהירה של פעילות אנזימים מיקרוביאליים חוץ-תאיים במגוון סביבות טבעיות. דבר זה מושג על ידי הוספת דגימות של מים או תגליאיי קרקע למיקרו-פלטה כדי להשיג חזרות מספיקות. כשלב שני, מתווסף לבארות המיקרו-פלטה סובסטרט כולורמטרי או פלואורומטרי סינתטי, המאפשר את התרחשות התגובות האנזימטיות. לאחר מכן, נמדדים הבליעה (absorbance) או הפלואורסצנציה כדי לקבוע את כמות תוצר הסיום ששוחרר במהלך התגובה.התוצאות מראות הבדלים בפעילות אנזימים חוץ-תאיים בין דגימות, בהתבסס על הבליעה או הפלואורסצנציה של התגובה הסופית. היום נדגים כיצד למדוד פעילות אנזימים חוץ-תאיים בסביבות טבעיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באקולוגיה מיקרוביאלית, כגון קצבי עיבוד חומר אורגני ומנרליזציה של חומרים מזינים בקרקעות, במשקעים ובמים. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בשימוש בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים בשל הקושי להפריד חלקיקים מתמיסת התגובה, במיוחד בעת בדיקת מספר רב של דגימות.הדגמה חזותית של הליך זה היא קריטית, כיוון שסידור הפלטה עשוי להיות קשה ללמידה, ובמידה ונלקחות מדידות במספר נקודות זמן, ההליך הופך למאתגר יותר. אנליזה כולורית של פעילות אנזימטית חוץ-תאית עבור קרקעות ומשקעים מתחילה בהכנת באפר של תסביס ותמיסות סטנדרט כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט עבור קרקע; הכינו תמיסת בוץ (slurry) של כל דגימה המיועדת לבדיקה בתוך מבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 milliliter. הוסיפו ריכוז של כ-one gram per milliliter תוך שימוש ב-50 millimolar acetate buffer עבור משקעים.הוסף מספיק בופר אצטט כדי להפוך את התעלה לנזילה בקלות. הנפח המדויק של התעלה הדרוש ישתנה בהתאם למספר האנזימים הנבדקים, אך מומלץ נפח מינימלי של five milliliters. ערבב כל תעלה ב-Vortex עד שכל גושי האדמה או המשקעים יתפזרו.שימו לב לנפח הסופי. גזרו את קצות קצות השפיפטים בעזרת מספריים לפני השאיבה. מכיוון שתמיסורי קרקע נוטים לסתום את השפיפטים, ערבבו שוב כל תמיסור במערבל (vortex) ושאבו מיד 150 microliters לכל אחד מששת הבארות.בבלוק באריים עמוקים של 96 בארות. חשוב לבצע ערבול (vortex) יסודי ותכוף. כדי לשמור על חלקיקי קרקע במצב של תליה, השאירו לפחות שתי בארות ריקות בכל בלוק כדי שישמשו כביקורת תשתית.הכינו בלוק של 96 בארות עבור כל אנזים שייבדק. שפכו כחמישה מיליליטרים של באפר אצטט למאגר פיפט (pipette reservoir) והשתמשו בפיפט רב-ערוצי (שמונה ערוצים) כדי להוסיף 150 microliters של הבאפר לשתי הבארות האחרונות של כל דגימה.עבור בקרות תחליל הדגימה ושני בארי הבקרת הסובסטרט. מזגו כ-10 מיליליטר של תמיסת p-nitro phenyl phosphate או תמיסת סובסטרט PNP המתאימה למאגר פיפטה, והשתמשו בפיפטה בעלת שמונה ערוצים כדי להוסיף 150 µL של תמיסת הסובסטרט לארבעת הבארים הראשונים של כל דגימה ולשני בארי בקרת הסובסטרט. רשמו את הזמן עם תחילת התגובה, מיד עם הוספת תמיסת הסובסטרט.דגרו את הפלטות בטמפרטורת החדר למשך 0.5 עד ארבע שעות. זמן הדגירה המדויק ישתנה בהתאם לרמת הפעילות בדגימות ולאנזים הנבדק. בזמן דגירת הבדיקות, הכינו פלטה שקופה אחת בעלת 96 בארות (microplate).עבור כל בלוק בארות עמוקות, לצורך קריאת הספיגות, העבירו באמצעות פיפט 190 µL של מים מזוקקים ו-10 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M לכל בארה במיקרופלטה. נתרן הידרוקסיד מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את ה-pH, מה שמעצים את צבע ה-PNP המשוחרר במהלך התגובה לאחר הדגירה. סבבו את בלוקי 96 הבארות בצנטריפוגה ב-2000 עד 5,000 ×g למשך חמש דקות כדי לשקע את חלקיקי הקרקע.הסרת הנוזל מבלי להפר את המשקע עלולה להיות מאתגרת. יש להימנע משימוש בכמות גדולה מדי של דגימת קרקע בשלב הראשוני. ודאו שביצעתם סרכוז למשך זמן מספיק, והשתמשו בתנועה זהירה אך בטוחה כדי לשאוב את הנוזל.השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לשאוב 100 µL מכל באר, תוך הקפדה להימנע מהמשקע. העבירו את הנוזל לבאר המתאימה בפלטת מיקרו שקופה של 96 בארות שהוכנה מראש. הפעילו את קורא הפלטחות (Microplate reader) והגדירו את התוכנה הדרושה. רשמו את הבליעה באורך גל של 410 nm. לאחר קביעת המסה היבשה של הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, חשבו את הבליעה הסופית של כל דגימה על ידי חיסור הבליעה של בקרת הדגימה מהבליעה של בדיקת הדגימה.אם לבקרי התסבסאט יש בליעה גבוהה של יותר מ-0.060, יש להפחית ערכים אלו. לאחר מכן, המשיכו בחישוב הפעילות האנזימטית במיקרומול לשעה לגרם של מסה יבשה באמצעות משוואה זו. לאחר ארגון של מיקרופלט שחור עבור כל אנזים בהתאם לדוגמה המוצגת בפרוטוקול הטקסט, שפכו כחמישה מיליליטר של דגימת המים הראשונה למאגר של פפטה והשתמשו בפפטה בעלת שמונה ערוצים כדי להעביר 200 microliters לכל אחת מהבארות.בעמודה הראשונה של המיקרופלטה, השליכו את קצות הפפטה המשומשים וחזרו על הפעולה לפי הצורך עבור כל דגימת מים, כדי למלא את עמודות אחת עד תשע. הגדירו בקרות לתיקון הדגימות, הסטנדרטים, הסובסטרט והכיבוי (quenching) באותה מיקרופלטה שחורה שבה נמצאות הדגימות. בקרות הדגימות מכילות מי דגימה ותמיפת בופר ביקרבונט ואינן משמשות לחישוב הפעילות, אך הן ישמשו להדגמת עקביות הקריאות לאורך הניסוי.בקרות הכיבוי (quench controls) מורכבות ממי דגימה ומכמות סטנדרטית של התג הפלואורסצנטי, ומשמשות למדידת הדיפרקציה של הפלואורסצנציה. בקרות התסבכת (substrate) וסטנדרט במי דגימה מורכבות או מתסבכת מקושרת או מהתג הפלואורסצנטי הסטנדרטי, בהתאמה, ומבופר ביקרבונט. שפכו כ-5 מיליליטר של בופר ביקרבונט בריכוז 5 מילימולרי למאגר פיפטה נקי.טפטף 50 µL של בופר לבארות 1 עד 9 בשורות d ו-e במיקרופלטה כדי ליצור שתי בארות משכפלות של בקרות דגימה לכל דגימה; החלף את טיפי הפ pipette, ולאחר מכן העבר 200 µL של בופר ביקרבונט לבארות 10 עד 12 בשורות A ו-H. למרות שבהדגמה זו התאורה נשארת חזקה לצורכי צילום, יש להפחית את התאורה הסביבתית על ידי עמעום או כיבוי האורות, מכיוון שהסטנדרט הפלואורסצנטי רגיש לאור. שפוך כ-5 mL של 10 µM של 4-methylumbelliferone או MUB למכל פ pipette נקי, וטפטף 50 µL לבארות 1 עד 12 בשורה H. לאחר מכן, טפטף 50 µL לבארות 1 עד 9 בשורות G ו-F כדי ליצור שלוש משכפלות של בקרות כיבוי (quench controls) לכל דגימה ובקרות סטנדרט כלליות. הנח את המיקרופלטה בחושך או כסה אותה במכסה אטום כדי להפחית את הפירוק של MUB כתוצאה מחשיפה לאור, הדלק את הפלואורימטר והגדר את התוכנה הדרושה כדי שתהיה מוכנה לקריאה לפני הוספת הסובסטרט.העבירו כ-5 milliliters של תת-מצע מתאים מצופה MUB למאגר פיפטה נקי, והשתמשו בפיפטה של 12 ערוצים כדי להעביר 50 microliters לבארות 1 עד 12 בשורה A ולבארות 1 עד 9 בשורות B ו-C, ליצירת שלושה מבחנים חוזרים עבור כל דגימה ושלוש בקרות תת-מצע; לאחר מכן, רשמו את הפלואורסצנציה באופן מיידי. קראו את הפלואורסצנציה הראשונית מיד לאחר הוספת תת-המצע למיקרופלטה. לאחר הקריאה, הדגירו את המיקרופלטה בטמפרטורת החדר, בחושך או תחת מכסה אטום.על מנת להפחית את הפירוק של MUB עקב חשיפה לאור. זמן האינקובציה הנדרש למדידת הפעילות האנזימטית הפוטנציאלית המקסימלית תלוי בריכוז האנזים בדגימה. מכיוון שנתון זה אינו ידוע, לפני בדיקת הדגימה, יהיה צורך לקרוא את המיקרופלטה במספר נקודות זמן.עבור רוב האנזימים, מרווחי זמן של 10 עד 15 דקות לאורך שעה הם הולמים, אם כי דגימות מסוימות בעלות ריכוזים גבוהים יגיעו לשיא לפני 10 דקות. המשיכו לקרוא את הפלואורסצנציה במיקרו-פלטה במרווחי הזמן שנקבעו למשך שעה אחת לפחות. הקפידו להשאיר את המיקרו-פלטה מכוסה או בחשכה בין הקריאות.עבור כל דגימה בכל רווח זמן, חשבו את ממוצע הפלואורסצנציה הראשונית של הדגימה, ממוצע הפלואורסצנציה הסופית של הדגימה, ממוצע הפלואורסצנציה הסטנדרטית וממוצע פלואורסצנציית בקרת המעכבה (quench control) עבור כל רווח זמן. חשבו את פעילות האנזים ביחידות של m לשעה למיליליטר, באמצעות המשוואה המופיעה בפרוטוקול הכתוב.בחן את ערכי הפעילות שחושבו עבור כל שלב זמן, וקבע את הפעילות הפוטנציאלית הסופית מתוך שלב הזמן בעל הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי הפעילות ממשיכים לעלות, ייתכן שיהיה צורך בשלבי זמן מאוחרים יותר. אם ערכי הפעילות יורדים לאורך מהלך הריצה, הרץ את התהליך שוב עם שלבי זמן קצרים יותר.בקרקעות ובמשקעים מימיים קיימות בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזימטית חוץ-תאית כתוצאה מקהילות מיקרוביאליות הצמודות לגשמי החלקיקים. איור זה מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל החלקיקים שהושגו ממשקע הפני השטח של נחל מסדר שלישי בצפון מיסיסיפי, ארה"ב. מחקר קודם הראה כי ניתן לחלק את הקהילות הבקטריאליות על חלקיקי המשקעים מנחל זה לשלוש קבוצות נפרדות, בהתבסס על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהן.אלו על חלקיקים של 0.063 millimeter, אלו על חלקיקים של 0.1 2 5, 0 0.25 ו-0.5 millimeter ואלו על חלקיקים של one millimeter. ניתוח של דפוסי הפעילות של אנזימים חוץ-תאיים תומך במסקנה זו, כאשר פעילות הפוספטאז דומה בחלקיקים של 0.1 2 5, 0 0.25 ו-0.5 millimeter, אך גבוהה בהרבה בפרקציות של one ו-0.063 millimeter כאשר היא נמדדת באמצעות טכניקת ה-PNP linked substrate. אנזימים אחרים, כגון beta glucco ו-n AGAs, מראים שיאים דומים בחלקיקים העדינים ביותר, אך אינם מוגברים בחלקיקים של one millimeter.הדגיש את העובדה שאנזימים שונים עשויים להראות התפלגויות סביבתיות שונות, וניתן להבהירן באמצעות בדיקה זו. פס השגיאה הנמוך יחסית מראה שבדיקות כולורומטריות של פעילות אנזימטית במשקעים הן הדירות ולכן מתאימות לניתוח סטטיסטי. כאשר משווים דגימות סביבתיות שונות, למים טבעיים נוטה להיות פעילות אנזימטית חוץ-תאית נמוכה יותר למילליטר מאשר לקרקעות או למשקעים לגרם.לפיכך, יש לבחון אותם פלורומטרית באמצעות סובסטרטים מקושרים ל-MUB. איור זה מראה כיצד הפעילות של האנזימים, phosphatase, beta-glucco ו-NGAs, משתנה עם העומק. באגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה"ב, האגם ידוע כדל בחומרים מזינים, דבר שבא לידי ביטוי גם בפעילות הגבוהה יחסית של הפוספטאז והאנזימים שמיקרואורגניזמים מייצרים כדי להשיג פוספט מתרכובות אורגניות.עבור שלושת האנזימים, דגימות בדיקה שנאספו מפני השטח של המים ומעומק של 50 סנטימטרים הראו פעילות דומה. בעוד שהפעילות הייתה מוגברת בדגימה מ-100 סנטימטרים, דגימה זו נלקחה למעשה מממשק המים-משקעים, ונוכחותן של חלקיקי משקעים בדגימה היא ככל הנראה הגורם לפעילות הגבוהה יותר שנצפתה, במיוחד עבור beta glucco ו-n AGAs. בדומה לתשתי פני PNP, פסי השגיאה הנמוכים מראים כי גם עם שלושה קריאות חוזרות בלבד, רמת השחזור של בדיקות פלואורימטריות המשתמשות בתשתי MUB היא גבוהה.שימו לב כי היחידות עבור פעילות אנזימים בדגימות מים הן ננומול של סובסטרט שנצרך, בעוד שהיחידות עבור פעילות אנזימים על חלקיקי משקע הן מיקרומול של סובסטרט שנצרך, אף על פי שהיחס ליחידת גודל הוא דומה. נתון זה מדגיש את העובדה שקרקעות ומשקעים נוטים להפגין פעילות חוץ-תאית גבוהה בהרבה מזו של מים טבעיים. הדבר ממחיש גם את הרגישות המוגברת של טכניקת הסובסטרט המקושר ל-MUB ואת הצורך להשתמש בטכניקה זו לבדיקת פעילות אנזימים חוץ-תאית בדגימות מים, ברגע שהיא נלמדת במיומנות.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק תשע דגימות מים לנוכחות אנזימים בפרק זמן של מעט יותר משעה. בעת ביצוע הליך זה עבור קרקעות ומשקעים, חשוב להשתמש בחומר בעל מסה ידועה כדי שניתן יהיה להביע את הפעילות על בסיס משקל יבש. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד פעילות אנזימטית חוץ-תאית במגוון סביבות טבעיות, תוך שימוש בטכניקות קולורימטריות או פלואורימטריות.

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמחסלות ביעילות ביופילמים באמצעות לוחית יתד. המתודולוגיה מנטרת את המצב המטבולי של הביופילם לאחר הטיפול בתרכובות מיקרוביאליות, מה שמקל על קביעת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי.

בדיקת ביופילם של צלחת יתד להקרנת חומרים אנטיבקטריאליים

כדי למדוד את שיעורי פוטנציאל של פעילות אנזים תאית קרקע, מצעים סינטטיים המאוגדים צבע פלואורסצנטי מתווספים דגימות קרקע. פעילות אנזים נמדדה כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע על ידי תגובה-זרז אנזים, שבו הקרינה גבוהה יותר מצביעה יותר השפלה מצע.

תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

למדו לבצע ניתוח פעילות אנזימים מיקרוביאליים בדגימות מים, קרקע ומשקעים באמצעות שיטות צבעניות ופלואורומטריות במיקרופלטה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של פעילות אנזימטית בסביבות טבעיות שונות.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים