גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מחקרים אקטומיים כדי להשוות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסאות שונות של פתוגנים כנגד קבוצה משותפת של גורמים תאיים. זה מושג על ידי שמרים מבוססי הזדווגות, שתי הקרנות היברידיות של CDNA לזיהוי שותפים אינטראקטיביים פוטנציאליים של חלבונים מגרסאות פתוגן שונות. כשלב שני, מסגרות הקריאה הפתוחות של השותפים האינטראקטיביים מרוצפות ומועברות לווקטורים התואמים לאימות נוסף.

לאחר מכן, קבוצה של שותפים בודדים היוצאים מכל שתי הבדיקות ההיברידיות נבחרת ונבדקת מחדש לאינטראקציה שלהם עם מגוון הזנים המלא שנחקר. זה נעשה באמצעות בדיקת השלמת שברי חלבון מבוססת לוציפראז אורתוגונלית, המבוצעת בתאי יונקים על מנת לספק מערכי נתונים השוואתיים חזקים. התוצאות מראות עוצמות אינטראקציה שונות בין חלבוני הפתוגן לחלבוני התא בהתבסס על מדדי הלוציפראז שהושגו, ובכך מספקות סקירה השוואתית של אינטראקציות חלבון מארח פתוגן.

עיבוד פרופילי האינטראקציה על ידי אשכולות היררכיים מתאם אינטראקציות ספציפיות של פתוגן מארח עם תכונות פתולוגיות ונותן תובנות לגבי מעורבותם של חלבוני פתוגן בפתוגנזה. היתרון העיקרי של גישה זו על פני שיטות אחרות למיפוי אינטראקציות חלבון מארח פתוגן הוא שהיא מספקת מערך נתונים השוואתי מחמיר בין גרסאות זנים מרובות. טכניקות אלה מספקות תובנה לגבי רשת האינטראקציה של חלבון פתוגן, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כמולקולה זיהומית באמצעות גנטיקה שלמה של וירוסים ונהרות, למשל, התחל פרוטוקול זה עם הזדווגות והפצה של תאי השמרים כמתואר בזרע הפרוטוקול הכתוב.

30 מיליליטר של מדיום נשירה סלקטיבי חסר טריפטופן עם מעט מושבות של זן שמרים AH 1 0 9 שהפך עם הפלסמיד P-G-B-K-T שבעה המבטא את חלבון הפתוגן. דגירה 30 שעות ב-30 מעלות צלזיוס עם סיבוב. הזרע הבא, 200 מיליליטר של מדיום נשירה סלקטיבי מינוס טריפטופן עם 30 מיליליטר של AH 1 0 9.

תרבויות דוגרות בסיבוב במשך 20 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. כמו כן, ספריית CDNA של הדגירה הפכה את Y 187 ב -20 מיליליטר של דבק YP למשך 10 דקות ב -30 מעלות צלזיוס עם סיבוב. לאחר מכן צנטריפוגה נפח של PG BK T שבע תרבית AH 109 המתאימה לכמות שווה ערך של תאי שמרים Y 187 ברי קיימא למשך חמש דקות ב-3, 500 סל"ד ו-20 מעלות צלזיוס.

משוך בזהירות את הסופרנטנט ו- Resus תלה את החיך ב -10 מיליליטר דבק YP. מערבבים את השמרים התלויים AH 109 עם הספרייה המכילה Y 187. מעבירים לצינור של 50 מיליליטר לפני צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -3, 500 סל"ד ו -20 מעלות צלזיוס.

לאחר משיכה בזהירות של ה-Super dat Resus, השעו את הגלולה בדבק YP כדי לקבל בסך הכל 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, מורחים את השמרים על שלוש אגר YCM, צלחות 150 מילימטר ב -0.5 מיליליטר לצלחת ודוגרים 4.5 שעות ב -30 מעלות צלזיוס. אוספים את השמרים המזדווגים מצלחות YCM על ידי גירוד בכוס מגרפה ב -10 מיליליטר של מדיום נשירה סלקטיבי מינוס לאוצין, טריפטופן והיסטידין.

שוטפים את הצלחת פעמיים עם חמישה מיליליטר מאותו מדיום ובריכה לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב -3, 500 סל"ד ו -20 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט וראוס. השעו את כדור השמרים בחמישה מיליליטר של מדיום נשירה סלקטיבי מינוס לאוצין, טריפטופן והיסטידין.

לאחר מכן מורחים את השמרים המזדווגים על 10 צלחות של אגר נשירה סלקטיבית מינוס לאוצין, טריפטופן והיסטמין בתוספת ריכוז מתאים של שלושה אמינו טריאזול או שלושה כפי שנקבע במבחן ההפעלה האוטומטית. חשב את הקצב הדיפלואידי כמתואר בפרוטוקול הכתוב לאחר דגירה ב-30 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה במשך שישה עד 10 ימים. בוחרים מושבות שמרים ומעבירים לצלחות שהוכנו טריות מאגר נשירה סלקטיבית, מינוס לאוצין, טריפטופן והיסטידין, בתוספת שלושה בטון.

הזמינו את השמרים בתכנית של שמונה נתיבים של 12 בארות המשחזרות צלחת של 96 בארות כך שבהמשך יהיה קל יותר לרצף. תנו למושבות השמרים לגדול במשך ארבעה עד חמישה ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באווירה לחה. מטרת סעיף זה היא PCR, להגביר את ה- CDNA הכלול ב- PA ct שני וקטורים של מושבות שמרים ליזה הגדלות על אגר נשירה סלקטיבית מינוס צלחות לאוצין, טריטופן והיסטידין.

התחל בהנחת צלחת PCR של 96 בארות על קרח כדי לליסינג תאי שמרים ב-50 מיקרוליטר לבאר של תמיסת xmal 20 T. יש להשעות בעדינות מושבה אחת לכל באר. דגרו את הצלחת 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-15 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס.

לאחר החזרת הצלחת לקרח, הוסיפו 50 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל תערובת באר על ידי צנרת למעלה ולמטה, והמשיכו לצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3, 500 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנת תערובת ה-X כמתואר בפרוטוקול הטקסט, חלקו 40 מיקרוליטר מהתערובת לבאר בצלחת ה-PCR של 96 בארות. הוסף 10 מיקרוליטר מהשמרים הליזים לבאר ובצע הגברה כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הפעל שלושה מיקרוליטרים של מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוס של 1.2% כדי לזהות שיבוטים חיוביים ל-PCR. רצף את השברים המוגברים של ה-PCR שבודדו משלושת השיבוטים החיוביים שלו. לאחר מכן בצע ניתוח פיצוץ כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות סלולריות, תוך השלכת יישורי ביטחון נמוכים כמו גם שינוי מסגרת וקוד עצירה מוקדם על רצפים המכילים לפני העברת התא.

העבר את מסגרות הקריאה הפתוחות של חלבון הפתוגן והחלבון הסלולרי לווקטורים שלהם כדי ליצור חלבונים שהתמזגו לשברים של Gaia luciferase כמפורט בפרוטוקול הטקסט זרע 2 9 3 תאי T ב -350,000 תאים למיליליטר של DMEM עם סרום בקר עוברי של 10% ללא אנטיביוטיקה. מחלקים 100 מיקרוליטר לבאר בצלחות תרבית לבנות סטריליות לפני הגידול למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למחרת. תאי טרנספקט המשתמשים בכל פרוטוקול טרנספקציה מתאים משתמשים ב-100 ננוגרם לבאר של פתוגן ומארח פלסמיד מסגרת קריאה פתוחה מבנה 10 ננוגרם לבאר של פלסמיד לוציפראז גחלילית CMV כדי לנרמל ליעילות טרנספקציה.

כל נקודה נבדקת בתערובת טרנספקציה משולשת לצלחות של 2 9 3 תאי T מתורבתים. הקפד להפקיד בעדינות את תערובת ה-DNA על התאים מכיוון שתאי 2 9 3 T אינם נצמדים חזק ומתנתקים בקלות מתחתית הבאר באינקובטור תרבית תאים למשך 24 עד 30 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם תאי שטיפה של 5% פחמן דו חמצני עם PBS ב-100 מיקרוליטר לבאר. מוסיפים 40 מיקרוליטר של ליזה וניל אחת, חוצץ ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

תחת תסיסה, שמור 10 מיקרוליטר של ליזאט תאים בצלחת לבנה אחרת למינון הבא של לוציפראז הגחלילית המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס או לחילופין במינוס 20 מעלות צלזיוס עם תקרה כדי למדוד את פעילות גאיה. מניחים את הצלחת לתוך לומינומטר ומזריקים 100 מיקרוליטר של מגיב בדיקת וניל לוציפראז על ליזטים של תאים. לאחר מכן ספרו זוהר למשך 10 שניות.

מינון של צלחת 96 באר אורך כחצי שעה. השתמש תמיד בתמציות טריות מכיוון שהקפאה או אחסון לטווח ארוך עלולים להשפיע על פעילות Gaia בתיווך אינטראקציה על 10 תמציות התאים הנותרות של מיקרוליטר. הזרקו 50 מיקרוליטר של מגיב בדיקת לוציפראז גחלילית על ליזטים של תאים באמצעות לומינומטר וספירת זוהר למשך 10 שניות.

מינון של צלחת 96 באר לוקח כחצי שעה לכל אינטראקציה. חשב את היחס בין פעילות Gaia luciferase לפעילות לוציפראז גחלילית כדי לקבל ערך זוהר מנורמל של GAIA. תוך התחשבות ביעילות הטרנספקציה ובכדאיות התא.

חשב את ממוצע המשולש כדי לנטר את האינטראקציה. הערך יחס זוהר מנורמל או NLR עבור כל זוג מארח פתוגן. לשם כך, חלקו את פעילות הזוהר המנורמלת של GAIA שזוהתה בנוכחות חלבוני הפתוגן והמארח כאחד בסכום הפעילויות שנמדדו בבארות הבקרה.

ערך החתך של NLR עבור אינטראקציות חיוביות הוערך במחקר קודם בסביבות 3.5. חוזק עיקרי של כללי GIA בתפוקה גבוהה, בדיקת השלמת חלבון, או H-T-G-P-C-A טמון ברגישות הגבוהה שלו כפי שמומחש על ידי הערכת שיעורי חיובי כוזב ושלילי כוזב עבור חלבון HPVE 2 כדי לקבוע את השיעור השלילי השגוי. אינטראקציות ידועות של E 2 מ-HPV 16 הוערכו על ידי H-T-G-P-C-A ארבע מתוך 18 אינטראקציות לא שוחזרו בהתאמה לשיעור שלילי כוזב של 22%.

האינטראקציות החיוביות השגויות נמדדו כ-5.8% באמצעות 12 HPVE, שני חלבונים כנגד קבוצה אקראית של חלבונים תאיים. הספציפיות החזקה של השיטה מודגשת באיור זה המראה כי מוטציה נקודתית בודדת הידועה כמפריעה לקשירת E two לשותפה התא BRD ארבע מחסלת, יחס ה-NLR. גישה אקטומית השוואתית בקנה מידה גדול זו יושמה לאחרונה בהצלחה על שלושה חלבונים מוקדמים של נגיפי פפילומה אנושיים, E 2, E 6 ו-E 7, שמקורם בגנוטיפים שונים, המייצגים את המגוון הטבעי שלהם בטרופיזמים ופתולוגיות עבור כל אחד מהחלבונים המוקדמים.

אשכולות היררכיים של פרופילי האינטראקציה, בעיקר מסכמים את פילוגניית HPV המוכיחה את חוסנה של הגישה ואת מערכי נתוני האינטראקציה. ניתן להשתמש בו כדי לתאם פרופילי אינטראקציה ספציפיים של מארח וירוסים עם תכונות פתולוגיות, ובכך לתת רמזים על מעורבותם של חלבונים נגיפיים. בפתוגנזה, ניתן לחלץ אינטראקציות ספציפיות לגנוטיפ, אשר עשויות להתאים לטרופיזם או לסמנים ביולוגיים פתוגניים.

כפי שמודגם כאן עבור E שישה שותפים הפועלים באינטראקציה, מטרות תאיות מוינו על סמך עוצמת האינטראקציה וקובצו לפי סוג HPV אינטראקטיבי. ייצוג זה מאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים ספציפיים כגון אופנה, המקיימת אינטראקציה רק עם ששת החלבונים E של HPV אונקוגני. מיקוד כזה חייב להיות חיוני לתכונה המסרטנת של כל HPV אונקוגני ולכן מהווה מועמד טוב לשמש כסמן חלופי לזיהום HPV או כמטרה טיפולית.

בצע הליך זה. ניתן להתאים את ה-H-T-G-P-C-A לשימוש עם חלבון שלישי המתבטא כהיתוך עם תג ביוטין. זה מאפשר לכידה של שלושה קומפלקסים שותפים על לוחות צבע של צלילת סטרפטוק, וזה יכול לענות על שאלת היווצרותם של קומפלקסים חלבונים גדולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין אינטראקציות של פתוגן, סיר מארח. שלישית, על ידי בחינת שותפי אינטראקציה של גרסאות זנים מרובות. שנית, על ידי השוואת האינטראקציה שלהם עם קבוצה שלמה של סוגי פתוגנים באמצעות משך חלבון חלבון, נניח בתאי יונקים.