Name: גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: למד שיטה השוואתית לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בין פתוגנים למאכסן באמצעות Y2H ו-HT-GPCA. גישה זו מאפשרת זיהוי ביומרקרים ספציפיים לזנים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון מהמכון פסטר ועל ידי מענקים מLigue Nationale contre le הסרטן (מענקי R05/75-129 וRS07/75-75), איגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן (מענקים ARC A09 / 1/5031 ו4867), וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 וANR09 הבעת 026 01). MM היה מקבל מלגת MENRT.

1. שתי הקרנות היברידיות-שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות הדרושים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך סינטטי מלא בגלילה (SD): לפזר 26.7 גרם של בסיס SD מינימאלי עם גלוקוז ב1 ליטר של מים. הוסף 2 גרם של תערובת חומצת אמינו מוכנה כדלקמן: hemisulfate 2 גרם אדנין, 2 גרם ארגינין הידרוכלוריד, 2 גרם היסטידין HCl, 2 גרם Isoleucine, 4 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין הידרוכלוריד, 2 גרם מתיונין, 3 גרם פנילאלנין, 2 גרם L -סרין, אורציל 2 גרם L-תראונין, 3 גרם טריפטופן, טירוזין G 2, 1.2 גר &#39;, 9 גרם Valine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק סלקטיבית מתוך SD-L/-W/-H: SD המכיל כל חומצות אמינו חיוניות, למעט אלו שצוינו (-L:-אוצין;-W:-טריפטופן;-H:-היסטידין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YPGLU: עבור 1 ליטר, במשקל 10 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של Bacto Peptone ו20 גרם של גלוקוז. השלם עם 25 גרם אגר Bacto לתקשורת מוצקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YCM: כמו YPGLU, אבל מותאם לרמת חומציות 4.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזדווגות ומתפשט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquots הקפוא של טרום ההתמרהזן אד Y187 שמרים (הזדווגות הסוג α) המכיל ספריית cDNA המשובטת בpACT2. בדקו כדאיות תא על ידי ציפוי דילולים סדרו על צלחות SD-L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל ORF הפתוגן לתוך pGBKT7 וקטור, ולהפוך את פלסמיד רקומביננטי באמצעות הליך סטנדרטי לזן שמרי AH109 (סוג הזדווגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים pGBKT7-שינו AH109 שמרים על צלחות SD-W. דגירה לפחות יומיים 30 ° C בחממת humidified. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד להקרנת שתי ההיברידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3-aminotriazole (3-AT), מעכב תחרותי של אנזים HIS3, כדי לנטרל את transactivation עצמי הפוטנציאל של גן הכתב HIS3 על ידי החלבונים של פתוגנים. בצע בדיקה אוטומטי הפעלה על ידי קביעת הריכוז של 3-AT, אשר מונע צמיחה של שמרי pGBKT7-הופכים על צלחות SD-W/-H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר זרע 30 של SD-W עם כמה מושבות של AH109 pGBKT7-טרנספורמציה. דגירה 30 שעות ב 30 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 200 מ&quot;ל של SD-W עם 30 מ&quot;למAH109 התרבויות. דגירה עם סיבוב סביב 20 שעות ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מופשר Y187-ספרייה הפך cDNA ב20 מ&quot;ל YPGLU, דגירה 10 דקות בשעה 30 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה נפח pGBKT7-שינתה AH109 התרבות מקבילה לסכום שווה ערך של תאי שמרי Y187 קיימא עבור 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ב 20 ° C. למשוך את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל YPGLU בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שמרי AH109 המושעים עם Y187 ספרייה ובה. להעביר בצינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ב 20 ° C, לסגת בזהירות supernatant (גלולה שבירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בYPGLU כדי לקבל סכום כולל של 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים מורחים על 3 YCM-אגר 150 צלחות מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;ל / צלחת. דגירה 4.5 שעות ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שמרי הזדווגו מצלחות YCM על ידי גירוד עם כוס לגרוף 10 מ&quot;ל של SD-L/-W/-H. יש לשטוף את הצלחות שתי פעמים עם מדיום SD-L/-W/-H 5 מ&quot;ל ובריכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב -3,500 סל&quot;ד, 20° C. בטל supernatant ו resuspend את השמרים בגלולה 5 בינוניות SD-L/-W/-H מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים שמרי הזדווגו על 10 צלחות (0.5 מ&quot;ל / צלחת) של אגר SD-L/-W/-H השלימו עם הריכוז המתאים של 3-aminotriazole (3-AT) נקבע בבדיקה אוטומטית ההפעלה. לדגור על 30 מעלות צלזיוס באווירת humidified עבור 6-10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע דיפלואידי (2n) השיעור על מנת להעריך את יעילות הזדווגות על ידי הפצת 250 μl של דילולים סדרתי (10 -4 עד 10 -6) של ההשעיה שמרי הזדווגו על צלחות SD-L/-W. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לספור מושבות גדלו על SD-L/-W, ולהסיק המספר הכולל דיפלואידי ההווה בהיקף הראשוני של שמרי הזדווגו. דווח על מספר דיפלואידי זה למספר שמרים המכיל ספרייה בת קיימא כדי לחשב את שיעור דיפלואידי. זה צריך לנוע סביב 10-25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6-10 ימים לאחר דגירה על 30 מעלות צלזיוס, לבחור מושבות שמרי הזדווגו בSD-L/-W/-H הטרי + 3-AT צלחות. [טיפ: כדי השמרים בערכה של 8נתיבים של 12 בארות המתרבות בצלחת 96 היטב, כדי שיהיה קל יותר אחר כך עבור סידור]. בואו מושבות שמרים לגדול במשך 4-5 ימים ב30 ° C באווירת humidified. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה של HIS3 שיבוטים חיוביים על ידי PCR וסדר המטרה היא PCR להגביר ORF כלול בpACT2 וקטורים של מושבות שמרים שגדלו על צלחות SD-L/-H/-W סלקטיבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים היטב PCR צלחת 96 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse תאי שמרים, להוסיף 50 μl לכל טוב של פתרון 20T Zymolase (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב10 מ&quot;מ המאגר pH HEPES 7.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend מושבה אחת בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C ו 15 דקות ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצלחת בחזרה על קרח. הוסף 50 μl של מים מזוקקים בכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3500 סל&quot;ד ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר 10 μl לזהות באמצעות הוספת פריימרים חישול או צדדים של ORF נגזרים מcDNA בpACT2 וקטורים. הפרוטוקול הוא GIven להגברה של 96 מושבות שמרי lysed עם פולימראז ExTaq. מכין את התערובת הבאה: 525 חיץ μl 10X ExTaq, 420 תמהיל dNTPs μl (2.5 מ&quot;מ), 10.5 פריימר קדימה μl (1 מיקרוגרם / μl), 10.5 פריימר ההפוך μl (1 מיקרוגרם / μl), 31.5 ExTaq μl (5 U / μl ) ו3202.5 H 2 0 μl. הפץ 40 μl של התערובת לכל גם בצלחת 96-PCR היטב. הוסף 10 μl של שמרי lysed בכל טוב. לבצע הגברה כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות, וסופו של דבר עם 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. הפעלת 3 μl של מוצרי ה-PCR על 1.2% ג&#39;ל agarose כדי לזהות שיבוטים PCR-חיוביים. שים לב שהשימוש טרום יציקה 96 גם agarose ג&#39;לי מומלץ. [טיפ: ניתן לאחסן צלחת ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ושימוש חוזרת לPCR החדש] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף שברי PCR מוגברים בודדו מHIS3 שיבוטים חיוביים. לבצע ניתוח תפציץ לזהות הסלולרי ORF. מערכים נמוך ביטחון (E &amp; ערךGT; 10 -10, זהות &lt;80%, אורך הפפטיד &lt;20 חומצות אמינו) מבוטלות, כמו גם frameshifted והמוקדם קודון STOP המכיל רצפים. </li></ol></li></ol> 2. מטריקס בניין לHT-GPCA HT-GPCA הוא assay מבוסס תאי יונקים שבו שני חלבוני הפתוגן ומארח transiently הביעו התמזגו ברים משלימים של פיצול לוציפראז Princeps Gaussia. על האינטראקציה של בני הזוג, אנזים זה מחדש ומאפשר מידה של הפעילות האנזימטית שלה. עוצמת האינטראקציה היא להסיק מכך יחס הארה מנורמל (ראה להלן ואיור 1) <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של שותפי תא מארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חלבונים שמזוהים יותר משלוש פעמים בהקרנות Y2H עבור אימות נוספת בתאי יונקים להגדיל את מערך הביטחון 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שותפים באינטראקציה ידועה של חלבוני הפתוגן כpositive פקדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לוקטורים תואמים HT-GPCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל כל חלבון ORF הפתוגן בוקטור pSPICA-N2 לייצר חלבוני הפתוגן עם חומצות אמינו 110-185 של Princeps Gaussia מואנשים התמזגו לוציפראז ב( fusions חלבון GL2 לפתוגן) N-סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר חלבון תאי ORF ישירות מהשיבוטים החיוביים Y2H או ממקורות אחרים ORF (ORFeome אנוש <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/)</a> ולהעביר אותם לוקטורי pSPICA-N1 כדי לייצר חלבונים התמזגו בN-הסופית עם חומצות אמינו של 18-109 האנושי Gaussia Princeps לוציפראז (fusions חלבון GL1-מארחת). [עצה: לשיבוט בקנה מידה גדול, מערכת שיבוט השער מומלצת. במקרה זה, להגברת PCR, השתמש פריימרים נועדו להכיל אתרים תואמים Gateway]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף כל וקטורי הביטוי. רצפים של pSPICA-N1 ו-N2 pSPICAניתן למצוא בהתייחסות 8. </li></ol></li></ol> שים לב שניתן inversed בונה פלסמיד, חלבונים פתוגנים כלומר בpSPICA-N1 ומארח חלבון לתוך pSPICA-N2. 3. Assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps מבוסס לוציפראז חלבון שלמה (HT-GPCA) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T תאי זרע ב350,000 תאים / מ&quot;ל ​​של DMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS) ללא אנטיביוטיקה. הפץ 100 μl / היטב בתרבות צלחות לבנות סטרילי. לא יעלה על 10 צלחות בניסוי יחידה. בואו תאים לגדול במשך 24 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2. [טיפ:. מאז פלסמידים pSPICA מכילים המוצא SV40, השימוש בתאי 293T מאפשר השכפול שלהם בתאי transfected ובכך מוביל לביטוי יתר של שני שברי לוציפראז] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, תאי transfect באמצעות כל פרוטוקול transfection מתאים. שימו לב כי לריאגנטים transfection מסוימים, נוmber של תאים שנזרעו אולי צריך להיות מותאם. השתמש 100 ננוגרם לכל גם הן את הפתוגן ומארח ORF בונה פלסמיד. שיתוף transfect 10 ng לכל גם של CMV-Firefly לוציפראז פלסמיד לנרמל ליעילות transfection. כל נקודה היא נבדק בשלושה עותקים. [טיפ:. ניתן לבצע תערובות DNA היום לפני transfection ומאוחסנות ב -20 ° C עם חותמות דבק] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת transfection לצלחות של תאי 293T תרבית. להיות זהיר כדי להפקיד את התערובת בעדינות על ה-DNA בתאים, כמו 293T הם לא מאוד חסיד ולנתק בקלות מתחתית הבאר. דגירה בתא תרבות חממה עבור 24-30 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה תא ומינון לוציפראז Gaussia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS (100 μl / טוב). הוסף 40 מאגר תמוגה Renilla 1X μl. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסוך 10 μl של lysates התא בפלאט הלבן אחרדואר למינון הבא של פעילות לוציפראז Firefly. החנות ב 4 מעלות צלזיוס או לחלופין ב -20 ° C עם איטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את פעילות Gaussia על 30μl הנותרים של lysates תא על ידי הוספת 100 μl של מגיב assay לוציפראז Renilla וספירת הארה עבור 10 שניות עם luminometer. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. לבצע מדידה עם תמציות תאי אחסון טריות מאז הקפאה או לטווח ארוך עשוי להשפיע על פעילות Gaussia אינטראקציה בתיווך. </li></ol></li></ol><ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של פעילות Firefly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הפעילות בגחלילית הציל 10 μl של lysates תא על ידי הוספת 50 μl של מגיב assay לוציפראז Firefly וספירת הארה עבור 10 שניות. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. [טיפ: המינון של Firefly לוציפראז יכול להתבצע ביום שאחרי על lysates קפוא.] </li></ol></li></ol><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישובי NLR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; לכל אינטראקציה, לחשב את היחס בין פעילות לוציפראז Gaussia ופעילות לוציפראז Firefly להשיג ערך הארה Gaussia מנורמל תוך לקיחה בחשבון של היעילות transfection וכדאיויות תא. לחשב את הממוצע של triplicates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על האינטראקציה, מעריך יחס הארה מנורמל (NLR) עבור כל זוג הפתוגן-מארח. לשם כך, יש לחלק את פעילות הארה Gaussia המנורמלת זוהתה בנוכחותם של שני חלבוני הפתוגן ומארח בסכום של הפעילות שנמדדה בשליטת בארות (איור 1 מותאם מהתייחסות 8). ערך חתך NLR לאינטראקציות חיוביות כבר מוערך כ 3.5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אשכולות היררכי באמצעות חבילת נתון R. ראשית, קבוצה את נתוני NLR לקטגוריות, ואז לחשב dendrogram אינטראקציה תוך שימוש בשיטת ההצמדה המלאה. דמיינו את זהdendrogram עם JavaTreeView 10. לחשב את המרחק בין dendrogram אינטראקציה ועץ פילוגנטי באמצעות מקדם מתאם פירסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור אינטראקציה רשתות, בחר את האינטראקציות חיוביות מבסיס נתוני HT-GPCA ולהשתמש בתוכנת Cytoscape 1. חלץ את מעלות של החלבונים המארחים ולהתוות ההפצה שלהם כדי לגשת לדינמיקה המקומית ברשת. ניתן גבי רשתות Host-פתוגנים לinteractome המארח כדי לספק הערכה של ההשפעה הגלובלית של חלבוני הפתוגן ברשת הסלולרית המארחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ GO (אונטולוגיה ג&#39;ין) מונחים הקשורים לגורמים הסלולריים הממוקדים עם דוד מסד הנתונים ביואינפורמטיקה 12 להעריך את ההעשרה התפקודית של בסיס הנתונים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
<li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li>
<li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+protein+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230(2008).</li>
<li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26(2012).</li>
<li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32(2008).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li>
<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
<li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li>
<li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

באופן עצמאי, שמרים, שני מבחני אינטראקציה היברידיים ויונקים, כגון GST הנפתח, LUMIER או MAPPIT, הוכיחו להיות כלים יעילים לאיתור חלבונים אינטראקציות, אבל מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של חיובית שגוי וכוזב שליליים אינטראקציות קשורות לטכניקות אלה 15. יתר על כן, ראיות הולכות וגדלו כי שילוב שיטות מאונך מגדילה את האמינות של בסיס נתוני האינטראקציה השיג 7. ההתפתחות האחרונה של טכניקת HT-GPCA מתוארת כאן השתפרה לא רק את הרגישות של גילוי אינטראקציה בין חלבונים בתאי יונקים בי...

הכמות הולכת והגדלה של נתונים שנאספו כדי ליצור מפות אינטראקציה בין חלבונים פותחת אופקים כדי להבין עוד יותר זיהומי הפתוגן. ככל שהבנה הגלובלית של זיהומי פתוגן מתחילה להתגלות, הוא מספק גישה למגוון של הפרעות הנגרמות על ידי חלבוני גורמי מחלה בעת חיבור proteome האנושי 1. זה ובכך מציע דרך כדי להבין איך לתפעל את מכונות פתוגנים התא המארחת. בפרט, המיפוי של מספר רשתות אינטראקציה ויראלי-מארחות גילה כי חלבונים נגיפיים מעדיפים למקד חלבונים מארחים שהם מאוד מחוברים ברשת הסלולרית (רכזות), או שהם מרכזיים בנתיבים רבים ברשת (חלבוני צווארי בקבוק) 2-4. אינטראקציות אלה מאפשרים לוירוסים כדי לתפעל תהליכים תאיים חשובים, אשר היא סייע לשכפל ולייצר צאצאים מדבקים. מיפוי אינטראקציות השוואתי שנערכו לאחרונה על וירוסים הקשורים במטרה לחלץ מידע ביחס לפתוגנזה 4. יתר על כן, מחקרים של הנוף מארח פתוגנים האינטראקציות שהורחבו לפתוגנים רבים 5. זיהוי הגורמים ממוקד התא מספק תובנות האסטרטגיות בשימוש על ידי פתוגנים להדביק תאים ומאפשר זיהוי של סמנים פתוגניים פוטנציאליים. המערכת דו היברידי השמרים היא השיטה הפופולרית ביותר לזיהוי אינטראקציות בינאריים מאז סריקות גנטיות היא כלי יעיל ורגיש למיפוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים. הגישה מוצעת כאן עוד יותר משפר את הקרנות Y2H בודדות על ידי הערכת חלבון של גרסאות זן פתוגנים רבות, המספק גישה לסקירה השוואתית של אינטראקציות בין חלבונים הפתוגן-מארחים וכך. יתר על כן, מגבלה עיקרית של הקרנת שתי היברידי שמרים טמון בשיעור שגוי שלילי גבוה, מאחר שהוא מתאושש כ -20% מאינטראקציות סה&quot;כ 6. משמעות הדבר הוא כי אינטראקציות עם אותרו רק קבוצת משנה של פתיוגרסאות גנס אולי חמקו מזיהוי עם האחרים. לכן, שותפים בודדים המתעוררים מכל ההקרנות של שתי ההיברידיות מאותגרים עוד יותר לאינטראקציה עם מגוון רחב של זנים למדו מלא, ומספקים מערכי נתונים השוואתיים אינטראקציה. מאז שהוכיח כי שילוב מתודולוגיות שונות מגביר משמעותי את החוסן של מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים 7, אימות זה מבוצעת בתאי יונקים ידי assay שלמת חלבון שבר חדש שפותח בשם HT-GPCA 8. מערכת מבוססת תא זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון על ידי שלמה של Princeps Gaussia לפצל לוציפראז ותוכנן כך שיתאים לפורמט תפוקה גבוהה. הודות לטכנולוגיה המבוססת על הארה שלה ורעש הרקע הנמוך שלה בהשוואה לassay הקרינה מבוססת אחרים, HT-GPCA מציג רגישות גבוהה להפליא. באופן כללי, גישה זו מהווה יעילהכלי ליצירת מיפוי מקיף של interplays מאכסן לפתוגן, המייצג את הצעד הראשון לקראת הבנה גלובלית של התא המארח חטיפה.

<table><tbody><tr><td>זני שמרים</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimal SD base</td><td>US ביולוגי</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-אמינו-1,2,4-טריאזול (3-AT)</td><td>Acros אורגניים</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מי מלח (PBS)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת רנילה לוציפראז</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>לבן צלחת תרבות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96-wellPCR לוחות</td><td>4titude</td><td>4t-i0730/C</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור (30 & deg; ג)</td> אינקובטור <td>ממרט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(37 מעלות; C)</td> <td>הראוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>Berthold</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

מאמצים משמעותיים נאספו ליצירת מפות רשת אינטראקציה בין חלבונים מקיפות בקנה מידה גדולה. זו היא סייעה להבין את יחסי פתוגן-מארחים ולמעשה בוצעה על ידי הקרנות גנטיות בשמרים שתי מערכות היברידיות. השיפור האחרון של זיהוי אינטראקציה בין חלבונים על ידי assay שלמת בר מבוסס לוציפראז Gaussia מציע כעת את ההזדמנות לפתח גישות interactomic השוואתיות אינטגרטיביים הדרושים על מנת להשוות בקפדנות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסות זן פתוגן שונים נגד מערך משותף של גורמים הסלולר. מאמר זה מתמקד באופן ספציפי את השירות של שילוב של שתי שיטות מאונך ליצירת מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים: שמרי שני היברידי (Y2H) ובדיקה חדש, assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps חלבון שלמה (HT-GPCA) שבוצע בתאי יונקים. NT &quot;&gt; זיהוי בקנה מידה גדול של שותפים הסלולר של חלבון הפתוגן מבוצע על ידי הזדווגות מבוססת שמרי הקרנות שתי היברידיות של ספריות cDNA באמצעות גרסאות זן פתוגן מרובות. משנה של שותפים באינטראקציה שנבחרו על ניקוד ברמת הוודאות גבוהה הוא סטטיסטי נוסף תוקף בתאי יונקים לאינטראקציות חכמות זוג עם המערך השלם של חלבוני גרסאות פתוגן באמצעות HT-GPCA. זה שילוב של שתי שיטות משלימות משפר את חוסנו של מערך יחסי הגומלין, ומאפשר ביצועים של ניתוח השוואתי אינטראקציה מחמירה. interactomics השוואתי כאלה מהווה אסטרטגיה אמינה וחזקה לפענח כל interplays הפתוגן-מארח.

כוח עיקרי של HT-GPCA טמון ברגישות הגבוהה שלו, כפי שמודגם על ידי ההערכה של שיעורים שליליים שווא ושקר חיובי לחלבון HPV E2 באיור 2 (עיבוד ההתייחסות 13). כדי לקבוע את השיעור השלילי הכוזב, אינטראקציות ידועות של E2 מHPV16 הוערכו על ידי HT-GPCA (איור 2 א). ארבעה מתוך 18 אינטראקציות לא התאוששו (מקבילה ל -22% שיעור שלילי כוזב). האינטראקציות החיוביות הכוזבות נמדדו להיות 5.8% באמצעות חלבוני 12 HPV E2 נגד קבוצה אקראית של חלבונים תאיים (איור 2).</stron...

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע מחקרי אקטומיקה כדי להשוות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מווריאנטים שונים של פתוגנים מול קבוצה משותפת של גורמים תאיים. מטרה זו מושגת באמצעות סריקות שמרים דו-היברידיות (two-hybrid) המבוססות על הזדווגות של cDNA, כדי לזהות שותפי אינטראקציה פוטנציאליים של חלבונים מווריאנטים שונים של פתוגנים. כשלב שני, רצפי הקודים הפתוחים לקריאה (ORFs) של שותפי האינטראקציה יעברו ריצוף ויועברו לווקטורים המתאימים להמשך תיקוף.בשלב הבא, נבחרת קבוצה של שותפים בודדים שעלו משני סינויי ההיבריד ונבדקים שוב לגבי האינטראקציה שלהם עם המגוון המלא של הזנים שנחקרו. פעולה זו מבוצעת באמצעות בדיקת השלמה של פרגמנטים של חלבון (protein fragment complementation assay) אורתוגונלית המבוססת על לוציפראז, המתבצעת בתאים של יונקים כדי לספק מערכי נתונים השוואתיים חזקים של אינטראקציות. התוצאות מראות עצימויות אינטראקציה שונות בין חלבוני הפתוגן לחלבוני התא על בסיס מדידות הלוציפראז שהתקבלו, ובכך מספקות סקירה השוואתית של אינטראקציות חלבון-חלבון בין הפתוגן למארח.עיבוד של פרופילי האינטראקציות באמצעות אשכולה היררכית (hierarchical clustering) מקשר בין אינטראקציות ספציפיות של פתוגן ומאחס לבין מאפיינים פתולוגיים, ומספק תובנות לגבי המעורבות של חלבוני הפתוגן בפתוגנזה. היתרון המרכזי של גישה זו על פני שיטות אחרות למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון בין פתוגן למאחס הוא שהיא מספקת סט נתונים השוואתי מחמיר של אינטראקציות בין מספר וריאנטים של זנים. טכניקה זו מספקת תובנות לגבי רשת האינטראקציות של חלבון פתוגני, אך ניתן ליישמה גם במערכות אחרות המשתמשות במולקולה זיהומית, כמו למשל וירוסים שלמים וגנטיקה של river. התחל פרוטוקול זה בהזדווגות ופיזור של תאי השמרים כפי שמתואר בחלק של זריעת התאים בפרוטוקול הכתוב.30 מיליליטר של מצע ברירה (selective dropout medium) ללא טריפטופאן, עם מספר מעט של מושבות של זן השמר AH 1 0 9 שהותמר עם הפלסמיד P-G-B-K-T seven המבטא את חלבון הפתוגן. דגירה למשך 30 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם סיבוב. לאחר מכן, זריעה של 200 מיליליטר של מצע ברירה ללא טריפטופאן באמצעות 30 המיליליטר של AH 1 0 9.מדגרי התרביות מתבצעים עם סיבוב למשך 20 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. כמו כן, יש להדגיר את ספריית ה-CDNA שהועברה ל-Y 187 ב-20 milliliters של YP glue למשך 10 דקות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם סיבוב. לאחר מכן, יש לסבב במצנטריפוגה נפח של תרבית AH 109 שהועבר אליה PG BK T seven, השקול לכמות תאי שמר Y 187 חיוניים, למשך חמש דקות במהירות של 3,500 RPM ובטמפרטורה של 20 degrees Celsius.שאבו בזהירות את העילאי וסספנדו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של דבק YP. ערבבו את שמרים AH 109 שסוספנדו מחדש עם הספריה המכילה את Y 187. העבירו למסורת של 50 milliliter לפני צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3,500 RPM וב-20 degrees Celsius.לאחר נסיגה זהירה של ה-super dat Resus, השביו את המשקע ב-YP glue עד להשגת נפח סהרי של 1.5 milliliters. לאחר מכן, פזרו את השמרים על שלוש צלחות YCM agar בקוטר 150 millimeter, בנפח של 0.5 milliliters לכל צלחת, והדגירו במשך 4.5 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. אספו את השמרים שהשבבלו מצעלחות ה-YCM על ידי גירוד עם גולש זכוכית לתוך 10 milliliters של מצע dropout סלקטיבי ללא leucine, tryptophan ו-histidine.שטפו את הפיתה פעמיים עם חמישה מיליליטר של אותו מצע, ואספו את התוצריים לאחר סנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3,500 RPM וב-20 מעלות צלזיוס. השליכו את העלייה והשתמשו שוב. תלו את משקע השמרים בחמישה מיליליטר של מצע ברירה (selective dropout medium) ללא leucine tryptophan ו-histidine.לאחר מכן, פזרו את השמרים שהזדווגו על 10 צלחות של אגר בריר (selective dropout agar) ללא ליוצין, טריפטופן והיסטדין, בתוספת ריכוז מתאים של three amino triazole או 3-AT כפי שנקבע בבדיקת האוטו-אקטיבציה. חשבו את שיעור הדיפלואידיות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לאחר דגירה ב-30 °C באטמוספירה לחה למשך שישה עד 10 ימים. בחרו מושבות שמרים והעבירו אותן לצלחות שהוכנו טריים מאגר בריר ללא ליוצין, טריפטופן והיסטדין בתוספת 3-AT.סדרו את השמרים בתבנית של שמונה נתיבים עם 12 בארות המדמה פלטת 96 בארות, כדי להקל על הרצף בהמשך. תנו למושבות השמרים לגדול במשך ארבעה עד חמישה ימים בטמפרטורה של 30 °C באטמוספירה לחה. מטרת חלק זה היא לבצע PCR להגברה של ה-CDNA הכלול בוקטורי PA ct two ממושבות שמרים מולחוחות שגודלו על מצעי dropout agar סלקטיביים ללא leucine, trytophan ו-histidine.התחל בהנחת פלטת PCR בעלת 96 בארות על קרח, כדי לลิז תאי שמר באמצעות 50 µL של תמיסת xmal 20 T לכל בארה. השהה בעדינות מושבה אחת לכל בארה. דגור את הפלטה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C ולמשך 15 דקות בטמפרטורה של 95 °C.לאחר החזרת הפלטה לקרח, הוסיפו 50 µL של מים מזוקקים לכל באר, ערבבו באמצעות פיפטא (pipetting up and down), והמשיכו לצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3,500 RPM ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר הכנת תערובת ה-X tack כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, חלקו 40 µL מהתערובת לכל באר בפלטת PCR בעלת 96 בארות. הוסיפו 10 µL של השמרים שעברו ליזיס לכל באר ובצעו הגברה כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב.הריצו 3 µL מתוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז בריכוז 1.2% כדי לזהות שיבוטים חיוביים ל-PCR. ביצעו ריצוף למקטעים שהוגברו ב-PCR אשר בודדו משלושה שיבוטים חיוביים. לאחר מכן, בצעו אנליזת blast כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות (open reading frames) תאיות, תוך השמטת התאמות בעלות רמת ביטחון נמוכה, וכן רצפים המכילים הסטת מסגרת (frameshift) או קודוני עצירה מוקדמים, לפני ביצוע הטרנספקציה לתאים.העבירו את מסגרות הקריאה הפתוחות של חלבון הפתוגן וחלבון התא לווקטורים המתאימים להם כדי להפיק חלבונים המחוברים למקטעים של הלוסיפראז Gaia, כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. זרעו תאי 2 9 3 T בריכוז של 350,000 תאים למילליליטר של DMEM עם 10% fetal bovine serum ללא אנטיביוטיקה. חלקו 100 microliters לכל באר בלוחיות תרבית לבנות סטריליות לפני גידול למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide. למחרת, בצעו טרנספקציה לתאים באמצעות פרוטוקול טרנספקציה מתאים; השתמשו ב-100 nanograms לכל באר של בניית הפלסמיד של מסגרת הקריאה הפתוחה הן של הפתוגן והן של המאכסן. בצעו טרנספקציה של 10 nanograms לכל באר של פלסמיד CMV firefly luciferase לצורך נורמליזציה של יעילות הטרנספקציה.כל נקודה נבדקת בשלוש חזרות; העבירו את תערובת הטרנספקציה לצלחות המכילות תאי 2 9 3 T מתרבדים. יש להקפיד להניח בעדינות את תערובת ה-DNA על התאים, שכן תאי 2 9 3 T אינם נצמדים חזק וניתקים בקלות מהתחתית של הבאר. הדגרו באינקובטור לתרביות תאים למשך 24 עד 30 שעות ב-37 °C עם 5% carbon dioxide. שטפו את התאים ב-PBS בנפח של 100 µL לבאר. הוסיפו 40 µL של one x vanilla lysis buffer, והדגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.תחת ערבוב, העבירו 10 µL של ליזאטים של תאים לפלטה לבנה אחרת לצורך מדידה עתידית של פעילות לוציפראז של גחליליות (firefly luciferase), שאורחנה בטמפרטורה של 4 °C או לחלופין בטמפרטורה של -20 °C, למדידת פעילות Gaia. הניחו את הפלטה בלומינומטר והזריקו 100 µL של ריאגנט לבדיקת לוציפראז אל הליזאטים של התאים. לאחר מכן, מדדו את הלומינסנציה למשך 10 שניות.מינון של פלטת 96 בארות אורך כחצי שעה. השתמשו תמיד בתמציות טריות, שכן הקפאה או אחסון לטווח ארוך עלולים להשפיע על פעילות Gaia המתווכת על ידי אינטראקציה ב-10 µL הנותרים של תמציות התאים. מזריקים 50 µL של ריאגנט למדידת firefly luciferase אל ליזאטים של תאים באמצעות לומינומטר, תוך ספירת הלומינסנציה למשך 10 שניות.מדידה של פלטת 96 בארות אורכת כחצי שעה עבור כל אינטראקציה. חשבו את היחס בין הפעילות של לוקספראזה Gaia לפעילות של לוקספראזה firefly כדי לקבל ערך לומנסנציה מנורמל של GAIA, תוך התחשבות ביעילות הטרנספקציה וביציבות התאים.חשבו את הממוצע של השחזרים כדי לנטר את האינטראקציה. העריכו יחס לומניסנציה מנורמל או NLR עבור כל זוג פתוגן-מארח. לשם כך, חלקו את פעילות הלומניסנציה המנורמלת של GAIA שהזוהתה בנוכחות חלבוני הפתוגן והמארח בסכום הפעילויות שנמדדו בבאירי הביקורת.ערך הסף של ה-NLR לאינטראקציות חיוביות נאמד במחקר קודם כ-3.5. חוזקה מרכזית של נהלי GIA בסריקה רחבה, בדיקת COMPLEMENTATION של חלבונים, או H-T-G-P-C-A, טמונה ברגישות הגבוהה שלה, כפי שמודגם בהערכת שיעורי הפוזיטיביים והנגטיביים המדוייקים עבור שני החלבונים של HPVE כדי לקבוע את שיעור השליליים השגויים. אינטראקציות ידועות של E two מ-HPV 16 נבחנו באמצעות H-T-G-P-C-A; ארבע מתוך 18 אינטראקציות לא התגלו, מה שמתבטא בשיעור של 22% של שליליים שגויים.נמדדו אינטראקציות חיוביות שגויות בשיעור של 5.8% באמצעות 12 חלבוני HPVE E2 מול קבוצה אקראית של חלבונים תאיים. הסגוליות הגבוהה של השיטה מודגשת באיור זה, המראה כי מוטציה נקודית אחת, הידועה כמעכבת את קישור E2 לשותפו התאי BRD4, מבטלת את יחס ה-NLR. גישה אקטומית השוואית רחבת היקף זו יושמה לאחרונה בהצלחה לשלושה חלבונים מוקדמים של נגיפי פפילומה אנושיים, E2, E6 ו-E7, שמקורם מגנוטיפים שונים, המייצגים את השונות הטבעית שלהם בטרופיזמים ובפתולוגיות עבור כל אחד מהחלבונים המוקדמים.צמידה היררכית של פרופילי האינטראקציה משחזרת במידה רבה את הפילוגניה של HPV, מה שמוכיח את חסונו של הגישה ואת רחבותם של מערכי נתוני האינטראקציה. ניתן להשתמש בה כדי להקרין פרופילי אינטראקציה ספציפיים בין הנגיף למארח עם מאפיינים פתולוגיים, ובכך לספק רמזים לגבי המעורבות של חלבונים נגיפיים. בתהליכי פתוגנזה, ניתן להפיק אינטראקציות ספציפיות לגנוטיפ, אשר עשויות להתאימו לטרופיזם או לסמנים ביולוגיים פתוגניים.כפי שמוצג כאן עבור שותפי אינטראקציה של E six, יעדים תאיים מוינו על בסיס עוצמת האינטראקציה והקבוצתו לפי סוג ה-HPV המקיים את האינטראקציה. ייצוג זה מאפשר זיהוי של סממנים ביולוגיים ספציפיים כגון fad, המקיים אינטראקציה רק עם חלבוני E six של HPV אונקוגני. מיקוד כזה חייב להיות קריטי לתכונה הקרצינוגנית של כל סוגי ה-HPV האונקוגניים, ולכן מהווה מועמד טוב לשימוש כסמן חלופי לזיהוי זיהום ב-HPV או כיעד טיפולי.בעקבות נוהל זה, ניתן להתאים את ה-H-T-G-P-C-A לשימוש עם חלבון שלישי המבוטא כהיתוך עם תג biotin. הדבר מאפשר ללכוד שלושה קומפלקסים של חלבונים שותפים על פלטות strep diving color, ובכך ניתן להשיב על השאלה בנוגע להיווצרותם של קומפלקסי חלבונים גדולים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לאפיין אינטראקציות בין פתוגן למארח. שלישית, באמצעות בדיקת שותפי אינטראקציה של וריאנטים של זנים מרובים. שנית, באמצעות השוואת האינטראקציה שלהם עם קבוצה שלמה של סוגי פתוגנים באמצעות בדיקת אינטראקציה בין חלבונים, למשל בתאים של יונקים.

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

מאמר זה מדגים את השימוש בתיוג רדיו רודף דופק בשילוב עם קישור פוטו-צולב ספציפי לאתר כדי לנטר אינטראקציות בין חלבון מעניין לגורמים אחרים ב-E. coli. בניגוד לשיטות הצלבה כימיות מסורתיות, גישה זו מייצרת "תמונות" ברזולוציה גבוהה של מסלול הרכבה מסודר בתא חי.

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני תמלול ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי, כולל בקרת איכות וצעדי עיבוד מראש לגישות אנליטיות סטטיסטיות מתקדמות.

ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

אנו מציגים כלי לביולוגיה של מערכות JUMPn כדי לבצע ולהמחיש ניתוח רשת עבור נתוני פרוטאומיקה כמותית, עם פרוטוקול מפורט הכולל עיבוד נתונים מראש, אשכולות ביטוי משותף, העשרת מסלולים וניתוח רשת אינטראקציות חלבון-חלבון.

JUMPn: יישום יעיל עבור אשכולות ביטוי משותף של חלבונים וניתוח רשת בפרוטאומיקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

למד שיטה השוואתית לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בין פתוגנים למאכסן באמצעות Y2H ו-HT-GPCA. גישה זו מאפשרת זיהוי ביומרקרים ספציפיים לזנים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

גלה סרטונים נוספים