מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר (transfect) DNA פלסמי להיפוטלמוס של עוברים של עכברים המתפתחים ברחם, וזאת כדי להפעיל או לדכא את תפקודו של גן מטרת. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי הרדמת העכברה ההרה וחשיפת הרחם באמצעות לפרוטומיה. השלב השני הוא הזרקת תמיסת ה-DNA לתוך המערכה השלישית (third ventricle) של מוחו של העובר.

בשלב הבא, ממוקמת האלקטרודה החיובית בתוך הרחם, בין השילייה לראש העובר. האלקטרודה השלילית מונחת על פני השטח החיצוניים של הרחם ומועברים פולסים חשמליים. השלב הסופי הוא הוצאת מוחות העוברים שעברו טרנספקציה לאחר שישה ימים.

בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנתח את השינויים הפנוטיפיים של התאים שעברו טרנספקציה, כגון מספרם, צורתם, מיקומם, ביטוי סמנים וכדומה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספקציה ויראלית, הם ראשית, היא אינה דורשת אמצעי זהירות מיוחדים או מתקנים ייעודיים; שנית, ניתן לבצע תargeting לאזור ספציפי; ושלישית, באמצעות אלקטרופורציה, סריקת גנים מועמדים היא מהירה יותר.

באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן הזרקת תמיסת ה-DNA לתוך החדר השלישי ומיקום נכון של אלקטרודת המחט דורשים מיומנות יד גבוהה וניסיון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום ההתפתחות ההיפותלמית, בייחוד שאלות הנוגעות לנדידת תאים, וכן לאופן שבו אזורים וגרעינים בודדים נקבעים גנטית. התחילו את הפרוצדורה במשיכה של מיקרו-פיפטות זכוכית באיכות גבוהה, שכן הן חיוניות לצמצום שיעור ההפלות הגבוה בתחילה כתוצאה מאובדן של נוזל מי שפיר.

להכנת ה-DNA, המסס את ה-plasma DNA המנוקה והנקי מאנדוטוקסין ב-PBS המכיל 0.1% fast green עד לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד עד שניים למיקרוליטר. ה-fast green יהפוך את התמיסה המוזרקת לנראית בתוך פרוזדור המוח העוברי. לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר מתמיסת ה-DNA לתוך המיקרו-פיפט מזכוכית.

לאחר מכן, חברו את המיקרו-פיפטית מזכוכית למערכת ההזרקה או לפיפטית פה. בשלב זה, הכינו את שולחן הניתוח עם פד חימום ואת כלי הניתוח. הפעילו את מקורות האור הקר כדי להקל על הדמיית העוברים. לאחר מכן, חטאו את כלי הניתוח באמצעות סטריליזטור חרוזי זכוכית.

בשלב הבא, הרדימו עכברה בהריון באמצעות isof fluorine. לאחר הרדמת העכברה, מרחו משחה על עיניה כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, התאימו את המסכה על פניה כדי לשמור על הרדמה רציפה.

כעת הניחו את העכבר על משטח חימום כאשר בטנו פונה כלפי מעלה. קבעו את גופו למקומו על ידי קיבוע ארבעת גפיו באמצעות סרט דביק. ודאו כי העכבר נמצא תחת הרדמה מלאה על ידי צביטה של זנבו לבדיקת רפלקס.

לאחר מכן, גלחו את פני הבטן וחטאו אותה באמצעות תמיסת יוד. בצעו חתך אורכי באורך של כ-1 עד 1.5 סנטימטרים על עור הבטן. לאחר מכן, חתכו את הפריטוניאום.

בשלב הבא, הניחו גזה מכותנה מסביב לחתך. שטפו את הגזה ב-PBS. חשפו קרן רחמית אחת על ידי משיכתה בזהירות בעזרת פינצטה קהה.

הימנעו ממתיחה חזקה של המיומטריום או של הרחם. לחץ גבוה בתוך הרחם יגדיל את הסיכויים לאובדן נוזל העובר בעת ההזרקה, דבר שיוביל להפלה. לאחר מכן, הניחו את קרן הרחם על גזה שנשטפה ב-PBS, ושטפו אותה ב-PBS מדי כמה דקות כדי לשמור עליה לחה.

כעת, תחת המיקרוסקופ, החזיקו את הרחם באופן שבו ניתן יהיה להדמיות של חדרי המוח. אין להזיז באופן נרחב עוברים שנמצאים במיקום לא נוח. פעולה זו רק מגבירה את הסיכוי להפלה.

הביטו בראשו של העובר מלמעלה כדי לאתר את המרווח שבו נמצא החריץ שבין ההמיספרות הקליפליות השמאלית והימנית. ניתן להבחין בקלות בין ההמיספרות, ואת הפרוזטורים הלטרליים שבתוכן ניתן בדרך כלל לזהות כצורות כהות יותר. אם העובר נמצא במנח אידיאלי להזרקת DNA, ניתן לנקב את דופן הרחם ולהגיע ישירות לחדר השלישי.

החזיקו את מיקרו-פיפטת הזכוכית עם ה-DNA שהוכן קודם לכן בזווית של 45 מעלות לדופן הרחם ונקבו אותה בקצה הרוסטרלי של החריץ הבין-המיספירלי (interhemispheric fissure), תוך חדירה לעומק של כמילימטר אחד. באופן זה, קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית יחדור לחדר השלישי של המוח ולא לחדר הצדי. לאחר מכן, הזריקו כמיקרוליטר אחד של תמיסת DNA לתוך החדר השלישי; בהזרקה מוצלחת, נוזל ירוק ימלא את החדר. חזרו על אותו הליך בכל העוברים באותה קרן רחם.

פעולה זו תאפשר זמן למסלול ה-DNA להתערבב באופן אחיד עם הנוזל הוונטריקולרי ולהגיע לכל האפיתל העצבי. כעת הפעילו את האלקטרופורטור וכווננו את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי. השתמשו באלקטרודת מחט מפלדת אל-חלד כקטב חיובי ובאלקטרודה השטוחה והעגולה כקטב שלילי, ובחרו בעוברי שהצד הגבי שלהם פונה כלפי מעלה לצורך האלקטרופורציה.

לאחר מכן, דקרו את דופן הרחם לצד ראשו של העובר, בין שק השריר (amniotic sac) לבין השלייה, על ידי דחיפת קצה מחט האלקטרודה כלפי מטה דרכה. השתמשו באצבע המורה של היד השנייה כנקודת התמסך לדחיפה. כ-5 mm מקצה האלקטרודה צריכים להימצא בין שק השריר לבין דופן הרחם, בערך בגובה המוח האמצעי.

מכיוון שזוהי אלקטרודת המטרה, מיקומה יקבע איזה חלק של הנוירו-אפיתל ההיפותלמי סביר יותר שיעבור טרנספקציה. לאחר מכן, בעזרת היד השנייה, מקמו את האלקטרודה השטוחה והעגולה מחוץ לדופן הרחם, בצדו הנגדי של ראש העובר. לאחר מכן, לחצו בעדינות את העובר בין האלקטרודות.

השתמש במפסק הרגל כדי להפעיל מתח. לאחר מכן, משוך לאט את אלקטרודת המחט מתוך הרחם תוך כדי החזקת הרחם בעזרת האצבע המורה של היד השנייה. אם נוזל מי שפיר דולף דרך הדופן הננקבת, העובר יעבור בדרך כלל הפלה.

לאחר ההזרקה והאלקטרופורציה של כל העוברים, החזיר את הרחם לבטן העכברה בזהירות רבה ומקם אותם בדיוק כפי שהיו קודם לכן. לאחר מכן, הרטב את חלל הפריטונאום בתמיסת סלין לפני סגירתו. תפר את הפריטונאום בחוט כירורגי מסוג cat gut, ולאחר מכן תפר את העור בחוט תפר עמיד יותר.

חטאו את פני הבטן באמצעות תמיסת יוד והזריקו תרופה נוגדת דלקת שאינה סטרואידית תת-עורית להקלה על הכאב. לאחר מכן, הוציאו את האם ממכשיר ההרדמה והניחו אותה בכלוב, המחומם באמצעות פד חימום. עקבו אחר העכבר עד להתאוששות מלאה מההרדמה ובדקו אותה מדי יום כדי לוודא כי היא מחלימה מההליך ללא כל סימן לזיהום או לכאב.

בשלב זה, קצרו את העוברים או את הדגימות לאחר הלידה בהתאם ליום הניתוח הרצוי. בחרו את העוברים שהוזרק להם DNA ועברו אלקטרופורציה, ובצעו דיסקציה של המוחות תחת מיקרוסקופ סטריאו זה. לאחר מכן, בדקו את נוכחות אות פלואורסצנציה ירוק באזור המתאים.

כדי לנתח את מוחו של העובר שנבחר, קבע את הרקמה למשך זמן קצר ב-4% paraldehyde. לאחר מכן, הטמע אותו ב-ros 4% או בג'לטין אלבומין. לאחר מכן, בצע חיתוכים של המוח ב-vibrato.

איורים אלו מציגים את ההיפותלמוס לאחר טרנספקציית DNA של פלסמה, הנושאת גנים רפורטרים פלואורסצנטיים, GFP או CFP, ביום העברי E 12.5. זהו חיתוך סגיטלי המראה היפותלמוס שעבר טרנספקציה מהחלק הרוסטרלי אל הכודלי, וכאן מוצג החיתוך התמיכי עם התאים המסומנים במפלסים שונים לאורך הציר המדיאלי-לטרלי. חיתוך סגיטלי זה מראה גוף ממילרי שעבר טרנספקציה ספציפית וסימון של עץ האקסונים האופייני לו, ובצד האלקטרו-פרדי של חיתוך תמיכי זה נראה פס מסומן המתאים לנוירונים שנולדו ב-E 12.5.

כדי לנתח את החתכים מקרוב יותר, הוכנו חתכים אופקיים המקבילים למישור של תאי הגליאל הרדיאליים הבוקעים מה-mammillary recess. נוירונים של ה-ambi O שנולדו מנוירו-אפיתל שעבר טרנספקציה ביום E 12.5 זוהו ביום E 18.5 באמצעות נוגדנים נגד GFP.

בדוגמה זו, הנוגדן סימן קבוצה מוגבלת של תאי MBO. קבוצה זו הייתה ממוקמת בין שני אזורי MBO לא מסומנים, לטראלי ומדיאלי, המתאימים לנוירוני MBO שנולדו לפני ואחרי E 12.5, והצביעה המשותפת עם נוגדן נגד neston. בצבע אדום מוצג דפוס הנדידה של נוירונים שסומנו באופן פרטני על גבי תהליכים של גלייאל רדיאלי של הנוירואפיתל. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הזרקת ה-DNA לתוך החדר השלישי וכיצד למקם את המחט כאלקטרודה חיובית בין העובר, הראש והשליה כדי להגיע ביעילות להיפותלמוס. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה או היברידיזציה in situ כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לפנוטיפ של הנוירונים שעברו טרנספקציה.