מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס ברחם Electroporation

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר DNA פלזמה להיפותלמוס של עוברי עכברים המתפתחים ברחם על מנת להפעיל או לדכא את תפקודו של גן מעניין. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה של העכברה ההרה וחשיפת הרחם באמצעות לפרוטומיה. השלב השני הוא הזרקת תמיסת ה-DNA לחדר השלישי של המוח העוברי.

לאחר מכן, האלקטרודה החיובית ממוקמת בתוך הרחם בין השליה לראש העוברי. האלקטרודה השלילית מונחת על פני הרחם החיצוניים ומופעלים פולסים חשמליים. השלב האחרון הוא להסיר את המוחות העובריים שעברו טרנספטציה שישה ימים לאחר מכן.

בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת לניתוח השינויים הפנוטיפיים של התאים המועברים, מספר, צורה, מיקום, ביטוי סמן וכו'. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקציה ויראלית הם ראשית, היא אינה דורשת אמצעי זהירות מיוחדים, וכשני מתקנים, מיקוד שני של אזור ספציפי אפשרי. ושלישית, עם אלקטרופורציה של יוטה, סינון הגנים המועמדים מהיר יותר.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהזרקת תמיסת ה-DNA לחדר השלישי ומיקום נכון של אלקטרודת המחט דורשים הטיה ידנית מתקדמת יחד עם קצת ניסיון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום התפתחות ההיפותלמוס, במיוחד אלה הרלוונטיות לנדידת תאים, כמו גם כיצד אזורים בודדים וגרעין מוגדרים גנטית. התחל הליך זה על ידי משיכת כמה מיקרו פיפטות זכוכית באיכות טובה מכיוון שהן חיוניות להפחתת שיעור ההפלות הגבוה הראשוני עקב אובדן מי שפיר.

להכנת DNA ממיסים את ה- DNA הפלזמה נטול האנדוטוקסין המטוהר ב- PBS המכיל 0.1% ירוק מהיר לריכוז סופי של 1 עד 2 מיקרוגרם למיקרוליטר. הירוק המהיר יהפוך את התמיסה המוזרקת לגלויה בחדר המוח העוברי. לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר מתמיסת ה- DNA לתוך פיפטת המיקרו מזכוכית.

לאחר מכן חבר את המיקרו פיפטה מזכוכית למערכת ההזרקה או לפיפטה בפה. בשלב זה, הכינו את שולחן הניתוחים עם כרית חימום ומכשירי הניתוח הפעילו את מקורות האור הקר כדי להקל על הדמיית העוברים. לאחר מכן יש לחטא את כלי הניתוח באמצעות מעקר חרוזי זכוכית.

לאחר מכן, יש להרדים עכבר בהריון עם איזוף פלואור. לאחר הרדמת העכבר, יש למרוח משחה על עיניו כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן התאימו את המסכה על פניה כדי לשמור על הרדמה ברציפות.

כעת הניחו את העכבר על כרית חימום כשבטנו כלפי מעלה. אבטח את גופו במקומו על ידי קיבוע ארבעת גפיו עם סרט. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטת זנבו לריפלוקס.

לאחר מכן מגלחים את משטח הבטן ומחטאים אותו בתמיסת יוד. בצע חתך אורכי באורך של כסנטימטר עד סנטימטר וחצי על עור הבטן. לאחר מכן, חותכים את הצפק.

לאחר מכן, הניחו גזה כותנה סביב החתך. שוטפים את הגזה עם PBS. חשפו קרן רחם אחת על ידי משיכתה החוצה בזהירות בעזרת מלקחיים קהים.

הימנעי ממשיכת השריר או הרחם בחוזקה. מכיוון שלחץ גבוה בתוך הרחם יגדיל את הסיכוי לאובדן נוזלי עובר בעת ההזרקה וכתוצאה מכך הפלה. לאחר מכן הניחו את קרן הרחם על גזה שטופה PBS, ושטפו אותה עם PBS כל כמה דקות כדי לשמור עליה לחה.

כעת, תחת המיקרוסקופ, החזיקו את הרחם בצורה כזו שניתן יהיה לדמיין את חדרי המוח. אין למקם מחדש באופן נרחב את העובר שנמצא במצב שלילי. זה רק מגדיל את הסיכוי להפלה.

התבונן בראש העובר מלמעלה כדי לאתר את הפער שבו הסדק בין ההמיספרה השמאלית והימנית של קליפת המוח. קל להבחין בין חצאי הכדור, והחדרים הצדדיים שבתוכם בדרך כלל יכולים להיתפס כצורות כהות מעט יותר. אם נמצא עובר מכוון בצורה מושלמת להזרקת DNA, ניתן לנקב את דופן הרחם ולהיכנס לחדר השלישי בבת אחת.

החזיקו את המיקרו-פיפטה מזכוכית עם ה-DNA שהוכן קודם לכן ב-45 מעלות לדופן הרחם ונקבו אותה בקצה הרוסטרלי של הסדק הבין-המיספרי, תוך חדירה לעומק של כמילימטר אחד. באופן זה, קצה המיקרו פיפטה מזכוכית ייכנס לחדר השלישי של המוח ולא לחדר הרוחבי. לאחר הזרקת כמיקרוליטר אחד של תמיסת DNA לחדר השלישי, נוזל ירוק ימלא את החדר בזריקה טובה, חזור על אותו הליך עם כל העוברים מאותה קרן רחם.

זה יאפשר זמן מה לתמיסת ה-DNA להתערבב באופן שווה עם נוזל החדר ולהגיע לכל האפיתל העצבי. כעת הפעל את האלקטרו פרטר והתאם את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי. השתמש באלקטרודת מחט הנירוסטה כקוטב החיובי ובאלקטרודה השטוחה העגולה כקוטב השלילי, בחר את העוברים כשהצד הגבי כלפי מעלה לאלקטרופורציה.

לאחר מכן חודרים את דופן הרחם ליד ראש העובר בין שק מי השפיר לשליה על ידי דחיפת קצה אלקטרודת המחט כלפי מטה דרכו. לאחר מכן השתמש באצבע המורה של היד השנייה כבלוק דחף. כחמישה מילימטרים מקצה האלקטרודה צריכים להיות בין שק מי השפיר לדופן הרחם בערך בגובה המוח האמצעי.

מכיוון שזו האלקטרודה המכוונת, מיקומה יקבע איזה חלק של האפיתל הנוירולוגי ההיפותלמי הוא בעל הסיכוי הגבוה ביותר לעבור טרנספקט לאחר מכן, מקם את האלקטרודה השטוחה העגולה מחוץ לדופן הרחם בצד הנגדי של ראש העובר ביד השנייה. ואז סחטו בעדינות את העובר בין האלקטרודות.

השתמש במתג הדוושה כדי להפעיל כרךtage. לאחר מכן, משוך לאט את אלקטרודת המחט מהרחם תוך החזקת הרחם עם האצבע המורה של היד השנייה. אם מי השפיר הולכים לאיבוד דרך הדופן המנוקבת, בדרך כלל העובר יעבור הפלה.

לאחר ההזרקה והאלקטרופורציה של כל העוברים, הנח את הרחם בחזרה לבטן העכבר בזהירות רבה ומקם אותם בדיוק כפי שהיו קודם. ואז להרטיב את חלל הצפק במי מלח לפני סגירתו. תפרו את הצפק במעי חתול כירורגיים, ואז תפרו את העור בתפר עמיד יותר.

יש לחטא את פני הבטן בתמיסת יוד ולהזריק נוגד דלקת לא סטרואידים תת עורית לשיכוך כאבים. לאחר מכן, הוציאו את האם ממכונת ההרדמה והניחו אותה בכלוב המחומם על ידי כרית חימום. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה מההרדמה ובדוק אותו מדי יום כדי לוודא שהוא מתאושש מההליך ללא כל סימן לזיהום או כאב.

בשלב זה, קצרו את העוברים או לאחר הלידה בהתאם ליום הניתוח הרצוי. בחר את העוברים שהוזרקו להם DNA ואלקטרופוציה ונתח את המוחות תחת מיקרוסקופ סטריאו זה. לאחר מכן בדוק אם יש אות פלואורסצנטי ירוק באזור המתאים.

כדי לנתח את המוח של העובר הנבחר, תקן את הרקמה לזמן קצר ב -4% פרלדהיד. לאחר מכן, הטמיעו אותו ב-aros 4% או באלבומין ג'לטין. לאחר מכן חתכו את המוח על הוויברטו.

נתונים אלה מראים את ההיפותלמוס לאחר טרנספקציה ברחם של DNA פלזמה, הנושאת גנים מדווחים פלואורסצנטיים, GFP או CFP ב-E 12.5. זהו קטע סגיטלי המציג היפותלמוס שהועבר מרוסטרל לקודל, והנה הקטע הרוחבי עם התאים המסומנים ברמות שונות לאורך ציר המדיה הרוחבי. קטע סגיטלי זה מציג גוף יונק שעבר טרנספטציה ספציפית ותיוג של העץ האקסונלי האופייני לו, ובצד מצעד האלקטרו של קטע רוחבי זה מציג פס מסומן המתאים לנוירונים שנולדו ב-E 12.5.

כדי לנתח את הסעיפים מקרוב. הוכנו החתכים האופקיים המקבילים למישור תהליכי הגליה הרדיאליים הנובעים מהשקע היונק. נוירוני האמבי O שנולדו מאפיתל עצבי שהועבר ביום E 12.5 זוהו ביום E 18.5 באמצעות נוגדנים נגד GFP.

בדוגמה זו, הנוגדן תייג קבוצה מוגבלת של תאי MBO. קבוצה זו הייתה ממוקמת בין שני אזורי MBO רוחביים ומדיאליים לא מסומנים המתאימים לנוירוני MBO, שנולדו לפני ואחרי E 12.5, וצביעה משותפת עם נוגדן נגד נסטון. באדום מראה את מצב הנדידה של נוירונים מסומנים בנפרד על תהליכי גליה רדיאליים של הנוירו-אפיתל לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק את ה- DNA לחדר השלישי וכיצד למקם את המחט כאלקטרודה חיובית בין העובר, הראש והשליה על מנת למקד ביעילות את ההיפותלמוס. בצע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה או הכלאה אינידית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי הפנוטיפ של הנוירונים העוברים טרנספטציה.