Name: מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס ברחם Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: למד מניפולציה גנטית של ההיפותלמוס בעכבר באמצעות אלקטרופורציה ברחם. שיטה זו מאפשרת העברת DNA לתאי מוח עובריים ומיפוי פונקציית גנים בפיתוח עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמני (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

1. הכנה של ה-DNA וזכוכית Micropipettes להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipettes זכוכית באיכות טובה הם חיוני כדי להפחית את שיעור הפלות גבוה ראשוני עקב אובדן של מי שפיר. ההליך למשוך micropipettes הזכוכית תועד 13,18,25 היטב. השתמשו בקוטר 1.2 מ&quot;מ נימים משך בסאטר קונבנציונלי P-97 מכשיר עם ההגדרות P = 500; חום = 300; משוך = 40; מהירות = 50; זמן = 50. להתאים את חולץ עם 3 מ&quot;מ חוטים &quot;שוקת&quot; (סאטר Instrument FT330B). את 2 חוטי מ&quot;מ הגודל הניבו עבורנו תוצאות פחות משביעות רצון. מצד השני נראה, beveling של הטיפים micropipette לא כדי לשפר את התוצאות עבורנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים מטוהר ה-DNA, ללא רעלן פנימי פלסמיד ב PBS (כיתה תרבית תאים) המכילה 0.1% מהיר גרין לריכוז סופי של 1 עד 2 מיקרוגרם / μl. גרין המהיר יהפוך את הפתרון המוזרק לעין בחדר המוח העוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של פתרון ה-DNA לתוך micropipette הזכוכית. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את micropipette הזכוכית למערכת ההזרקה (פיקו משאבה) או פיפטה בפה. </li></ol> 2. הרדמה הכן את השולחן כירורגית עם כרית חימום ואת מכשירי הניתוח. הפעל את מקורות האור קר כדי להקל על ההדמיה של העוברים. לחטא את הכלים כירורגיים באמצעות למשל מעקר חרוז זכוכית. שלוש פרוצדורות הרדמה שונות אפשרית עבור פרוטוקול זה (ראה דיון). כאן אנו מתארים את אחד אנו רואים את הטוב ביותר, תוך שימוש בשאיפת isoflurane לזירוז הרדמה (קצב זרימה 0.5 ליטר / דקה), כמו גם התחזוקה (ליטר / דקה קצב זרימת 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את העכבר בהריון במכל קטן שקוף (כך העכבר נשאר גלוי) מחובר למכשיר ההרדמה Komesaroff מארק 5 באורך של צינורות קצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מכשיר האדים עם isoflurane, ואז לפתוח את בקבוק החמצן המצורף למכשיר. לפוצץ פולסים אחת או שניים של isoflurane / חמצן (0.5 ליטר / דקה) לתוך המכל מחזיק את העכבר ולצפות להרדמה להגדיר פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר, מכסה את עיניו עם משחה כדי למנוע מהם מהתייבשות ולהתאים את מסכת זרימת ההרדמה על ראשו באופן מיידי. </li></ol> 3. Laparotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכבר בטן על כרית החימום (אחרת טמפרטורת הגוף שלו תרד מהר מאוד, ומקטין את סיכויי החלמה) ולאבטח את הגוף שלו למקומו על ידי תיקון ארבע רגליו לצדדים עם קלטת. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקה לאובדן של תגובה לגירוי רפלקס (למשל הבוהן או קמצוץ זנב עם לחץ חזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את משטח הבטן ולחטא אותו עם iodophorpovidone יוד (Braunoderm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכי (עוד 1 עד 1.5 ס&quot;מ) בעור הבטן. ואז לחתוך את הצפק. הנח גזה כותנה סביב החתך. הפוך את קרן רחם אחת לעין ולמשוך אותו החוצה בזהירות עם מלקחיים בוטים על gauz PBS והשטףדואר. שטוף את הרחם עם PBS לעתים קרובות מאוד לשמור עליו תמיד הרטיב (איורים 2 א ו -2). במהלך ההליך כולו להימנע ממשייכת mesometrium או הרחם צר, שכן בתוך הרחם בלחץ גבוה ישדר לעובר להגדיל את הסיכויים של אובדן הנוזלים וכתוצאה מכך על זריקת הפלה. </li></ol> 4. הזרקת DNA לתוך חדר המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את הרחם בצורה כזו שהחדרים במוח יכולים להיות דמיינו. לא בהרחבה האם למקם את עובר שנמצאת בעמדה שלילית - זה מגדיל את הסיכוי של הפלה בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מסתכל על ראשו של העובר מלמעלה, בתרגום חזותי פער או הסדק בין שני חצאים קליפת המוח השמאליים וימניים. האונות הן קלה להבחין וחדרים לרוחב בתוכם (שלא להיות ממוקד) יכולים בדרך כלל להיתפס כצורות מעט כהות יותר. אם עובר נמצא להיות מכוון בצורה מושלמת להזרקת ה-DNA (Figures 2C ו 2D), זה אפשרי כדי לחדור את דופן הרחם ולהיכנס לחדר השלישי ובעונה אחת. החזק את micropipette הכוס ב 45 מעלות לקיר ולנקב אותו בסוף מקורי של הפער בין ההמיספרות בקליפת המוח הרחם, לחדור לכ 1 מ&quot;מ. בדרך זו קצה micropipette הזכוכית ייכנס לחדר השלישי של המוח (לא חדר לרוחב) (איורים 2 ג ו 2D). בעוברים פחות נוחה בכיוון זה שימושי הראשון פירס דופן הרחם (תמיד על 45 מעלות) בסביבתו של הראש העוברי, מקום קצה micropipette במיקום הנכון בין שני חצאים קליפת המוח, ורק לאחר מכן לנקב את המוח. הזרק על μl 1 של פתרון ה-DNA לתוך החדר השלישי (זריקה טובה ממלאת את החדר בנוזל ירוק). חזור על אותו התהליך עם כל העוברים של קרן רחם אחד. זה מאפשר קצת זמן לפתרון ה-DNA כדי לערבב באופן שווה עם נוזל חדרית ולהגיע entirneuroepithelium הדואר. </li></ol> 5. מיקוד היפותלמוס לElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור electroporator ובלהתאים את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי (לE12.5 אנו משתמשים 5 פולסים מרובעים גל, 50 V, 50 אלפיות השני ON/950 אלפיות OFF). השתמש כקוטב חיובי האלקטרודה מחט הנירוסטה (CUY550-10) וכקוטב שלילי האלקטרודה עגולה ושטוחה (CUY700P4L). (חשוב שהאלקטרודות הם קטנות יותר מאשר את העובר, שכן אחרת הנוכחי פשוט זורמת סביב העובר, אבל לא דרכו.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עבור electroporation אותם העוברים הגבי צד הוא למעלה (כלומר פנה הנסיין) (כמו רובם), ולמחוק את אלה שנטייה שלו היא לא חיובי. עכשיו זה בטוח לגעת ברחם עם אצבעות אתנול חיטוי או עם כפפות. מחזיק את הרחם עם מלקחיים, לעומת זאת, הייתי מפריע לזרימה של זרם במהלך electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס דופן הרחם על ידי ראשו של העובר בין א.מ.נ.השק iotic ושליה על ידי דחיפה כלפי מטה דרכו עם הקצה של האלקטרודה המחט. השתמש באצבע המורה של היד השנייה כמקשה דחף. בערך 5 מ&quot;מ של קצה האלקטרודה חייב להיות עכשיו בין השק מי השפיר ודופן הרחם, בערך ברמה של המוח התיכון (איורים 2E ו2F). זכור כי זה &quot;מיקוד אלקטרודה&quot;, כך עמדתו תהיה לקבוע איזה חלק מההיפותלמוס neuroepithelium הוא הסיכוי טוב ביותר להשיג transfected. העובר צריך להיות בעדינות רבה &quot;סחט&quot; בין האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מצד השני, עמדת האלקטרודה העגולה והשטוחה מחוץ לקיר הרחם בצד השני של ראשו של העובר (2E ו 2G דמויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג הדוושה כדי להחיל מתח (50 וולט, 50 אלפיות שנייה ON, 950 אלפיות השני OFF, 5 פולסים מרובעים גל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט למשוך את האלקטרודה המחט מחוץ לרחם תוך מתאפק הרחם עם אצבע המורה של היד השנייה - אם בדיקה מי שפירנוזל הטיק הולך לאיבוד דרך הקיר המנוקב, בדרך כלל את העובר יעבור הפלה. לחזור על התהליך עם כל העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את קרן הרחם לתוך הבטן ולחזור על ההזרקה וelectroporation בצופר השריד. </li></ol> 6. גמר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה וelectroporation של כל העוברים, הצב את הרחם בחזרה לתוך הבטן בזהירות רבה, ממוקם בדיוק כפי שהיו לפני ולח חלל הצפק עם מי מלח לפני שתסגרו אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הצפק עם מיתר כירורגית (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). לסגירתו של שימוש עור &quot;קטע את התפר&quot; methodwith תפר עמיד יותר (ניילון Supramid, 6-0, Serag Wiessner ל07171L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את משטח הבטן עם povidone-יוד (Braunoderm) ולהזריק ללא סטרואידים אנטי דלקתי תת עורי (לדוגמה: 100 μl של פתרון 1:10 Rimadyl ב0.9% NaCl) או, אפילו טוב יותר, כמו אופיואידים buprenorphine (Temgesic, 0.05-0.1 משקל גוף מ&quot;ג / ק&quot;ג ב0.9% NaCl) כדי להקל על כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האמא מהמכונה ההרדמה ולמקם אותו בכלוב אשר מחומם על ידי כרית חימום. לפקח על העכבר ללא הרף עד שהוא התאושש לגמרי מההרדמה. בשלב מאוחר יותר, לבדוק את החיות היומיות כדי להבטיח שהם מתאוששים מההליך ללא כל סימן לזיהום או כאב. </li></ol> 7. ניתוח התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את העוברים (או postnatals) לפי היום הרצוי של ניתוח. עכברים לאחר לידה (יום 1 עד 2 ישן) הם נהרגו על ידי עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד כל עובר על פי ביאור electroporation הקודם. מנתחים את המוח תחת stereomicroscope ולבדוק מתחת למיקרוסקופ לאות פלואורסצנטי ירוקה (GFP מהכתב) באזור המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח שנבחר יכול להיות מנותח &quot;טרי&quot;: לתקן הרקמות לזמן קצר בparaformaldehyde 4% ולהטביע ב% agarose 4 או בג&#39;לטיןlbumin, ולאחר מכן חלק על מכשיר vibratome סוג (איור 3). לניתוח מפורט יותר immunohistochemical (איור 4), cryo-להגן על המוח בפתרון saccharose 30%, להטביע בהרכבה בינונית אוקטובר (רקמות Tek) לאחר מכן לחתוך את 20 סעיפי מיקרומטר בcryostat. </li></ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li>
<li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236(2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li>
<li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+thalamic+differentiation%3A+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27(2012).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+Utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin%2Forexin+gene+by+NR6A1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanteras%2C+NS+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).</li>
<li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+trouble%3A+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li>
<li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li>
<li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li>
<li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li>
<li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus%3A+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4(2012).</li>
<li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammillary+bodies%3A+two+memory+systems+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li>
<li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li>
<li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).</li>
<li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לגבי ההרדמה: מאז electroporation ברחם ליפותלמוס יכול להיות מבחינה טכנית מפרך ודורש פעמים הרדמה ארוכות יותר, אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות ממשל מתערובת של חמצן וisoflurane. מניסיוננו, חיות יכולות להישאר כראוי מורדמות בדרך זו לתקופות של עד שעה אחת לפחות, ההתאוששות של האמא היא מאוד מהירה, והישרדות עובר השתפרה. גישות אחרות להרדמה הן גם זמינות. ההליך הפשוט ביותר מורכב מגרימה ושמירה על הרדמה על ידי זריקת intraperitoneal של 2.5 מ&quot;ל / ק&quot;ג ממשקל גוף של תערו...

מניפולציה גנטית של מוח העכבר העוברי היא גישה מועדפת כדי ללמוד על רגולציה התפתחותית. הדור של קווי עכבר מוטציה עם זאת הוא איטי ויקר. שיטה רב עוצמה אחד כדי להציג את השינויים גנטיים ספציפיים בפיתוח תאי עצב במוח היונקים היא electroporation ברחם. בעיקרו של דבר, הטכניקה מורכבת transfecting דנ&quot;א לתוך neuroepithelium המוח העוברי באמצעות פולסים חשמליים, ולאחר מכן מאפשר לעובר לשרוד לתקופה מסוימת של זמן, לאסוף את המוח ולבחון אותם לרומן אפשרי, פנוטיפים אינפורמטיבי. בדרך זו, הנסיין יכול לבחון השערות באופן כמעט מיידי ללא תקופות המתנה הארוכות הנדרשות לייצור מוטציות עכבר. Transfection של ה-DNA לעוברי מתפתחים התחיל עם ב electroporation אובו בעוברי 1 חומוס. הוכחה של הקונספט החיוני לעכבר בוצע בתרבות <sעד&gt; 2. זה היה זמן קצר אחריו את התיאורים הראשונים של הטכניקה על העכבר ברחם 3,4. הבעיה העיקרית היא transfect המוח של עוברים מתפתחים ברחם בלי להרוג אותם או האם. למידה כדי לבצע את הניתוח הדרוש (laparotomy, זריקה, electroporation) דורשת תקופת הכשרה ארוכה. לאחר הניתוח כבר שולט לנקודה שבה יחס הישרדות העובר מקובל, שאלת המפתח הבאה היא: שהמבנים מוחיים נגישים? באופן לא מפתיע, את המסמכים הראשונים שפורסמו מראים תוצאות שהושגו עם electroporation ברחם מתמקדים בהתפתחות קליפת המוח 5-9. זה עדיין נכון עבור רוב הפרסומים באמצעות טכניקה זו, שכן האזור במוח העכבר מתפתח הנגיש ביותר לפרוצדורות כירורגיות הוא קליפת המוח (איור 1). ההליך לelectroporation ברחם לתוך קליפת המוח תוארבדפוס 10 ובוידאו 11-14. שינוי של הטכניקה יכול לשמש יעד חלק הגחון של telencephalon, גרעיני בסיס 15. מעבר telencephalon, diencephalon (מחולק באופן קלאסי לתלמוס וההיפותלמוס) הוא אזור של המוח הקדמי יותר הקשה להגיע. מספר קטן של דיווחי ניירות מיקוד של חלק הגבי ונגיש ביותר שלו, התלמוס 16-19. ההיפותלמוס הוא חלק הגחון ביותר של המוח הקדמי, ולכן אחד מקומי בצורה העמוקה ביותר מהמשטח הגבי (קליפת המוח) (איור 1). אזור זה עדיין מהווה אתגר קשה לחוקרים שביצעו כדי לתפעל את מוח העכבר ברחם מבחינה גנטית. למיטב ידיעתנו, רק מעט מאוד מאמרים מדווחים על התוצאות בtransfection הרחם אל ההיפותלמוס עכבר 20,21. עם זאת, חשיבותו התפקודית של canno ההיפותלמוסלא להיות מוגזם, שכן הוא מסדיר התנהגויות כמו אכילה ושתייה, חיזור, רבייה והורות 22. יתר על כן, שינויים בפיתוח ההיפותלמוס לתרום למקורן מאוחר יותר בתנאי חיים כמו השמנה, יתר לחץ דם, סוכרת ומפותחת לגיל התבגרות 23. היכולת לשנות גנטי ההיפותלמוס במהלך הפיתוח הייתי לספק כלי חזק מאוד כדי להבין את זה. הפרוטוקול כירורגית הבסיסית לlaparotomy של עכברים הרה שאנו משתמשים כאן דומה לזה המשמש בפרוטוקולים אחרים 11,13,14,24. נתאר אותן כאן בקצרה לשלמות. מפתח להליך שלנו, לעומת זאת, הם הסוג של הרדמה, את מקומה של זריקה, הסוג של אלקטרודות והחדרה ומיקום של האלקטרודה החיובית ביחס לראשו של העובר. אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות שאיפת גז על פני הרדמה intraperitoneal פשוטה, שכן לשעבר מאפשריםתקופות ממושכות יותר של הרדמה נדרשות לניתוח קשה. תוצאות isoflurane משאיפת בהתאוששות מהירה יותר מהרדמה, שכן לרוב האם מדגים התנהגות נורמלית כבר דקות לאחר הניתוח. הנקודה הקלה ביותר של זריקה של פתרון ה-DNA עם micropipette הזכוכית היא החדר לרוחב, שעם זאת היא אינו מתאים לחלוטין ליפותלמוס electroporation. הזרקה ישירות בחדר השלישי היא אכן חיונית כדי למקד מבני diencephalic עמוקים. אפשר transfect ההיפותלמוס מE12.0 או E12.5 עם אלקטרודות סטנדרטיות, ה-off-מדף. מצאנו כמה אלקטרודות שיוצרו על ידי NEPA ג&#39;ין (צ&#39;יבה, יפן) המתאימים במיוחד למטרה זו. עם ההליך שלנו אנו מקבלים transfection של neuroepithelium ההיפותלמוס השלם או החלקית transfection האזורית, בהתאם לאורינטציה של האלקטרודה. כאן אנו מדגימים את הטכניקה על ידי transfecting הגוף הפיטמתיים, ללא ספקהעמוק ביותר והשקוע ביותר של כל גרעיני ההיפותלמוס. בנוסף, אנו מציגים ניתוח היסטולוגית מפורט של תאי transfected עד לרמה התאית של רזולוציה. ניתן למצוא השוואה של electroporation ברחם עם גישות אחרות לtransfecting המוח המתפתח העכבר ברחם בסעיף הדיון.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td></tr><tr><td>אצפרומזין</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>HDG9623</td> חומר <td>הרדמה</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>פארמה GmbH</td><td></td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>ירוק מהיר</td><td>פלוקה</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רימאדיל</td><td>פייזר</td><td></td><td>נוגד דלקת לא סטרואידים</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>בראון</td><td>3887138</td><td>פובידון-יוד</td></tr><tr><td>פוספט בופר מלח PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (בופרנורפין)</td> <td>Essex Pharma</td><td></td><td>משכך כאבים אופיואידים</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>באייר</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>מכשיר הרדמה Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חולץ נימי P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>פ-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>מכשיר מסוג VF-300</td><td>ויברטום</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אלקטרופורטור</td><td>Nepa Gene Co. בע"מ</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אלקטרודה 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>אלקטרודת מחט נירוסטה, קצה 10 מ"מ, 0. קוטר 5 מ"מ.</td></tr><tr><td>אלקטרודה 2</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>כיסוי צלחת פלטינה עגולה קוטר 4 מ"מ</td></tr><tr><td>מקור אור קר פיבראופטי</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 מ"מ OD x 0. 94 מ"מ תעודת זהות</td></tr><tr><td>מעקר חרוזי זכוכית</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מכשיר הזרקה</td><td>World Precision Instruments</td><td>משאבת פיקו פנאומטית PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תפר חוט מצופה Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>תפר פריטונאלי</td></tr><tr><td>תפר Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>תפר עור</td></tr></tbody></table>

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

שינוי גנטי של אזורים מסוימים במוח היונקים הפיתוח הוא גישה ניסויית חזקה מאוד. עם זאת, יצירת מוטציות עכבר רומן היא לעתים קרובות מתסכל איטית. הוכח כי הגישה למוח העכבר מתפתח ברחם בהישרדות לאחר ניתוח סביר אפשרית. ובכל זאת, עם תוצאות הליך זה כבר דיווח כמעט אך ורק לחלק השטחי ביותר ונגיש של המוח המתפתח, כלומר את קליפת המוח. התלמוס, אזור צר יותר ויותר המדיאלי, הוכיח קשה יותר ליעד. Transfection לגרעינים עמוקים יותר, במיוחד אלה של ההיפותלמוס, הוא אולי כבר דיווח על התוצאות המאתגרות ביותר, ולכן מעטים מאוד. כאן אנו מדגימים הליך למקד neuroepithelium ההיפותלמוס כולו או חלק ממנו (אזורי ההיפותלמוס) לtransfection באמצעות electroporation. המפתחות לגישה שלנו הם יותר הרדמת פעמים, הזרקה בtתוכי חדר, ואדיב ומיקום של האלקטרודות מתאימים. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של מיקוד והניתוח היסטולוגית הבא של גרעין ההיפותלמוס השקוע ביותר, הגוף הפיטמתיים.

רוב הנוירונים היפותלמוס נולדים בין E11.5 לE15.2, על פי ניתוח היכרויות לידה בעכברוש 26 מתורגמים לפיתוח עכבר 27,28 הקצר יותר במקצת. השיא של neurogenesis ההיפותלמוס הוא הגיע בE12.5 29-31. בהתאם לכך, בגיל transfection נבחר למחקר הנוכחי (E12.5), יכול להיות מתויג בחלק גדול של תאי עצב ההיפותלמוס בכל רמת rostro-הזנב נתון. ניתוח בE18.5 על סעיפי vibratome מסוג עבים (איורים 3 א</stro...

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס,<em&gt; ברחם</em&gt; מניפולציה גנטית של הפיתוח שלה כבר ניסה רק לעתים נדירות. אנחנו מראים נוהל מפורט ל<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ליפותלמוס העכבר ותוצאות נציג מופע של transfection (אזורי) ההיפותלמוס המוחלט והחלקית.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר (transfect) DNA פלסמי להיפוטלמוס של עוברים של עכברים המתפתחים ברחם, וזאת כדי להפעיל או לדכא את תפקודו של גן מטרת. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי הרדמת העכברה ההרה וחשיפת הרחם באמצעות לפרוטומיה. השלב השני הוא הזרקת תמיסת ה-DNA לתוך המערכה השלישית (third ventricle) של מוחו של העובר.בשלב הבא, ממוקמת האלקטרודה החיובית בתוך הרחם, בין השילייה לראש העובר. האלקטרודה השלילית מונחת על פני השטח החיצוניים של הרחם ומועברים פולסים חשמליים. השלב הסופי הוא הוצאת מוחות העוברים שעברו טרנספקציה לאחר שישה ימים.בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנתח את השינויים הפנוטיפיים של התאים שעברו טרנספקציה, כגון מספרם, צורתם, מיקומם, ביטוי סמנים וכדומה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספקציה ויראלית, הם ראשית, היא אינה דורשת אמצעי זהירות מיוחדים או מתקנים ייעודיים; שנית, ניתן לבצע תargeting לאזור ספציפי; ושלישית, באמצעות אלקטרופורציה, סריקת גנים מועמדים היא מהירה יותר.באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן הזרקת תמיסת ה-DNA לתוך החדר השלישי ומיקום נכון של אלקטרודת המחט דורשים מיומנות יד גבוהה וניסיון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום ההתפתחות ההיפותלמית, בייחוד שאלות הנוגעות לנדידת תאים, וכן לאופן שבו אזורים וגרעינים בודדים נקבעים גנטית. התחילו את הפרוצדורה במשיכה של מיקרו-פיפטות זכוכית באיכות גבוהה, שכן הן חיוניות לצמצום שיעור ההפלות הגבוה בתחילה כתוצאה מאובדן של נוזל מי שפיר.להכנת ה-DNA, המסס את ה-plasma DNA המנוקה והנקי מאנדוטוקסין ב-PBS המכיל 0.1% fast green עד לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד עד שניים למיקרוליטר. ה-fast green יהפוך את התמיסה המוזרקת לנראית בתוך פרוזדור המוח העוברי. לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר מתמיסת ה-DNA לתוך המיקרו-פיפט מזכוכית.לאחר מכן, חברו את המיקרו-פיפטית מזכוכית למערכת ההזרקה או לפיפטית פה. בשלב זה, הכינו את שולחן הניתוח עם פד חימום ואת כלי הניתוח. הפעילו את מקורות האור הקר כדי להקל על הדמיית העוברים. לאחר מכן, חטאו את כלי הניתוח באמצעות סטריליזטור חרוזי זכוכית.בשלב הבא, הרדימו עכברה בהריון באמצעות isof fluorine. לאחר הרדמת העכברה, מרחו משחה על עיניה כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, התאימו את המסכה על פניה כדי לשמור על הרדמה רציפה.כעת הניחו את העכבר על משטח חימום כאשר בטנו פונה כלפי מעלה. קבעו את גופו למקומו על ידי קיבוע ארבעת גפיו באמצעות סרט דביק. ודאו כי העכבר נמצא תחת הרדמה מלאה על ידי צביטה של זנבו לבדיקת רפלקס.לאחר מכן, גלחו את פני הבטן וחטאו אותה באמצעות תמיסת יוד. בצעו חתך אורכי באורך של כ-1 עד 1.5 סנטימטרים על עור הבטן. לאחר מכן, חתכו את הפריטוניאום.בשלב הבא, הניחו גזה מכותנה מסביב לחתך. שטפו את הגזה ב-PBS. חשפו קרן רחמית אחת על ידי משיכתה בזהירות בעזרת פינצטה קהה.הימנעו ממתיחה חזקה של המיומטריום או של הרחם. לחץ גבוה בתוך הרחם יגדיל את הסיכויים לאובדן נוזל העובר בעת ההזרקה, דבר שיוביל להפלה. לאחר מכן, הניחו את קרן הרחם על גזה שנשטפה ב-PBS, ושטפו אותה ב-PBS מדי כמה דקות כדי לשמור עליה לחה.כעת, תחת המיקרוסקופ, החזיקו את הרחם באופן שבו ניתן יהיה להדמיות של חדרי המוח. אין להזיז באופן נרחב עוברים שנמצאים במיקום לא נוח. פעולה זו רק מגבירה את הסיכוי להפלה.הביטו בראשו של העובר מלמעלה כדי לאתר את המרווח שבו נמצא החריץ שבין ההמיספרות הקליפליות השמאלית והימנית. ניתן להבחין בקלות בין ההמיספרות, ואת הפרוזטורים הלטרליים שבתוכן ניתן בדרך כלל לזהות כצורות כהות יותר. אם העובר נמצא במנח אידיאלי להזרקת DNA, ניתן לנקב את דופן הרחם ולהגיע ישירות לחדר השלישי.החזיקו את מיקרו-פיפטת הזכוכית עם ה-DNA שהוכן קודם לכן בזווית של 45 מעלות לדופן הרחם ונקבו אותה בקצה הרוסטרלי של החריץ הבין-המיספירלי (interhemispheric fissure), תוך חדירה לעומק של כמילימטר אחד. באופן זה, קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית יחדור לחדר השלישי של המוח ולא לחדר הצדי. לאחר מכן, הזריקו כמיקרוליטר אחד של תמיסת DNA לתוך החדר השלישי; בהזרקה מוצלחת, נוזל ירוק ימלא את החדר. חזרו על אותו הליך בכל העוברים באותה קרן רחם.פעולה זו תאפשר זמן למסלול ה-DNA להתערבב באופן אחיד עם הנוזל הוונטריקולרי ולהגיע לכל האפיתל העצבי. כעת הפעילו את האלקטרופורטור וכווננו את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי. השתמשו באלקטרודת מחט מפלדת אל-חלד כקטב חיובי ובאלקטרודה השטוחה והעגולה כקטב שלילי, ובחרו בעוברי שהצד הגבי שלהם פונה כלפי מעלה לצורך האלקטרופורציה.לאחר מכן, דקרו את דופן הרחם לצד ראשו של העובר, בין שק השריר (amniotic sac) לבין השלייה, על ידי דחיפת קצה מחט האלקטרודה כלפי מטה דרכה. השתמשו באצבע המורה של היד השנייה כנקודת התמסך לדחיפה. כ-5 mm מקצה האלקטרודה צריכים להימצא בין שק השריר לבין דופן הרחם, בערך בגובה המוח האמצעי.מכיוון שזוהי אלקטרודת המטרה, מיקומה יקבע איזה חלק של הנוירו-אפיתל ההיפותלמי סביר יותר שיעבור טרנספקציה. לאחר מכן, בעזרת היד השנייה, מקמו את האלקטרודה השטוחה והעגולה מחוץ לדופן הרחם, בצדו הנגדי של ראש העובר. לאחר מכן, לחצו בעדינות את העובר בין האלקטרודות.השתמש במפסק הרגל כדי להפעיל מתח. לאחר מכן, משוך לאט את אלקטרודת המחט מתוך הרחם תוך כדי החזקת הרחם בעזרת האצבע המורה של היד השנייה. אם נוזל מי שפיר דולף דרך הדופן הננקבת, העובר יעבור בדרך כלל הפלה.לאחר ההזרקה והאלקטרופורציה של כל העוברים, החזיר את הרחם לבטן העכברה בזהירות רבה ומקם אותם בדיוק כפי שהיו קודם לכן. לאחר מכן, הרטב את חלל הפריטונאום בתמיסת סלין לפני סגירתו. תפר את הפריטונאום בחוט כירורגי מסוג cat gut, ולאחר מכן תפר את העור בחוט תפר עמיד יותר.חטאו את פני הבטן באמצעות תמיסת יוד והזריקו תרופה נוגדת דלקת שאינה סטרואידית תת-עורית להקלה על הכאב. לאחר מכן, הוציאו את האם ממכשיר ההרדמה והניחו אותה בכלוב, המחומם באמצעות פד חימום. עקבו אחר העכבר עד להתאוששות מלאה מההרדמה ובדקו אותה מדי יום כדי לוודא כי היא מחלימה מההליך ללא כל סימן לזיהום או לכאב.בשלב זה, קצרו את העוברים או את הדגימות לאחר הלידה בהתאם ליום הניתוח הרצוי. בחרו את העוברים שהוזרק להם DNA ועברו אלקטרופורציה, ובצעו דיסקציה של המוחות תחת מיקרוסקופ סטריאו זה. לאחר מכן, בדקו את נוכחות אות פלואורסצנציה ירוק באזור המתאים.כדי לנתח את מוחו של העובר שנבחר, קבע את הרקמה למשך זמן קצר ב-4% paraldehyde. לאחר מכן, הטמע אותו ב-ros 4% או בג'לטין אלבומין. לאחר מכן, בצע חיתוכים של המוח ב-vibrato.איורים אלו מציגים את ההיפותלמוס לאחר טרנספקציית DNA של פלסמה, הנושאת גנים רפורטרים פלואורסצנטיים, GFP או CFP, ביום העברי E 12.5. זהו חיתוך סגיטלי המראה היפותלמוס שעבר טרנספקציה מהחלק הרוסטרלי אל הכודלי, וכאן מוצג החיתוך התמיכי עם התאים המסומנים במפלסים שונים לאורך הציר המדיאלי-לטרלי. חיתוך סגיטלי זה מראה גוף ממילרי שעבר טרנספקציה ספציפית וסימון של עץ האקסונים האופייני לו, ובצד האלקטרו-פרדי של חיתוך תמיכי זה נראה פס מסומן המתאים לנוירונים שנולדו ב-E 12.5.כדי לנתח את החתכים מקרוב יותר, הוכנו חתכים אופקיים המקבילים למישור של תאי הגליאל הרדיאליים הבוקעים מה-mammillary recess. נוירונים של ה-ambi O שנולדו מנוירו-אפיתל שעבר טרנספקציה ביום E 12.5 זוהו ביום E 18.5 באמצעות נוגדנים נגד GFP.בדוגמה זו, הנוגדן סימן קבוצה מוגבלת של תאי MBO. קבוצה זו הייתה ממוקמת בין שני אזורי MBO לא מסומנים, לטראלי ומדיאלי, המתאימים לנוירוני MBO שנולדו לפני ואחרי E 12.5, והצביעה המשותפת עם נוגדן נגד neston. בצבע אדום מוצג דפוס הנדידה של נוירונים שסומנו באופן פרטני על גבי תהליכים של גלייאל רדיאלי של הנוירואפיתל. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הזרקת ה-DNA לתוך החדר השלישי וכיצד למקם את המחט כאלקטרודה חיובית בין העובר, הראש והשליה כדי להגיע ביעילות להיפותלמוס. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה או היברידיזציה in situ כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לפנוטיפ של הנוירונים שעברו טרנספקציה.

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

כאן אנו מציגים פרוטוקול המספק כלי לבחינת מנגנוני ויסות של גנים ספציפיים במהלך התפתחות ההיפוקמפוס. שימוש באלקטרופורציה מחוץ לרחם ותרבית פרוסות אורגנוטיפית מאפשר ויסות למעלה ולמטה של ביטוי הגנים המעניינים בתאים בודדים ולעקוב אחר גורלם במהלך ההתפתחות.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

התפקיד של גנים הקשורים למחלות שהתגלו לאחרונה בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות נשאר מעורפל. דו-צדדי שונה בטכניקת אלקטרופורציה ברחם מאפשר העברת גנים באוכלוסיות גדולות של נוירונים ובחינת ההשפעות הסיבתיות של שינויים בביטוי גנים על ההתנהגות החברתית.

צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

למד מניפולציה גנטית של ההיפותלמוס בעכבר באמצעות אלקטרופורציה ברחם. שיטה זו מאפשרת העברת DNA לתאי מוח עובריים ומיפוי פונקציית גנים בפיתוח עצבי.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס

גלה סרטונים נוספים