מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להזריק במיקרו-מינון מורפו-אוליגונוקלאוטידים לתוך הפרוזדור המוחי של מוח דג זברה בוגר, וביצוע knockdown לפעילות של גנים בתאי רדיוגליה. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמת דג הזברה. לאחר מכן, נפתח חריץ בגולגולת, מעל ה-optic tectum, באמצעות מחט דנטלית עם חריצים (barbed needle).

לאחר מכן, מזריקים את תמיסת ה-morpho דרך אתר החתך אל תוך הנוזל הצברייברובנטריקולרי. לבסוף, בודקים את יעילות ודיוק ההזרקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות של חסמה יעילה ונרחבת של ייצור חלבונים מהגנים הרלוונטיים בתאי הגליה הרדיאליים במוחו של דג הזברה הבוגר באמצעות knockdown גנטי המתווך על ידי morpho, דבר שניתן לבחון באמצעות חתכים היסטולוגיים וצביעות אימונוהיסטוכימיות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גישות טרנסגניות או שיטות הובלה מבוססות אלקטרופורציה, הוא ש-CVMI דורשת פחות זמן ויעילה יותר בסימון של כל אוכלוסיית תאי הרדיוגליה. ניתן להשתיק מספר גנים הניתנים להתאמה בו-זמנית. כדי להכין את תערובת ההזרקה, התחילו בהכנת תמיסת סטוק של Morpho בריכוז 500 Micromolar.

לביצוע 10 הזרקות, הכין 10 µL של תערובת הזרקה על ידי ערבוב של 9 µL של תמיסת morpho מדוללת או לא מדוללת עם 1 µL של צבע מעקב פלואורסצנטי ב-PBS. אחסן את התערובת בטמפרטורת החדר. השתמש במכשיר למשיכת מחטים כדי להכין קפילרות הזרקה מזכוכית בהתאם לפרמטרים הבאים.

הפעל את מקור הלחץ וכוון את הגדרות הלחץ ל-50 PSI או 3.5 bars. כוון את הגדרות המיקרו-מזרק באופן הבא: לחץ החזקה (Hold pressure) ל-20 PSI, לחץ פליטה (eject pressure) ל-10 PSI, וערך תקופה (period value) של 2.5 ו-100 milliseconds.

טווח השערה (gating). הדלק את תאורת הטבעת ומקם את הטבעת מעל שולחן המיקרוסקופ. הנח את מחזיק הנימיים במיקום מתאים לצד המיקרוסקופ.

הכנס את הנימי הזכוכית למחזיק וכוון את זווית ההזרקה ל-45 מעלות. בעזרת פינצטה עדינה, שבור את קצה הנימי הזכוכית וכייל את פלט הלחץ מהפתח. על ידי טבילת קצה המחט במי הדגים והפעלת פולס לחץ רציף, בועות האוויר צריכות להיווצר בשורה אחת, דבר המעיד על לחץ או גודל פתח אופטימליים.

מלאו את הנימיות מזכוכית בתמיסת ההזרקה. תוך הימנעות מבועות אוויר, הפילו לחץ כדי להוציא את האוויר שבין קצה הנימית לבין תמיסת ההזרקה שהומלאה. לאחר הכנת תמיסת מלאי (stock solution) בריכוז 0.1% של חומר ההרדמה meab, העבירו את מספר הדגים הרצוי למכל הובלה עם מי דגים.

הכינו תמיסת עבודה של חומר הרדמה על ידי ערבוב של 200 milliliters של מי דגים עם חמישה milliliters של תמיסת סטוק של MISP. מלאו את מחציתה של צלחת פטרי בחומר ההרדמה לשימוש עבור הזרקות. הדגירו דג בחומר ההרדמה עד שיפסיק לזוז.

לאחר מכן, השתמשו ברשת כדי להעביר אותו לצלחמת פטרי עם חומר הרדמה. כדי להקל על החיתוך, השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את הדג בעדינות והכווינו אותו כך שראשו יהיה נטוי מעט כלפי מטה. באמצעות קצה של מחט בעלת חריצים (barbed) במידה 30 gauge, בצעו חריץ קטן בגולגולת מבלי לחדור עמוק מדי, שכן הדבר יגרום לנזק לרקמת המוח.

בעודכם ממשיכים להחזיק את הדג, הכניסו את קצה הקפילרה מזכוכית דרך אתר החתך לעומק של כחצי מילימטר, והכווינו אותה לעבר ה-cephalon תוך הימנעות ממגע עם רקמת המוח. הזריקו את התמיסה, שהיא אמורה להתפזר באופן מיידי. העבירו את הדג למים טריים והניחו לו להתאושש.

כ-30 דקות מאוחר יותר, הרדמו שוב את הדג ובחנו אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לחפש התפשטות רחבה של הנוזל, בהתבסס על פלואורסצנציה אדומה. החזירו את הדג לאקווריום שלו והשיבו אותו למחזור.

עד לשימוש בניתוחים התנהגותיים או להכנת דגימות רקמה כפי שמוצג כאן, הזרקה מדויקת מובילה להתפשטות של התמיסה המוזרקת ברחבי המוח ולמיקוד יעיל של התאים הסמוכים למשטח הפטריקולרי. עם זאת, בהזרקות שבהן הקפילרית מזכוכית חודרת לרקמה, ייראה אות פלואורסצנטי צפוף בנקודת ההזרקה. ואם הכמות המוזרקת אינה מספיקה, ייראה אות פלואורסצנטי חלש.

איור זה מדגים כי vivo morphos יכולים לחדור מספר קטרי תאים לתוך פני השטח של הפרונטריקולר (ventricular surface), ולפיכך יכולים למקד ביעילות את התאים הפרונטריקולריים בהשוואה ל-control.Morpho. הזרקה של morpho נגד PCNA מורידה ביעילות את ביטוי הגן בתאים פרונטריקולריים. בתמונות אימונופלואורסצנטיות אלו, צביעה אימונולוגית של BRDU ו-QCD לאחר ניסוי A-B-R-D-U pulse chase מדגימה כי השתקה (knockdown) של PCNA באמצעות antisense morphoses מובילה להפחתה משמעותית במספר הנוירונים החדשים, מה שמרמז כי ניתן להשתמש ב-CVMI כדי להשתיק גנים אנדוגניים, דבר המוביל להשלכות תפקודיות.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתגובת הנוירוגנזה הרגנרטיבית של מוח דג ה-S הבוגר.