Name: Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה כפולה ברקמות עצבים מרכזיים ולימפה פריפריה בעכברוש. השיטה מאפשרת הדמיית מיקום חלבונים במיקרוסקופ אור ומסייעת לחוקרים בתחומי הנוירומדע והאימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים להנס לאסמן ויאן באואר על ההדרכה והתמיכה. אנו מודים גם לקטלין בנדק על הסיוע הטכני המצוין ולקרוליין ווסטרלונד על ההערכה הביקורתית והלשונית.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ-Biogen Idec, קרן ונר-גרן, מועצת המחקר השוודית, האגודה השוודית לאנשים עם מוגבלויות נוירולוגיות, קרן המוח השוודית, המסגרת השישית של האיחוד האירופי EURATools (LSHG-CT-2005-019015) ו-Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הצהרה אתית מחקר נוכחי מתבצע על פי הנחיות מן המועצה הארצית השבדית עבור בחיות מעבדה ואת הנחיית מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) תחת ההיתרים האתיים N338 / 09, N15 / 10 ו N65 / 10, אשר אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים בצפון שטוקהולם. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף &amp; קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה עם isoflurane לבצע זלוף transcardial דרך החדר השמאלי. ליזום את השטיפה של כלי דם עם בופר פוספט (PBS) כדי להסיר את רכיבי דם, ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (PFA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע מוחות גזור, מיתרי השדרה ורקמות LN היקפי ידי טבילה לתוך PFA. לאחר 24 שעות ב 4 ° C, להעביר את הרקמה מן PFA לתוך PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. לחלופין כדי PBS מסחרי, לפזר 9 גרם NaCl ב 250 מ&quot;ל ה- S &amp;# 246; rensen חיץ להוסיף 750 מ&quot;ל מים deionized (DH 2 O); להכין חיץ M סורנסן 0.2 (pH 7.4) לפזר 13.8 גרם לאא 2 PO 4 x 1H 2 O ו 71.2 גרם Na 2 HPO 4 x 2H 2 O ב 2.5 L DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות &amp; הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמה לתוך כ חלקים 5 מ&quot;מ עובי באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום תהליך התקשות רקמות (התייבשות) באמצעות מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek (הליך סטנדרטי מבוסס על השקיעה לתוך ריכוזי עולה של אתנול, ואחריו פרפין קסילן ולבסוף (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה בתוך תבנית ושופך את פרפין הנוזלי סביב המדגם כדי ליצור &quot;בלוק פרפין&quot;. אחסון לטווח ארוך דורש בטמפרטורת החדר (RT). עם זאת, לפני חתך, היא מומלצת להתקרר אבני, למשל, לילה (o / n) בשעה 4 מעלות צלזיוס.</li></ol></li></ol> 2. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש פרפין לתוך מחזיק קבוע המזחלת microtome, אשר יכול לנוע קדימה ואחורה על פני הסכין. התאם את הזווית האופטימלית בין הגוש וסכין microtome (זה תלוי בגיאומטרית סכין, אלא גם על מהירות החיתוך וטכניקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 3 - 5 מיקרומטר עבה בחיתוכים מהגוש פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר רק סעיף לחתוך לתוך מיכל מים ולעגן אותה ובהמשך מהמים לשקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הסעיף הרכוב בזהירות נגד מגבת נייר כדי להסיר שאריות מים ובועות אוויר פוטנציאליות. מסחרי מראש צופה שקופיות זכוכית דבקות הם מומלצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי רכוב שקופיות במשך כמה שעות בתנור על 50 - 60 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. Deparaffinization (Rehydration &amp; חסימת אנדוגני Peroxidase) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות 2x לתוך קסילן (תחליף קסילן לחילופיןXEM-200), בכל פעם 15 - 20 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באתנול 99%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום את פעילות peroxidase אנדוגני, דגירת הסעיפים 30 &#39;בתמיסת מתנול המכילה מי חמצן 0.25% מימן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך התייבשות באמצעות אתנול עם הגדלת תכולת מים (99%, 70%, ובסופו של דבר במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו עד ההרכבה של תלושים לכסות חלקים צריכים להישמר לחה. </li></ol> 4. אחזור Antigen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש ספינת מזון להרתחת השקופיות פתרון אחזור אנטיגן (במקרה זה EDTA pH 8.5 חיץ) עבור 60 &#39;(פתרון למלאי EDTA מכיל 1.21 גרם טריס ו EDTA 0.37 גרם מומס ב 50 מ&quot;ל DH 2 O; להכין את העבודה פתרון לדלל פתרון 2.5mL EDTA המניות 47.5 מ&quot;ל dH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנן את השקופיות על RT עבור כ. hr 1 ולאחר מכן לשטוף 3 - 5x עם טריס שנאגרו מלוחים (TBS, השתמש לחילופין PBS) המורכב 0.05 מ &#39;טריס ו 0.15 M NaCl; wi pH 7.5 מותאםה HCl. לחלופין להשתמש TBS מסחרי. </li></ol> 5. חסימת אתרי הקישור הנוקבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע תגובות רקע נוקבות, דגירת מדורי RT במשך 30 &#39;בפתרון החסימה המכיל סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -90% חיץ DAKO. </li></ol> 6. זוגי immunolabeling: דגירה סימולטני עם Abs הראשי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים בפתרון חסימת דגירה o / n ב 4 מעלות צלזיוס. עבור immunostaining כפול לשלב α-eotaxin (Ccl11; 1: 300) עם α-Cd68 (ED1; 1: 1,000) או α-Iba1 (Aif1, 1: 1,000) או α-Cd8α (שור-8; 1: 200) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות 3-5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כמות הנדרשת של נוגדנים משני (אנטי-עז biotinylated ו AP מצומדות ועכבר אנטי, הוא 1: 200) בתמיסת חסימת דגירת 1 hr על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (לנודואר לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עם מורכבות peroxidase-חזרת avidin (HRP) מדולל הפתרון חוסם עבור שעה 1 על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x חיץ בדילול DAKO). </li></ol> ויזואליזציה 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה של נוגדנים משני AP שכותרתו כבול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 M Tris-HCl חיץ ידי המסת טריס 12.1 גרם 1 L DH 2 O ו להתאים את pH באמצעות HCl. השתמש חיץ טריס-HCl אותו להכין 1 M פתרון levamisole. כן טרי 4% פתרון Nano 2 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל 50 מ&quot;ל של המצע כחול (FB) מהיר (נפח נדרש אחד קובט זכוכית רגילה) לפזר 6.25 מ&quot;ג Naphtol-AS-MX-פוספט ב 312.5 μl DMF בצינור זכוכית ומערבבים לתוך 50 מ&quot;ל של טרום התחמם (37 מעלות צלזיוס) חיץ טריס-HCl. כדי לפזר 12.5 מ&quot;ג FB RR מלח 312.5 μl 2 N HCl להוסיף 312.5 μl של בעבר prepaאדום 4% פתרון Nano 2 ומערבבים את התערובת לתוך אותו 50 מ&quot;ל של חיץ מראש חימם Tris-HCl. לנער קל עד שהנוזלים הצהובים מתבהרים ולבסוף להוסיף 77 μl של פתרון בעבר הכין 1 M Levamisole. תסנין המתקבל תערובת ויוצקים על גבי שקופיות להציב קובט זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את הדגירה על 37 מעלות צלזיוס ולשלוט בפיתוח תהליך תחת מיקרוסקופ אור כ. כל 15 - 30 דקות. אם פונה מטושטש, להחליף את פתרון FB בתערובת טרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ ולהעביר לאחר מכן למאגר PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה של נוגדנים משני biotinylated כבול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DAB / H 2 O 2 לפתח פתרון על ידי דילול 1 מ&quot;ל פתרון המניות DAB (25 מ&quot;ג DAB לכל 1 מ&quot;ל PBS) ב 49 מ&quot;ל PBS. להוסיף 16.5 μl H 2 O 2 ו תסנין לפני לשפוך על הסעיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה של DAB אַב צֶבַע לתוך המצח מזרזפיגמנט n יכול להיות מיידי. לשלוט בתהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ האור (אפילו כמה דגירה כבר שנייה עשויים להעלות רקע גבוה ומסווה את האות המסוימת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת המשקע פיגמנט חום ניתן לשפר לחילופין על ידי הדגרה הפתרון המורכב בגפרת-נחושת 2% ו -0.9% NaCl עבור 5 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם PBS ולבסוף עם DH 2 O, להשתמש לחילופין מי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות עם תלושי לכסות ישירות מהמים באמצעות הרכבה בינונית GelTol מימית. הימנע מיצירת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ייבוש מלא של הרכבה בינונית, למשל, o / n ב 4 ° C.. חנות יבשה שקופיות על RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % אתנול </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % אתנול </td><td> 60 &amp;# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % אתנול </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % אתנול </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % אתנול </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % אתנול </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % אתנול </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % אתנול </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Xylol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Xylol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> פָּרָפִין </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> פָּרָפִין </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> פָּרָפִין </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> פָּרָפִין </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> עיבוד רקמות בטבלה 1. על ידי מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek.

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Mason, D. Y., Sammons, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+peroxidase%3A+anti-peroxidase+complexes+for+immunocytochemical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use.</a> Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).</li>
<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).</li>
<li>Polak, J. M., Van Noorden, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolak%2C+JM+%22Introduction+to+immunocytochemistry%22">Introduction to immunocytochemistry</a>. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).</li>
<li>Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+detection+efficiency+of+the+peroxidase+antiperoxidase+%28PAP%29%2C+avidin-biotin+peroxidase+complex+%28ABC%29%2C+and+peroxidase-labeled+avidin-biotin+%28LAB%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods.</a> American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Ccl11+associates+with+immune+response+modulation+and+protection+against+neuroinflammation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats.</a> PloS one. 7, 39794(2012).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+in+PLP-overexpressing+transgenic+rats%3A+gray+matter+oligodendrocytes+are+more+vulnerable+than+white+matter+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuropathology+and+experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes.</a> Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).</li>
<li>Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+contribution+of+CD4+and+CD8+T+lymphocytes+to+T-cell+infiltration+of+the+intact+and+the+degenerative+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord.</a> The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).</li>
<li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+populations+of+microglia%2Fmacrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microglia+in+living+tissues+using+Iba1-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.</a> Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).</li>
<li>Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+adhesion+mediated+by+CD8+and+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.</a> Nature. 336, 79-81 (1988).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+formaldehyde+fixation+irreversibly+reduces+immunoreactivity+of+Bcl-2+in+the+nuclear+compartment+of+breast+cancer+cells%2C+but+not+in+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry+and+antigen+retrieval+methods+for+light+and+electron+microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy</a>. , Kluwer Academic. New York. (2002).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+and+heat-retrieved+tissue+antigens%3A+a+comparison+of+their+immunoreactivity+in+experimental+antibody+diluents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).</li>
<li>Huang, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+demonstration+of+hepatitis+B+core+and+surface+antigens+in+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).</li>
<li>Taylor, C. R., Shi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval%3A+call+for+a+return+to+first+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval: call for a return to first principles.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).</li>
<li>Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formic+acid+pretreatment+enhances+immunostaining+of+cerebral+and+systemic+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).</li>
<li>Nelson, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pathology+%3A+MP%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies.</a> Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).</li>
<li>Van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+der+Loos%2C+C+%22Immunoenzyme+multiple+staining+methods%22">Immunoenzyme multiple staining methods</a>. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).</li>
<li>Elias, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElias%2C+J+%22Immunohistopathology.+A+practical+approach+to+diagnosis%22">Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis</a>. , ASCP Press. Chicago. (2003).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Cleavage+of+heme+from+horseradish+peroxidase+by+methanol+with+inhibition+of+enzymic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).</li>
<li>Streefkerk, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+erythrocyte+pseudoperoxidase+activity+by+treatment+with+hydrogen+peroxide+following+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

<html> נהלי IHC רגילים לעתים קרובות דורשים התאמות ספציפיות כדי להשיג תוצאה אופטימלית, מה שמרמז ניסיון רב נפוץ אבל גם &quot;ניסוי וטעייה&quot; גישה. מ הכנת רקמה עד להדמית היעד, כמעט כל צעד בפרוטוקול עלול להיות כפוף להם כדי המעוצבים באופן אינדיבידואלי שינויים על מנת לשפר את התוצאה הסופית. פרוטוקול מכתים זוגי המוצג כאן מדגים חלבון מבוסס IHC מיקוד מותאם במיוחד להערכת גומלין בין חלבוני היעד של העניין שלנו קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי רקמות CNS ו LN מושפעים neuroinflammation. כ...

למרות ניצול של תפוקה גבוהה מתקדמת וניתוחים שבוצעו על methylome, transcriptome או אפילו ברמה proteome, immunostaining נותר תקן הזהב לגילוי חלבון ישירות במדגם רקמות, תרבית תאים או למרוח התא. מדגים את דפוס לוקליזציה / הפצה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) עשויה להעריך יחסי יחסי גומלין הטופוגרפי של חלבוני היעד, ואף מצביעה פעילויות הביולוגיות שלהם. לכן, IHC מנוצל נרחב למטרות קליניות ומחקר, למשל, לאבחון, טיפול הערכות, חקר מנגנוני מחלה, שינויים פונקציונליים phenotypical במודלים של בעלי חיים, וכו &#39; שעיקרן היסטולוגיה, פתולוגיה, ביוכימיה ואימונולוגיה, IHC התקדמה באופן משמעותי מאז שנת 1941, כאשר fluorescently שכותרתו נוגדנים שימשו בפעם הראשונה לזהות אנטיגנים דלקת ריאות בתוך הרקמה הנגוע 1. Visualization של מוצרים ורכיבים הסלולר על ידי IHC מבוסס על הכריכה של נוגדנים (ABS) כדי אנטיגן הספציפי שלהם (Ag). חוץ מזה באמצעות נוגדנים מתויג fluorophore, תגובות חיסוניות יכול גם להיות דמיינו באמצעות אנזימים כמו phosphatase peroxidase 2,3 או אלקליין 4. יתר על כן, נוגדנים זהב-tagged קולואידים 5 משמשים לאיתור אינטראקציה אנטיגן-נוגדן ספציפי על ידי שני אור במיקרוסקופ אלקטרונים, בעוד תוויות רדיואקטיביים הם דמיינו ידי autoradiography. Immunoreaction Ag-Ab ניתן לאתר באמצעות שיטות ישירות ועקיפות. השיטה הישירה היא למעשה לקל ולפשוט יותר, כפי שהיא עושה שימוש שכותרתו ישירות העיקרי Abs 6. עם זאת, בשל חוסר משמעותי של רגישות, שיטות עקיפות הם העדיפו את אלה הישירים. שני שלבי נהלי זיהוי עקיפים דורשים ללא תווית Abs העיקרי, כמו הראשון, ומסומן Abs משני המכוון נגד Abs העיקרי, כמו השכבה השנייה 7.הגברה האות יכולה להיות מושגת על ידי מעורבים נוספים, Ab שלישוני מצמידים אנזים (השיטה העקיפה שלושה שלבים) הנקשרת Ab משנית. בדרך כלל שיטות זיהוי עקיף בהם נעשה שימוש הם ביוטין avidin ו peroxidase-antiperoxidase (PAP). לחלופין, phosphatase phosphatase-antialkaline אלקליין (APAAP) מורכב יכול לשמש במקום שיטת PAP. יש לציין, phosphatase אלקליין (AP) שיטות להיראות אפילו יותר רגיש מאשר שיטות אימונו-4. שיטת avidin ביוטין המורכבת (ABC) משתמשת Ab משני biotinylated בשילוב עם-avidin ביוטין המסווג המורכב (LAB), או שכותרתו ביוטין-streptavidin מורכב (לוח). רגישות זיהוי ניתן להגדיל עוד יותר על ידי מעורבים avidin שכותרתו עם phosphatase peroxidase או אלקליין 8. שיטות זיהוי אחרות לשימוש הן תיוג פולימריים, הגברת טירמין ו חיסוני מתגלגל מעגל 9. יש לציין, שיטות זיהוי שונות ניתן לשלב לגילוי Ag מרובה באותו הרקמותמדגם, אשר דווח לראשונה בשנת 1978 4. immunostaining הכפול סימולטני המוצג כאן בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין CNS ו LN סעיפי רקמות באמצעות נוגדנים משני peroxidase הנכנס ו AP מצומדות, בהתאמה. האותות היו דמיינו באמצעות 3,3&#39;-diaminobencidine (DAB) אַב צֶבַע ואת הכחול המהיר (FB) APAAP מורכבת, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנט</חזק></td></tr><tr><td>איזופלורן (איזופלורן): 1-כלור-2,2,2-טריפלואוראתיל (אתר דיפלואורמתיל) 2-כלור-2-(דיפלואורמתוקסי)-1,1,1-טריפלואורתן (C<תת>3</תת>H<תת>2</תת>ClF<תת>5</תת>O)</td><td>בקסטר</td><td>1001936060</td><td>הקרנת עיניים. כנראה משפיע על הפוריות ופוגע בתינוק ברחם. יש לתת רק בסביבת הרדמה מאובזרת כראוי.</td></tr><tr><td>סודיום כלוריד (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>פוספט בופר מלח (PBS), טבליה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% ב-1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>סכנה בריאותית. מאכל. דליק. רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>אתנול &#8805; 99.5%, מוחלט (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>דליק.</td></tr><tr><td>קסילן (קסילנים, דרגה היסטולוגית; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Flamable. רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>Histo-Comp שעוות פרפין</td><td>רקמה-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ דבק</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>תחליף קסילול XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>רגישות נשימתית. מסרטן.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-eotaxin C-19 (CCL11) נגד חולדות עזים, נוגדן ראשוני</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד פוספטאז אלקליין (AP)</td><td>Dakopatts, דנמרק</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני ביוטינילציה</td><td>אמרשם ביוטק</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>אבידין- קומפלקס פרוקסידאז חזרת (HRP) </td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>נפתול AS-MX פוספט (C19H18NO5P)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N4875-1G</td><td>רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>מלח RR כחול מהיר, אזואיקון דיאזו מס' 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen)</td> <td>DAKO</td><td>S3000</td><td>דליק מאוד. רעיל.</td></tr><tr><td>נחושת גופרתית (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>רעילות חריפה. ערפול סביבתי.</td></tr><tr><td>GelTol הרכבה מימית בינונית</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן, 30% (H2O2)</td> <td>Merck</td><td>107210</td><td>רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>מתנול (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>רעילות חריפה. רגישות נשימתית. מסרטן. דליק.</td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, בסיס TRIS (C<תת>4</תת>H<תת>11NO3)</td> <td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>גירוי בעור ובעיניים.</td></tr><tr><td>Tris Buffered Sabe (TBS), טבליה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>די-סודיום מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO4 x 2H2O)</td> <td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט מונוהידרט (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO מאגר שטיפת ציטומציה 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C לעיכוב צמיחת חיידקים. הימנע מקצף.</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>דליק. רעילות חריפה.</td></tr><tr><td>כיסויי Glas 24 x 36 מ"מ </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, conc. (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל.</td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוכלורית נפחית, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל.</td></tr><tr><td>נתרן ניטריט, ריאגנט פלוס, &#8805; 99.0% (NaNO2)</td><td>מחמצן Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>. רעיל. מסוכן לסביבה.</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיניטרילוטטראצטית מלח דיסודיום דיהידראט (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>חשיפה אוראלית עלולה לגרום להשפעות רבייה והתפתחותיות.</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק> ציוד</חזק></td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P מעבד הסתננות ואקום</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 הרץ</td><td></td></tr><tr><td>האקר-ברייט 8000 סדרה בסיס מזחלת מיקרוטום </td><td>מכשירי האקר מכשירי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיטור מזון ביתי </td><td>בראון</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספק מאוד להדמית חלבון מסוימת, אמינה ואטרקטיבית. אחוזי הצלחה ופרשנות של תיוג ססגוני מבוסס IHC הוא מאתגר, במיוחד כאשר נעשו שימוש להערכת גומלין בין חלבוני היעד בתוך הרקמה עם תכולת שומן גבוהה, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS). הפרוטוקול שלנו מייצג עידון של טכניקת immunolabeling תקן המותאמת במיוחד עבור זיהוי של שני חלבונים המבניים מסיסים בחולדה CNS ובלוטות לימפה היקפיות (LN) מושפעות neuroinflammation. עם זאת, עם או בלי שינויים נוספים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש סבירה לגילוי מטרות חלבון נלווים אחרות, אפילו באיברים ומינים אחרים מאשר כאן מוצגים.

<html> immunostainings הזוגי (שיתוף stainings) בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי CNS ו LN. 3-5 מיקרומטר פרוסות עבות רקמות נחתכו באמצעות מזחלת microtome, רכוב ובהמשך על גבי שקופיות זכוכית דבקות מראש מצופה ומטופל כפי שתואר לעיל 10,11,12. בקצרה, לאחר deparaffinizing, התייבשות רקמות איון peroxidase אנדוגני, סעיפים היו נתונים בתהליך יחזור אנטיגן, ואחריו צעד חסימה לחסל אתרי קישור נוקבים. שיתוף stainings בוצעו, לפי הצירופים הבאים: i) C...

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לטרגט חלבון ספציפי ברקמת חולדה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד, קיבוע וטמיעה בפרפין של הרקמה, ולאחר מכן חיתוך של הרקמה והעמדתה על סליידים. השלב השני הוא הסרת הפרפין והידרציה מחדש של חיתוכי הרקמה הטמורים בפרפין, ולאחר מכן חסימה של הפרוקסידאז האנדוגני.בשלב הבא, האפיטופים נחשפים באמצעות החזרת אנטיגן (antigen retrieval). לאחר מכן, מתבצע חסם (blocking) כדי להפחית קישור לא ספציפי לפני הכנסת הנוגדנים. השלב הסופי הוא זיהוי האפיטופ הספציפי באמצעות סימון אימונולוגי עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, ופיתוח האות מהנוגדן המשני המסומן.בסופו של דבר, הסיגנל מוצג באמצעות מיקרוסקופיית אור כדי להראות את תבנית הלוקליזציה של החלבון בחתכי הרקמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תבניות הלוקליזציה והביטוי של החלבון במערכת העצבים המרכזית של החולדה ובבלוטות הלימפה ההיקפיות, ניתן להחיל אותה גם על איברים ומינים אחרים. לצורך הדגמת הפרוצדורה ישתמשו בטכנאי.שמה הוא Katalin Benedek, מהמרכז למשאבים שיתופים של מרכז המיקרוביולוגיה, הגידולים וביולוגיית התא ב-Karolinska Institutet. כדי להתחיל בהכנת הרקמות, טבול את רקמות המוח, חוט השדרה והקשרי לימפה ההיקפיים שנותחו ב-4% פאראפורמאלדהיד, והנח אותן בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. לאחר קיבוע הרקמות, העבר אותן ל-P-B-S ואחסן אותן בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד נוסף.כדי להתחיל בעיבוד הרקמה, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הרקמה לחלקים בגודל של כ-5 מילימטרים. לאחר מכן, התחילו בתהליך הקשחת הרקמה באמצעות מעבד חדירה בוואקום. הפרוצדורה הסטנדרטית מבוססת על טבילה בריכוזים עולים של אתנול, לאחר מכן ב-xylol, ולבסוף בפרפין.בשלב הבא, מקמו את הרקמה בתבנית. מזגו פראפין נוזלי מסביב לדגימה ליצירת בלוק פראפין, ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר. לפני חיתוך הרקמה, קררו את בלוק הפראפין למשך לילה על פלטת קירור או במקרר.לאחר שהבלוק פראפין התקרר, מקמו את הבלוק במחזיק הקבוע של מיקרוטום מסוג sledge, המסוגל לנוע קדימה ואחורה על פני סכין. לאחר מכן, כווננו את הבלוק ואת סכין המיקרוטום לזווית האופטימלית, התלויה בגיאומטריה של הסכין ובמהירות ובטכניקת החיתוך. חתכו שלושה חיתוכים רוחביים בעובי של 5 µm מבלוק הפראפין.לאחר מכן, העבירו את החתכים למיכל מים והעבירו את החתכים מהמים אל עלה זכוכית מסחרי מצופה בדבק. לאחר מכן, לחצו בזהירות את החתך המורכב כנגד נייר סופג כדי להסיר שאריות מים ובועות אוויר פוטנציאליות. ייבשו את העלונות המורכבות במשך מספר שעות בתנור המכוון ל-50 to 60 °C.לאחר שהשקופיות יבשו, טבול אותן פעמיים ב-xylol למשך 15 עד 20 דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטוף כל שקופית ב-99% ethanol. כדי לחסום את פעילות ה-peroxidase האנדוגנית, הדגר את החתכים למשך 30 דקות בתמיסת methanol המכילה 0.25% hydrogen peroxide.לאחר מכן, המשיכו להחזיר את נוזלי הרקמה למצב הידרטי על ידי שטיפה בתמיסות אתנול עם ריכוז מים עולה. בצעו את שלב ההידרטציה האחרון במים מזוקקים. ודאו כי הפרוסות נשארות לחות עד להנחת הזכוכיות המכסות.כדי לבצע חשיפת אנטיגן, חמם את השקופיות באמצעות מכשיר קיטור ביתי ובבופר EDTA ב-pH 8.5 למשך 60 דקות. לאחר מכן, קרר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך כשעה אחת. ברגע שהשקופיות קרות, שטוף כל שקופית שלוש עד חמש פעמים במי מלח עם בופר Tris, או T-B-S.בשלב הבא, דגרו את חיתוכי הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בתמיסת חסימה המכילה 10% fetal calf serum ו-90% wash buffer, כדי לחסום תגובות רקע לא ספציפיות. לאחר חסימת חיתוכי הרקמה, דללו את הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה, ודגרו את השקופיות בתמיסת הנוגדנים הראשוניים זו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם T-B-S buffer.לאחר מכן, הדגרו את השקופיות עם נוגדנים משניים המדוללים בתמיסת החסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו שוב את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם תמיפת T-B-S. לאחר מכן, הדגרו את השקופיות עם קומפלקס avidin horseradish peroxidase, המדולל ביחס של 1:100 בתמיסת החסימה, למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.בסיום האינקובציה של שעה אחת, שטפו את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם תמיפת T-B-S. לאחר הכנת תמיסת ה-fast blue כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, נערנער את הצלחת קלות וסננו את התערובת שהתקבלה. שפכו את התמיסה על השקופיות הנמצאות בקוובט הזכוכית.התחילו את הדגירה בטמפרטורה של 37 °C, ועקבו אחר תהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ אור בכל 15 עד 30 דקות. עם סיום הדגירה, שטפו את הפסות שלוש עד חמש פעמים עם תמיסת T-B-S buffer, ולאחר מכן העבירו את הפסות לתמיסת P-B-S buffer. להכנת תמיסת הפיתוח D-A-B hydrogen peroxide, דללו תחילה 1 mL של תמיסת סטוק D-A-B ב-49 mL של P-B-S.הוסיפו 16.5 µL של מי חמצן, ולאחר מכן סננו את התמיסה. שפכו את התמיסה על העששיות, וודאו כי אתם שולטים בתהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ אור כדי למנוע רקע גבוה שעלול להסוות את האות הספציפי. לאחר מכן, שטפו את העששיות שלוש עד חמש פעמים עם P-B-S, ולאחר מכן בצעו שטיפה סופית עם מים מזוקקים או מי ברז.הצמד את הזכוכיות כיסוי לסליידים ישירות מהמים, תוך שימוש בתווך הצמדה מימי. הימנע מיצירת בועות אוויר בין זכוכית הכיסוי לסלייד. לאחר הצמדת החתכים, הדגר את הסליידים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לאפשר לתווך ההצמדה להתייבש לחלוטין.יש לאחסן את השקופיות המיובשות בטמפרטורת החדר. צביעה כפולה של חתכי רקמה מקשרי לימפה פריפריים שבודדו מחולדות ביום השביעי לאחר החיסון גילתה שתאי t לימפוציטים חיוביים ל-cd8 לא הפרשו את הכמוקין C-C-L 11. לחלופין, נמצא כי C-C-L 11 נמצא במיקום משותף עם E-D one, סמן לחלבון ליזוזומלי במקרופאגים מופעלים.צביעה כפולה ב-I-H-C של חוט השדרה של חולדה זיהתה ייצור של C-C-L eleven בתוך פריקריה נוירונליים, דנדריטים ואקסונים, אך לא במקרופאגים חיוביים ל-I-B-A one ובתאי מיקרוגליה תושבי המוח. בנוסף, נמצא כי רוב המקרופאגים החיוביים ל-E-D one ותאי המיקרוגליה תושבי המוח אינם חיוביים ל-C-C-L 11. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מיקוד אימונוהיסטוכימי ספציפי ואמין של החלבון ישירות בחתכי רקמה.

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של סיבים כולינרגיים בגרעין הבסיסי של אזור מיינרט של מקטעי מוח של עכבר. הקטעים נחסמים ומטופלים בראשוני כנגד כולין אצטילטרנספראז, ואחריו נוגדנים משניים ביוטיניליים. מתווספים קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים משניים, ואחריהם המצע הכרומוגני. לאחר מכן החלקים מיובשים ומורכבים לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי עצב בגרעין הבסיסי של מיינר במוח העכבר

מקור: Evilsizor, M. N., et. al., פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של חולדה בהקפאה: דוגמה לצביעה עבור מיקרוגליה ונוירונים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים תהליך צביעה אימונוהיסטוכימי שלב אחר שלב על רקמת מוח של חולדה שהוקפאה כדי להמחיש את הסידור המרחבי של מיקרוגליה ונוירונים.

צביעה אימונוהיסטוכימית של קריוסקציות רקמת קורונל של חולדות עבור מיקרוגליה ונוירונים

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.

קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים

הגנגליה הגדולה מכילה נוירונים. מעוררי חמלה וסימפטיים שinnervate איברי אגן כאן אנו מתארים שיטת הניתוח ולספק תרשימים לזיהוי גנגליה אלה ואת העצבים המשויכים שלהם. שיטות אלה ניתן להחיל על מניפולציה ניסויית של גרעינים אלה ב vivo או להסרת לאחר המוות למחקר נוסף.

חיתוך של האגן האוטונומי האגליה והעצבים המשויכים בחולדות זכר ונקבה

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.

תצפית מיקרוסקופית של לימפוציטים דינמיקה במדבקות של עכברוש פייר

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

מוצגת שיטת זלוף נוחה הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר. זיהוי אימונופלואורסצנטי של α-סינוקלאין זרחני מודגם במודל עכברי של מחלת פרקינסון. עבודה זו גם מתארת באופן מקיף את ההעתקה, הנתיחה, הקפאת/הטבעת רקמות ושלבי חתך קפואים.

שיטת פרפוזיה טרנסקרדיאלית הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר

פרוטוקול זה מתאר טכניקה אימונופלואורסצנטית צבעונית להערכת מודל החולדה של נזלת אלרגית.

תיוג אימונופלואורסצנטי בחלקי רקמת רירית האף של חולדות נזלת אלרגיות באמצעות בדיקה חיסונית צבעונית

למד פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה כפולה ברקמות עצבים מרכזיים ולימפה פריפריה בעכברוש. השיטה מאפשרת הדמיית מיקום חלבונים במיקרוסקופ אור ומסייעת לחוקרים בתחומי הנוירומדע והאימונולוגיה.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

גלה סרטונים נוספים