Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקד לחלבון ספציפי ברקמת החולדה. זה מושג על ידי בידוד, קיבוע והטמעת פרפין של הרקמה, ולאחר מכן חיתוך הרקמה והרכבתה על שקופיות. השלב השני הוא דה-פראפין ולחות מחדש של חלקי הרקמה המוטבעים בפרפין, ולאחר מכן לחסום את הפרוקסידאז האנדוגני.

לאחר מכן, האפיטופים נחשפים על ידי אחזור אנטיגן. לאחר מכן, מתבצעת חסימה כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי לפני החדרת הנוגדנים. השלב האחרון הוא לזהות את האפיטופ הספציפי על ידי תיוג חיסוני עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, ולפתח את האות מהנוגדן המשני המסומן.

בסופו של דבר, האות מומחש באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להראות את דפוס לוקליזציה של החלבון בקטעי הרקמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי לוקליזציה ודפוסי ביטוי של חלבונים במערכת העצבים המרכזית של החולדה ובבלוטות הלימפה ההיקפיות, ניתן ליישם אותה גם על איברים ומינים אחרים. להדגמת ההליך יהיה טכנאי.

קוראים לה קטלין בנדק, ממתקן הליבה של המרכז למיקרוביולוגיה של גידולים וביולוגיה של התא במכון קרולינסקה. כדי להתחיל בהכנת רקמות, טבלו את רקמת המוח, חוט השדרה ובלוטות הלימפה ההיקפית המנותחות בארבעה אחוזים פרפורמלדהיד, והניחו אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר קיבוע הרקמות, העבירו את הרקמה ל-P-B-S ואחסנו אותה בארבע מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד.

כדי להתחיל לעבד את הרקמה, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הרקמה למנות בגודל של כחמישה מילימטרים. לאחר מכן, התחל את תהליך התקשות הרקמות עם מעבד חדירת ואקום. ההליך הסטנדרטי מבוסס על טבילה לריכוזים עולים של אתנול, ואחריו קסילול, ולבסוף פרפין.

לאחר מכן, הניחו את הרקמה בתבנית. יוצקים פנימה את הפרפין הנוזלי סביב הדגימה ליצירת גוש פרפין, ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר. לפני חיתוך הרקמה, יש לקרר את גוש הפרפין למשך הלילה על הצלחת הקרה או במקרר.

לאחר קירור גוש הפרפין, הנח את הבלוק במחזיק הקבוע של מיקרוטום מזחלת שיכול לנוע אחורה וקדימה על פני סכין. לאחר מכן, כוונן את הבלוק ואת סכין המיקרוטום לזווית האופטימלית, התלויה בגיאומטריית הסכין ובמהירות החיתוך ובטכניקה. חותכים שלושה חתכים בעובי חמישה מיקרון מגוש הפרפין.

לאחר מכן, העבירו את החלקים החתוכים למיכל מים והרכיבו את החלקים מהמים על מגלשת זכוכית דביקה מצופה מראש. לאחר מכן, לחץ בזהירות על החלק המותקן כנגד מגבת נייר כדי להסיר שאריות מים ובועות אוויר פוטנציאליות. יבש את המגלשות המותקנות למשך מספר שעות בכיריים המוגדרות ל 50 עד 60 מעלות צלזיוס.

לאחר שהמגלשות יבשות, טבלו את השקופיות פעמיים בקסילול למשך 15 עד 20 דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו כל שקופית ב-99 אחוז אתנול. כדי לחסום את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית, דגרו את החלקים למשך 30 דקות בתמיסת מתנול המכילה 0.25 אחוז מי חמצן.

לאחר מכן, המשיכו להרטיב את חלקי הרקמה על ידי שטיפה בתמיסות אתנול המכילות תכולת מים הולכת וגוברת. בצעו את שלב ההתייבשות האחרון במים מזוקקים. הקפד לשמור על החלקים לחים עד להחלקת הכיסוי.

כדי לאחזר את האנטיגן, מחממים את המגלשות בעזרת ספינת קיטור ביתית ומאגר EDTA ב-pH 8.5 למשך 60 דקות. לאחר מכן, מצננים את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך כשעה. לאחר שהשקופיות מתקררות, שטפו כל שקף שלוש עד חמש פעמים במי מלח עם Tris-buffered, או T-B-S.

לאחר מכן, דגרו את חלקי הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בתמיסת חסימה המכילה 10 אחוז סרום עגל עוברי ו-90 אחוז מאגר שטיפה כדי לחסום תגובות רקע לא ספציפיות. לאחר חסימת חלקי הרקמה, יש לדלל את הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה, ולדגור את השקופיות בתמיסת נוגדנים ראשונית זו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם מאגר T-B-S.

לאחר מכן דגרו את המגלשות עם נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת החסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו שוב את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם מאגר T-B-S. לאחר מכן, דגרו את המגלשות עם קומפלקס פרוקסידאז חזרת אבידין, מדולל אחד עד 100 בתמיסת החסימה, למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר השלמת הדגירה של שעה, שטפו את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם מאגר T-B-S. לאחר הכנת התמיסה הכחולה המהירה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לנער קלות את המנה ולסנן את התערובת המתקבלת. יוצקים את התמיסה על השקופיות בקוביית הזכוכית.

התחל את הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס, וצפה בתהליך ההתפתחות תחת מיקרוסקופ האור כל 15 עד 30 דקות. לאחר השלמת הדגירה, שטפו את השקופיות שלוש עד חמש פעמים עם מאגר T-B-S, ולאחר מכן העבירו את השקופיות למאגר PBS. כדי לייצר את תמיסת הפיתוח של מי חמצן D-A-B, יש לדלל תחילה מיליליטר אחד של תמיסת מלאי D-A-B ב-49 מיליליטר של P-B-S.

הוסף 16.5 מיקרוליטר מי חמצן ואז סנן את התמיסה. יוצקים את התמיסה על השקופיות, ומקפידים לשלוט בתהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ האור על מנת להימנע מרקע גבוה שיכול להסוות את האות הספציפי. לאחר מכן, שטפו את המגלשות שלוש עד חמש פעמים עם P-B-S, ולאחר מכן שטיפה אחרונה במים מזוקקים או מי ברז.

הרכיבו את המגלשות עם החלקות כיסוי ישירות מהמים, באמצעות מדיום הרכבה מימי. הימנע מיצירת בועות אוויר בין החלקת הכיסוי למגלשה. לאחר הרכבת החלקים, דגרו את המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתייבש לחלוטין.

אחסן את השקופיות המיובשות בטמפרטורת החדר. צביעה כפולה של קטעי רקמת בלוטות לימפה היקפיות שבודדו מחולדות ביום השביעי לאחר החיסון גילתה כי לימפוציטים מסוג T חיוביים ל-CD8 לא הפרישו את הכימוקין C-C-L 11. לחלופין, נמצא כי C-C-L 11 מתמקם במשותף עם E-D one, סמן לחלבון ליזוזומלי במקרופאגים פעילים.

צביעה כפולה של חוט השדרה של חולדה זיהתה ייצור C-C-L 11 בפריקריה עצבית, דנדריטים ואקסונים, אך לא במקרופאגים חיוביים I-B-A ותאי מיקרוגליה השוכנים במוח. בנוסף, רוב המקרופאגים החיוביים ל-E-D אחד ותאי מיקרוגליה השוכנים במוח נמצאו גם הם כלא חיוביים ל-C-C-L 11. לאחר שצפית בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקוד אימונוהיסטוכימי ספציפי ואמין של החלבון ישירות בקטעי רקמה.