Name: Elegans Caenorhabditis מערכת מודל לחקר Amylopathy (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: למדו לחקור רעילות עמילואיד בטא בנוירונים תוך שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמודל טרנסגני. השיטה כוללת מבחני כימוטקסיס ותרביות תאים ראשוניות להערכת פונקציה עצבית ושרידות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; אנו מודים לד&quot;ר שואנג יו לקריאה ביקורתית של כתב היד. PCL12 המבנה היה קישור טופס ד ד&quot;ר כריסטופר מתנה. עבודה זו נתמכה על ידי שני מענקי קרן לאומי למדע (0842708 ו1026958) ומענק AHA (09GRNT2250529) לFS.</p

1. בנייה של תולעים מהונדסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנספורמציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רפידות הזרקה. מניחים ירידה של חמה, 2% מומסת במי agarose, על coverslip זכוכית. במהירות למקום coverslip שני על הירידה בקלילות וקש עליו. לאחר agarose הוא הגדילו, שקופיות coverslips זה מזה, ואופה coverslip-הכרית בתנור ואקום ב 80 ° CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך pipettes. אנו משתמשים בחולץ סאטר P-97 כדי למשוך 1/0.5 מ&quot;מ OD / מזהה ורוסיליקט נימים עם נימה. Pipettes מזויפים עם קצה סגור אשר נפרץ בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הזרקה. הפוך את תערובת ההזרקה המכילה את ה-DNA של עניין (20 ng / μl למבנה) בתוספת פלסמיד דנ&quot;א הריק לריכוז סופי של 150 ng / μl. צנטריפוגה את תערובת ההזרקה כדי להסיר כל זיהום. שלב זה הוא קריטי משום שחומרים מזהמים להפחית את יעילות שינוי. העבר את 5 μl העליון (מזהמים ופסולת אחרים מצטברים בתחתית) לצינור טרי ל-Bדואר בשימוש בהזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תמהיל הזרקה ידי קפילריות. התחתון של פיפטה הוא שקוע בתמהיל ההזרקה. בדרך כלל 0.5 μl מספיקים כדי להזריק 100 תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען פיפטה הזרקה. הכנס את פיפטה על בעל micromanipulator ולשבור אותו פתוח על ידי שפשוף הקצה שלה כנגד קצה להחליק את מכסה רכוב על שקופיות זכוכית או לחלופין נגד פסולת על כרית agarose. זהו צעד חיוני כמו טיפים נזק גדול מדי תולעת וסתומים טיפים קטנים בקלות רבה מדי. האיכות של הקצה השבור יכולה להישפט על ידי הצורה והכי חשוב על ידי קצב הזרימה. קצב הזרימה ניתן להעריך על ידי גודל הבועות זורמות מהקצה הפתוח השקוע בטיפת שמן 700 halocarbon של בתגובה ללחץ הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים למשטח זריקה. מקום טיפת שמן halocarbon 700 על משטח זריקה ולהעביר כמה (1 או 2 למתחילים) תולעים לנפט. השתמש בתולעת להרים לדחוף את התולעים למטה על הכרית עדy לדבוק agarose. תולעים צריכים להיות מונחה בשורות עם צדדים הגחון פונים לאותו כיוון. הימנע מלגעת בראשו של התולעת. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים לא מצליח לדבוק בכרית, להחליף עם כרית טרי או להגדיל agarose עובי ו / או ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פיפטה לתוך התולעת. על ידי הזזת הבמה, למקם את התולעת בפיפטה. מקם את פיפטה בליבה של בלוטת המין המרכזית היא כי הציטופלסמה שלה שותפים רבים גרעיני תאי נבט. זה מגדיל את הסיכוי להעביר דנ&quot;א מוזרק לצאצאים רבים. פיפטה צריכה לשקר כמעט במקביל לתולעת (~ 15 ° -25 ° זווית). לדחוף אנכי קצה פיפטה במורד הגוף של התולעת עד שהעור הוא בדיכאון. לאחר מכן הקש בעדינות על מניפולטור כדי לגרום לכניסתו של טיפ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להזריק שתי בלוטות המין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את פתרון ה-DNA. תפעיל לחץ על פיפטה עד שמתנפח בלוטת המין. לעצור את הזרימה ולמשוך את תולעת פיפטה. בדוק את המחט לזרימה ולאחר מכן להעבירלתולעת הבאה וצעדי הזרקה חוזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את התולעים: הוסף טיפה (~ 10 μl) של חיץ התאוששות בתולעים ודגירה עד התולעים להתחיל לשחות. הוסף נפח שווה של M9, לחכות עד שתולעים לחדש את החייה ולחזור כמה פעמים עד שהפתרון הוא בעיקר M9. בנפרד להעביר תולעים לצלחות זרע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינטגרציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 40 בריאים, מדושנת, L4 תולעים לתוך צלחת טרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין עם γ-ray עם 4,000 ראד עבור 40 דקות. העבר את התולעים מוקרנים (P0) בזרע טרי, צלחות OP50 (4 תולעים / צלחת). לחלופין ניתן מוקרנים תולעים עם מינון של 300 יובס J / 2 מ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10-20 transformants F1 מכל צלחת לצלחות אישיות, לתייג את הצלחות עם P0 המקור המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד מתוך 2-4 transformants F2 לכל F1 כדי צלחות נפרדות. בדקו את צאצאי F3 להעברת 100% משינוי הסמן. בדרך כלל, 1-3% של צאצאים מwil תולעת מוקרןיש לי אירוע אינטגרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניות של שלושה או יותר קווי transformant עצמאיים. </li></ol></li></ol> 2. מבחני התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיל סנכרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תולעים ב+ 10 ס&quot;מ צלחות NGM הסטנדרטי OP50 E. coli עד אוכלוסייה גדולה של מבוגרים הרה להולדת הוא הגיע (3-5 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התולעים ב50 צינורות מ&quot;ל פלקון על ידי השעיית אותם במאגר 1 מיליליטר M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ M9 5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 450 במשך 3 דקות. בטל supernatant. חזור על 3-4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של צנטריפוגה שעברה, להסיר את supernatant ולהוסיף 10 כרכים של פתרון hypochlorite הבסיסי (0.5 M NaOH, hypochlorite 1% טריים המעורב) לתולעי pelleted. לדגור על RT במשך ~ 10 דקות. תגובת תמוגה יכולה להיות פיקוח על ידי הצבת ירידה של תגובת תמוגה על coverslip ולבחון את התולעים מתחת למיקרוסקופ. כאשר כ -80% מתולעים שבורים יש להפסיק את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת תמוגה ידי AddinG אותו הנפח של ביצת חיץ סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים (ופגרים) על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הביצים עם חיץ סטרילי ביצה 2-3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הביצים O / N במאגר וזרעם על צלחות NGM סטנדרטיות M9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay chemotaxis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין כמה חתיכות של אגר כ 0.5x0.5x0.5 ס&quot;מ. אנחנו נפקיד את אגר בצלחת של 10 ס&quot;מ וחתכנו את נתחים אגר משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הנתח אגר בתמיסה המכילה attractant הרצוי (בלהרוות, ריכוזים קרובים להרוות) במשך שעה 2. משיכה אופיינית הן ליזין (0.5 מ &#39;), ביוטין (0.2 מ&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד נתח אגר בצלחת מבחן 10 ס&quot;מ שבו המיקום של נקודת מבחן ונקודת שליטה סומנו (איור 1 א). לאפשר איזון והיווצרות O שיפוע / N (איור 1). הכן 5 צלחות עבור ניסוי בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי להוסיף 10 μl של 20 מ&quot;מ NaN 3 (anesthetic) לכל מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 20 תולעי גיל מסונכרנים במרכז הצלחת. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1, לספור את בעלי החיים על כתמי בדיקה / בקרה ולחשב את מדד chemotaxis, (CI) כדלקמן: <img alt="משוואת 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> כאשר N, N ו-N בדיקת CNT., מציינים את המספר הכולל של בעלי חיים, מספר בעלי החיים במקום המבחן ומספר בעלי החיים במקום השליטה. </li></ol></li></ol> 3. תרבית תאים העוברית ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תולעים, כמתואר בגיל סנכרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת תמוגה על ידי הוספת הנפח הזהה של חיץ ביצה וסטרילית צנטריפוגות ב XG 450 במשך 5 דקות. בעדינות להשליך supernatant נזהר שלא לאבד את ביצי pelleted. חזור על 2-3x או עד supernatant הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ביצי pelleted (ופגרים) במאגר ביצת סטרילי 2 מ&quot;ל ולהוסיף 2 מ&quot;ל של סוכרוז 60% סטרילי במאגר הביצה. מערבבים את הפתרון הזה עד ביצים resuspended לחלוטין (כפי שהם נוטים ליצור גושים בצנטריפוגה) ביד או באמצעות vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 450 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (המכיל את הביצים) בזהירות לצינור סטרילי. בטל גלולה המכיל פגרים ואחרים תוצרי לוואי של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סוכרוז שיורית על ידי resuspending את הביצים בחיץ הביצה וcentrifuging ב 450 XG במשך 5 דקות. בעדינות לאסוף וזורקים supernatant. חזור על 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע מינרית resuspend ביצי pelleted במאגר ביצת סטרילית המכיל U 1 / מיליליטר chitinase ב RT לעכל את קליפות ביצים. לאחר 30 דקות להתחיל לעקוב אחר התגובה (תחת מיקרוסקופ תרבות תא הפוך). כל אצווה של chitinase יש פעילות שונה במקצת. בדרך כלל עיכול יושלם בשעת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בערך 70-80% קליפות ביצים מתעכלות על ידי chitinase תוספת CM-15 (L-15 תא התרבות Medium המכיל 10% בסרום שור עוברי, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). לנתק את התאים באמצעות מזרק עם מד 27. סנן את ההשעיה התא עם 5.0 מיקרומטר לסנן להסיר עוברים שלמים, גושים של תאים וזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ההשעיה התא ניתק על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בתרבית תאים בינונית-15 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ניתק צלחת על כיסוי זכוכית מצופה בעבר עם תלושים לקטינים בוטנים (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מומסים במים. הערה: תאים חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולים להישמר תאים ב RT (16-20 ° C) באוויר במשך יותר מ 2 שבועות. </li></ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים גישה משולבת, ללמוד היבטים תאיים ומולקולריים של amylopathies באמצעות ג elegans. היתרונות של גישה זו כוללים: 1.) בעלות הנמוכה C.elegans נשמר בצלחת פטרי עם חיידקים נורמלי זורעים, בטמפרטורת חדר. 2) גנטיקה עוצמה. ניתן להשיג בבעלי חיים מהונדסים בכמה חודשים, ומגוון רחב של רצפי האמרגן זמין לנהוג ביטוי של הגן הרצוי בתאי עצב מסוימים. 3) פשוט, מאופיין היטב, מערכת עצבים. ג elegans בעל מערכת עצבים פשוטה להפליא (302 נוירונים). פשטות זו העניקה אפיון נרחב...

בטא עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד של 36-43 חומצות אמינו שתקום לאחר מחשוף רציף של החלבון המקדים עמילואיד (APP) ועל ידי β secretases 1 γ. Secretase γ מעבד סוף C-המסוף של הפפטיד Aβ והוא אחראי עליה אורכים משתנים 5. הצורות הנפוצות ביותר של Aβ הן 40 Aβ וAβ 42, האחרון להיות קשור יותר בכינוי לתנאים פתולוגיים כגון 5 לספירה. בריכוזי Aβ טופס β גיליונות גבוהים שמצרף ליצירת סיבי עמילואיד 6. פיקדונות סיבים הם המרכיב העיקרי של פלאק סנילי סביב הנוירונים. שני לוחות ו oligomers Aβ diffusible, לא פלאק, הם חשבו מהווים צורות פתוגניים הבסיסיות של Aβ. מעבדת מחקר של amylopathies העצבי הוא מסובך בשל העובדה כי תנאים אלה התקדמות עם זמן. לכן, זה importanלא לפתח חיה צייתנית גנטי דגמים-משלים לעכברים עם תוחלת חיים קצרה. מודלים אלה יכולים לשמש כדי להבהיר היבטים ספציפיים של amylopathies-בדרך כלל סלולרי ו, מולקולרי ומכוח הפשטות שלהם לעזור כדי ללכוד את המהות של הבעיה. תולעת Caenorhabditis elegans הנפילות היא קטגוריה זו. יש לו תוחלת חיים קצרה, ~ 20 ימים ובנוסף תהליכים תאיים בסיסיים, כולל רגולציה של ביטוי גנים, סחר בחלבון, קישוריות עצבית, synaptogenesis, איתות תא, ומותו הם דומים ל7 יונקים. תכונות ייחודיות של התולעת כוללות גנטיקה וחוסר מערכת כלי, המאפשר ללמוד באופן עצמאי נזק עצבי של נזק בכלי הדם רבי עוצמה. מצד השני, חוסר מוח מגביל את השימוש בג elegans ללימוד היבטים רבים של ניוון מוחיים. בנוסף, לא ניתן לבצע העתקה וזיהוי של הפצות אנטומיים של נגעים באורגניזם זה. מגבלה אחרתations כולל קושי להעריך את שני ההבדלים בביטוי גן פרופילים וירידת הערך של התנהגות מורכבת ותפקוד זיכרון. כאן אנו מתארים שיטות להפקת ג מודלים של amylopathies elegans.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>1. NGM</חזק></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5886</td><td>3 גרם</td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 גרם</td></tr><tr><td>בקטו-פפטון</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2.5 גרם</td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td> מזוקקים <td>הביאו ל-975 מ"ל</td></tr><tr><td colspan="4">מעוקר על ידי חיטוי, ואז הוסיפו את הפריטים הבאים וערבבו היטב</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 מ"ל של 1 M מלאי</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 מ"ל של 1 M מלאי</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל מלאי (באתנול)</td></tr> <tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> אשלגן פוספט <td>25 מ"ל של 1M מלאי</td></tr> <tr><td colspan = "4" ><חזק>2. חוצץ אשלגן פוספט</חזק></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108.3 גרם</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35.6 גרם</td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td> מזוקקים <td>הביאו ל-1 L</td></tr><tr><td colspan="4">מעוקר על ידי חיטוי</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3. M9 buffer</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 גרם</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 גרם</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 גרם</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 מ"ל של 1 M מלאי</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>מזוקקים</td><td>להביא ל -1 ליטר</td></tr><tr><td colspan="4">מעוקר על ידי חיטוי</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>4. מאגר ביצים (pH 7.3, 340 mOsm)</חזק></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5886</td><td>118 מ"מ</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5405</td><td>48 מ"מ</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C5670</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4880</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>פישר מדעי</td><td>BP310</td><td>25 מ"מ</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>מזוקקים</td><td>הביאו ל-1 L</td></tr><tr><td colspan="4">מעוקר על ידי autoclaving</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</חזק></td></tr><tr><td>L-15 תרבית בינונית</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 גרם/מ"ל</td></tr><tr><td colspan="4">התאם ל-340 mOsm עם סוכרוז ואז מסנן סטרילי לבקבוקים שעברו חיטוי ושומר ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>6. ריאגנטים אחרים</חזקים></td></tr><tr><td>Halocarbon 700 שמן</td><td>Halocarbon מוצרים</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Acrodisc מסנן מזרק</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>לקטין (בוטנים)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td> <td>נתרן היפוכלוריטסיגמא-אולדריץ'</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; elegans caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר amylopathy

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy הוא מונח המתאר את הסינתזה חריגה והצטברות של בטא עמילואיד (Aβ) ברקמות עם זמן. Aβ הוא סימן היכר של מחלת אלצהיימר (AD), והוא נמצא בדמנציה לוי גוף, שררת גוף הכללה וangiopathy עמילואיד המוחי 1-4. Amylopathies לפתח בהדרגה עם זמן. מסיבה זו אורגניזמים פשוטים עם תוחלת חיים קצרות עשויים לעזור להבהיר היבטים מולקולריים של תנאים אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי ללמוד ניוון מוחיים Aβ בתיווך באמצעות elegans Caenorhabditis התולעת. לפיכך, אנו בונים תולעים מהונדסים על ידי הזרקת Aβ אנושי קידוד ה-DNA 42 לבלוטות מין סינסיציאלי של הרמפרודיטים בוגרים. קווי Transformant הם התייצבו על ידי שילוב מושרה mutagenesis. נמטודות הם גיל מסונכרן על ידי איסוף וזריעת הביצים שלהם. התפקוד של נוירונים המבטאים Aβ 42 נבדק במבחני התנהגות מתאימים (assay chemotaxisים). תרבויות עצביות העיקריות שמקורם בעוברים משמשות כדי להשלים נתונים התנהגותיים וכדי לבדוק את ההשפעות של neuroprotective תרכובות אנטי אפופטוטיים.

עם הפרוטוקולים שלנו אנחנו לומדים את ההשפעות של 42 oligomer Aβ האנושי על תפקוד עצבי 8. Aβ בר הקידוד אנושי 42 ואת רצף הפפטיד האות המלאכותי הקידוד של אש וקטור pPD50.52 היה מוגבר ממבנה PCL12 9 באמצעות פריימרים שהציגו אתר endonuclease הגבלת 1 Sma בקצוות. הבר היה אז מוכנס לתוך מבנה המכיל רצף אמרגן 2,481 FLP-BP-6 בוקטור אש pPD95.75 בין Sma האתר הייחודי 1 10. תוך שימוש בטכניקות השינוי המתוארת בפרוטוקול 1 אנו נבנו תולעת מהונדס...

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת<em&gt; ג elegans</em&gt;. אנחנו מראים כיצד לבנות תולעים מבטאים Aβ האנושי<sub&gt; 42</sub&gt; בתאי עצב וכיצד לבדוק את תפקודם במבחני התנהגות. בנוסף, אנו מראים כיצד להשיג תרבויות עצביות עיקריות שיכול לשמש לבדיקה תרופתית.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את השפעות הרעילות של עמילואיד בטא על התפקוד וההישרדות של נוירונים. זאת על ידי בנייה ראשונית של תולעי C elegance טרנסגניות המבטאות פפטיד עמילואיד בטא עם רפורטר GFP בנוירוני חישה SE. לאחר מכן, מוערכת ההשלכה ההתנהגותית של ביטוי עמילואיד בטא בנוירוני SE באמצעות בדיקת כימותקסיס.השלב השלישי הוא השגת תרביתי ראשוניים של נוירונים מה-SE, ולאחר מכן טיפול בנוירונים המתרבים בחומרים פרמקולוגיים כגון Q-V-D-O-P-H כדי לדכא את ההשפעה הרעילה של amyloid beta. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את השפעות הרעילות של amyloid beta על התפקוד וההישרדות של נוירוני SE באמצעות בדיקות התנהגותיות ופרמקולוגיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לניוורודגנרציה, כגון הבהרה של מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים.השפעות נוירוטוקסיות בסיסיות של אמילואיד בטא אוליגומרים. את הפרוצדורות תדגים ד"ר Zing Dwan, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. לצורך התהליך, נדרשות משטחי הזרקה של 2% agros. הניחו טיפה של aros חם המומס במים על כיסית זכוכית, הניחו במהירות כיסית שנייה על הטיפה והקישו עליה קלות.בעת הכנת תערובת ההזרקה, הקפידו לסבב במצנטריפוגה ולהעביר את חמישה המיקרוליטרים העליונים, הנקיים משאריות וממזהמים אחרים, למבחנה נקייה לצורך טעינת ההזרקה. טענו את תערובת ההזרקה ואת הפלסמיד הריק לצנרת ההזרקה באמצעות פעולת נימיות. חצי מיקרוליטר מספיקים בדרך כלל להזרקה של 100 תולעים. כדי להרחיב את הפתח בצנרת ההזרקה, שפשפו את קצה הצנרת כנגד קצה של כיסוי זכוכית (cover slip) המורכב על פלטת זכוכית בשמן Halo carbon 700. איכות הפתח היא קריטית.הוא נשפט לפי צורת הקצה, והחשוב מכל, לפי קצב הזרימה, הנבדק באמצעות הזרימה ובגידול הבועות הנוצרות בקצה הפפילטה כמענה ללחץ ההזרקה. כעת, הניחו טיפה של שמן פחמן חלול 700 על פד הזרקה והעבירו מספר תולעים לפד. השתמשו במוט העברה (worm pick) כדי לדחוף את התולעים מטה אל הפד עד שיידבקו אליו.יש לסדר את התולעים בשורות כאשר הצדדים הבטניים שלהן מיושרים. הימנעו מנגיעה בראשיהן. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים אינן נצמדות לפד, נסו להשתמש בפד חדש או הגדילו את עובי האגרוז או את ריכוזו של הפד.כעת הכניסו את הפפטה לתוך התולעת. ראשית, הזיזו את הבמה כדי למקם את התולעת תחת הפפטה השנייה. מקמו את הפפטה לצד הגרעין המרכזי של הגונד.מכיוון שהציטופלזמה שלו משותפת לגרעינים של תאי נבט רבים, הדבר מגביר את הסבירות שה-DNA המוזרק יעבור לצאצאים. על הפ pipette להישען כמעט במקביל לתולעת. שלישית, יש להזיז את הקצה אנכית לכיוון הגוף עד לדחיסת העור.לבסוף, הקישו בעדינות על המניפולטור כדי להביא להחדרת הקצוות. כעת, הזרקו את תמיסת ה-DNA. הפעילו לחץ על הפפיטה עד שהגונד ינפח.לאחר מכן הפסיקו את הזרימה והסירו את התולעת מהפיפטה. בדקו את זרימת המחט, ולאחר מכן מזריקו לשאר הגונאדות לפני המעבר לתולעת הבאה. לאחר ההזרקות, הוסיפו כ-10 µL של בופר התאוששות לתולעים והמתינו עד שיתחילו לשחות.ברגע שהם שוחים, הוסיפו נפח שווה של תמיסת בופר M9. כאשר התולעים יחזרו לשחות, המשיכו להוסיף M9 עד שהתמיסה תהיה בעיקר M9. כעת העבירו כל תולעה לצלחת מושב (seated plate).אספו תולעי GR במיליליטר אחד של תמיפת מגן M9 בתוך מבחנה מסוג פאלקון בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת תמיפת M9, שטפו את התולעים באמצעות סבב חוזר של סנטריפוגה והחלפת תמיסה, עד שתמיפת ה-M9 תהיה צלולה לאחר השטיפה. לאחר מכן, הוסיפו 10 נפחים של תמיסת היפוכ לוריט בסיסית לתולעים.דחסו את התולעים במ centrifuge והדגירו אותן בטמפרטורת החדר עד שכשארבע חומש מהן נשברות, תהליך שארך בדרך כלל 10 דקות. עקבו אחר התגובה על ידי נטילת מנות (aliquots) לבחינה תחת מיקרוסקופ. עצרו את התגובה על ידי הוספת נפח שווה של בופר ביצים סטרילי.לאחר מכן, אספו את הביצים ואת הגופים על ידי סרסגיקה (צנטריפוגציה) ב-450 G למשך חמש דקות. הסירו בעדינות את הנוזל העליון (סופרנטנט). הוסיפו חזרה נפח שווה של באפר ביצים וסובבו את המבחנה שוב ב-450 G למשך חמש דקות.חזור על הפרוצדורה עד שהבופר יהיה צלול. כעת דגרי את הביצים למשך הלילה בבופר M nine, ולמחרת, זרע אותן על פלטות NGM סטנדרטיות. הכן מספר קוביות אגר, ברוחב של כחצי סנטימטר לכל צלע.השרו את מקטעי האגר בתמיסה המכילה את חומר הפיתיון הרצוי למשך שעתיים. הניחו מקטע אגר בתוך צלחת בדיקה של 10 סנטימטרים, שבה סומנו מיקומי נקודת הבדיקה ונקודת הביקורת. הכינו חמש צלחות כאלו לכל ניסוי.אפשרו לצלחות ליצור מדרג כימי על ידי השארתן למשך הלילה בטמפרטורה של 20 °C עד למחרת. לפני הניסוי, הוסיפו 10 µL של sodium azide בריכוז 20 mM לכל נקודה בצלחות. חומר זה משמש כחומר הרדמה.התחילו את הניסוי על ידי הנחת 20 תולעים בעלות גיל מסונכרן במרכז הצלחת, ולאחר מכן הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 20 °C למשך שעה. לאחר שעה, ספרו את בעלי החיים בנקודות הבדיקה לעומת נקודות הביקורת וחשבו את מדד ה-CI. לאחר ליזיס של תולעי gr וניקוי הביצים והשלדים כפי שתואר קודם לכן, השהו אותם מחדש ב-2 mL של בופר ביצים סטרילי והוסיפו 2 mL של 60% sucrose סטרילי בבופר ביצים.לאחר מכן, ערבבו את המבחנה ידנית או באמצעות וורטקס עד להשעיה מלאה של הביצים. סובבו את הביצים המושעות בצנטריפוגה במהירות של 450 times G למשך 15 דקות. לאחר מכן, אספו בזהירות את העלייה המכילה את הביצים והשליכו את המשקע כדי להסיר את שאריות הסוכרוז, השעו את הביצים בבופר ביצים וסובבו אותן בצנטריפוגה במהירות של 450 G למשך חמש דקות.אספו בעדינות והשליכו את הנוזל העליון, ולאחר מכן חזרו על תהליך הניקוי שלוש פעמים במנדף. השתמשו בבופר ביצים סטרילי המכיל יחידה אחת למיליליטר של chitinase כדי לסספנד מחדש את הביצים השקועות. הניחו לביצים לעבור עיכול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן התחילו לעקוב אחר התגובה תחת מיקרוסקופ תרביות תאים הפוך.כאשר 70 עד 80% מקליפות הביצה מעוכלות, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע גידול L 15 מלא או CM 15. כדי לבודד את התאים, הפרדו את התאים כך שלא ייווצרו גושים על ידי העברתם דרך מחט בכילייב 27 מספר פעמים. כעת העבירו את התמיסה דרך מזרק עם מסנן של חמישה מיקרון.יש להשקיע את תרחיף התאים המופרדים על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-450 G למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש להסיר את הנוזל העליון ולפתוח מחדש את משקע התאים ב-CM 15. כדי לוודא שהתאים אכן הופרדו, יש לבחון את התרחיף תחת מיקרוסקופ.לבסוף, זרעו את התאים המופרדים על כיסויי זכוכית ששולטו מראש. באמצעות לקטין בוטנים, ניתן לשמר את התאים בטמפרטורת החדר עם אוויר רגיל למשך יותר משבועיים. באמצעות טכניקות הטרנספורמציה המתוארות, נבנה תולעת טרנסגנית המבטאת human a Beta 42 בנוירוני a SE, שהם נוירונים המזהים חומרים מושכים מסיסי מים כגון biotin באמצעות בדיקת כימותקסס.תולעים טרנסגניות בנות שבעה ימים נבחנו. קבוצות הביקור לא התקשרו במציאת הביוטין. לעומת זאת, רק תולעים בודדות שהבטאו beta 42 הצליחו למצוא את נקודת המשיכה.מדד הכימוטקסיס עבור ביוטין היה 0.68 לעומת 0.12 עבור תולעי הביקורת והניסוי, בהתאמה, ביום השלישי עד הרביעי. כמו כן, נרשמה ירידה קטנה אך ניתנת לזיהוי במדד. נוירון A SER במטבע ביום הרביעי, הממשיך לבטא GFP לאחר תשעה ימי חיים.עם זאת, פלואורסצנציית ה-GFP נעלמה והשערה על אפופטוזיס עלתה כדי לבחון תאוריה זו. נוירונים ראשוניים מסוג A SER הוכנו כפי שתואר והועשרו במעכב caspase רחב-ספקטרום. כצפוי, הטיפול עצר את אובדן הפלואורסצנציה, ובכך אישר כי ביטוי של A beta 42 אנושי מעורר אפופטוזיס בנוירונים מסוג A SER.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים תולעים טרנסגניות אלגנטיות, לחקור אותן בניסויי התנהגות, וכיצד להפיק תרבית ראשונית מ-Ambrose.

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

למדו לחקור רעילות עמילואיד בטא בנוירונים תוך שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמודל טרנסגני. השיטה כוללת מבחני כימוטקסיס ותרביות תאים ראשוניות להערכת פונקציה עצבית ושרידות.

גלה סרטונים נוספים