Elegans Caenorhabditis מערכת מודל לחקר Amylopathy

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההשפעות של רעילות עמילואיד בטא על תפקוד עצבי והישרדות. זה מושג על ידי בנייה ראשונה של תולעים אלגנטיות C טרנסגניות המבטאות פפטיד בטא עמילואיד עם מדווח GFP בנוירונים חושיים SE. לאחר מכן, התוצאה ההתנהגותית של ביטוי עמילואיד בטא בנוירונים SE מוערכת על ידי בדיקת כימוטקסיס.

השלב השלישי הוא להשיג תרביות ראשוניות של נוירונים SE ולאחר מכן לטפל בתאי עצב מתורבתים עם חומרים פרמקולוגיים כגון Q-V-D-O-P-H כדי לדכא את ההשפעה הרעילה של עמילואיד בטא. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את ההשפעות של רעילות עמילואיד בטא על תפקוד נוירוני SE והישרדותם באמצעות מבחנים התנהגותיים ותרופתיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ניוון עצבי, כגון הבהרת מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים.

השפעות נוירוטוקסיות בסיסיות של אוליגומרים עמילואיד בטא. מדגים את ההליכים יהיה ד"ר זינג דוואן, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי לצורך הטרנספורמציה, נדרשות רפידות הזרקה של 2% אגרוס. הניחו טיפת ארוס חם מומס במים על גבי פתק כיסוי זכוכית, והניחו במהירות החלקת כיסוי שנייה על הטיפה והקישו עליה קלות.

בעת הכנת תערובת ההזרקה, הקפד לרכז ולהעביר את חמשת המיקרוליטרים העליונים, נקיים מפסולת ומזהמים אחרים לצינור טרי לעומס הזרקה, תערובת הזרקה ופלסמיד ריק לתוך פיפטת הזרקה על ידי פעולה נימית. חצי מיקרוליטר מספיק בדרך כלל כדי להזריק 100 תולעים כדי להרחיב את הפתח על פיפטת ההזרקה לשפשף את קצהו בקצה החלקת כיסוי המותקנת על מגלשת זכוכית פנימה שמן Halo carbon 700. איכות הפתיחה היא קריטית.

הוא נשפט על פי צורת הקצה, והכי חשוב, על ידי קצב הזרימה, המוערך על ידי הזרימה ועל ידי גודל הבועות הנוצרות בקצה הפיפטה בתגובה ללחץ ההזרקה. כעת הניחו טיפה של שמן פחמן קדוש 700 על משטח הזרקה והעבירו מספר תולעים לכרית. השתמש במכוש תולעים כדי לדחוף את התולעים כלפי מטה על הכרית עד שהן נדבקות לארוס.

התולעים צריכות להיות מכוונות בשורות כשצידי הגחון שלהן מיושרים. הימנעו מלגעת בראשם. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים לא מצליחות להיצמד לרפיד, נסה כרית טרייה או הגדל את עובי האגרוס או את ריכוז הכרית.

כעת הכנס את הפיפטה לתולעת. ראשית, הזיזו את השלב כדי למקם את התולעת מתחת לפיפטה שנית. מקם את הפיפטה ליד הליבה המרכזית של בלוטת המין.

מכיוון שהציטופלזמה שלו משותפת לגרעיני תאי נבט רבים, זה משפר את הסבירות שה-DNA המוזרק יועבר לצאצאים. הפיפטה צריכה לשכב כמעט במקביל לתולעת. שלישית, הזיזו את הקצה אנכית לכיוון הגוף עד שהעור מדוכא.

לבסוף, הקש בעדינות על המניפולטור כדי לגרום להחדרת הקצוות. כעת הזריק את תמיסת ה- DNA. הפעל לחץ על הפיפטה עד שבלוטת המין מתנפחת.

ואז עצור את הזרימה ומשוך את התולעת מהפיפטה. בדוק את זרימת המחטים, ולאחר מכן הזריק את בלוטות המין האחרות לפני שתעבור לתולעת הבאה. לאחר ההזרקות הוסיפו לתולעים כ-10 מיקרוליטרים של חיץ התאוששות והמתינו עד שיתחילו לשחות.

לאחר השחייה, הוסף נפח שווה של M nine buffer. כאשר התולעים חוזרות לשחות, המשיכו להוסיף M 9 עד שהתמיסה תהיה ברובה M 9. כעת העבירו כל תולעת לצלחת יושבת.

אסוף תולעי GR במיליליטר אחד של M nine buffer בשפופרת בז של 50 מיליליטר. לאחר מכן באמצעות מאגר M תשע, שטפו את התולעים על ידי צנטריפוגה חוזרת והחלפת תמיסה עד שה-M 9 צלול לאחר הכביסה. לאחר מכן, הוסף 10 נפחים של תמיסת היפוכלוריט בסיסית לכינים.

התולעים הגלוליות דוגרות על התולעים בטמפרטורת החדר עד שכארבע חמישיות מהן נשברות, מה שלוקח בדרך כלל 10 דקות. עקוב אחר התגובה על ידי לקיחת aliquots לצפייה במיקרוסקופ. עצור את התגובה על ידי הוספת נפח שווה של מאגר ביצים סטרילי.

לאחר מכן אוספים את הביצים והפגרים על ידי צנטריפוגה בחום של 450 גרם למשך חמש דקות. הסר בעדינות את הסופרנטנט. מוסיפים בחזרה נפח שווה של מאגר ביצים וצנטריפוגה את הצינור שוב ב -450 גרם למשך חמש דקות.

חזור על ההליך עד שהמאגר נקי. כעת דגרו את הביצים למשך הלילה במאגר M 9, ולמחרת, זרעו אותן על צלחות NGM סטנדרטיות. מכינים כמה קוביות אגר, בערך חצי סנטימטר בצד.

משרים את נתחי האגר בתמיסה המכילה את חומר המשיכה הרצוי למשך שעתיים. הפקידו נתח אגר בלוחית בדיקה של 10 סנטימטר בה סומנו מיקום נקודת הבדיקה ונקודת בקרה. הכן חמש צלחות כאלה לכל ניסוי.

אפשר לצלחות ליצור שיפוע כימי על ידי השארתן למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס למחרת. לפני הניסוי, הוסף 10 מיקרוליטר של 20 מילי-מולרי נתרן אזיד לכל נקודה על הצלחות. זה משמש כחומר הרדמה.

התחל את הניסוי על ידי הצבת תולעים מסונכרנות גיל 20 במרכז הצלחת, ולאחר מכן הנחת הצלחת באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שעה ספרו את החיות במבחן על נקודות ביקורת וחישבו את מדד ה-CI. לאחר לירת תולעי גר וניקוי הביצים והפגרים כפי שתואר קודם לכן, השעו אותם מחדש בשני מיליליטר של מאגר ביצים סטרילי והוסיפו שני מיליליטר סוכרוז סטרילי של 60% במאגר הביצים.

לאחר מכן מערבבים את הצינור ביד או במערבולת עד שהביצים מושהות לחלוטין. צנטריפוגה את הביצים התלויות ב 450 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר מכן אוספים בזהירות את הסופרנטנט הממולא בביצה וזורקים את החיך כדי להסיר את שאריות הסוכרוז, משהים מחדש את הביצים במאגר הביצים ומצנטריפוגות אותן בחום של 450 גרם למשך חמש דקות.

אספו והשליכו בעדינות את חומר העזר ולאחר מכן חזרו על תהליך הניקוי שלוש פעמים ליד מכסה המנוע. השתמש במאגר ביצים סטרילי המכיל יחידה אחת למיליליטר של כיטינאז כדי להשעות מחדש את הביצים הגלולות. אפשר לביצים להתעכל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז התחל לעקוב אחר התגובה תחת מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך.

כאשר 70 עד 80% מקליפות הביצה מתעכלות, הוסף חמישה מיליליטר של מצע תרבית L 15 שלם או CM 15. כדי לבודד את התאים, נתק את התאים כך שלא ייווצרו גושים על ידי הזרמתם דרך מחט בגודל 27 כמה פעמים. כעת העבירו את התמיסה דרך מזרק עם פילטר של חמישה מיקרון.

גלולה את תרחיף התאים המנותק על ידי צנטריפוגה ב -450 גרם למשך 15 דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים הגלולים ב-CM 15. כדי לוודא שהתאים מנותקים, בדוק את ההשעיה במיקרוסקופ.

לבסוף, צלחו את התאים המנותקים על החלקות כיסוי זכוכית שצופו בעבר. בעזרת לקטין בוטנים ניתן לשמור על התאים בטמפרטורת החדר עם אוויר רגיל במשך יותר משבועיים. באמצעות טכניקות הטרנספורמציה שתוארו, תולעת טרנסגנית נבנתה כדי לבטא בטא 42 אנושי בנוירונים a SE, נוירונים המזהים מושכים מסיסים במים כגון ביוטין באמצעות בדיקת הכימוטקסיס.

תולעים טרנסגניות בנות שבעה ימים נבדקו. לקבוצת הביקורת לא הייתה בעיה למצוא ביוטין. לעומת זאת, רק תולעים בודדות המבטאות בטא 42 יכלו למצוא את הנקודה המושכת.

מדד הכימוטקסיס לביוטין היה 0.68 לעומת 0.12 עבור תולעי ביקורת וניסוי בהתאמה לאחר שלושה עד ארבעה ימים. הייתה גם ירידה קטנה אך ניכרת באינדקס. נוירון מתורבת A SER בגיל ארבעה ימים עדיין מבטא GFP לאחר תשעה ימי חיים.

עם זאת, הקרינה של GFP נעלמה ונחשד באפופטוזיס כדי לבחון את התיאוריה הזו. נוירונים ראשוניים של SER A הוכנו כמתואר והושלמו עם מעכב קספאז רחב ספקטרום. כצפוי, הטיפול עצר את אובדן הקרינה ואישר כי ביטוי A בטא 42 אנושי מעורר אפופטוזיס בנוירונים A SER.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות את התולעים הטרנסגניות האלגנטיות, ללמוד אותן במאמרים התנהגותיים, וכיצד להשיג תרבות ראשונית מאמברוז.