הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר מערכת מודל לחקר ההשפעות של תאורת לייזר אינפרא אדום על נוירונים שמיעתיים במבחנה. זה מושג על ידי הידוק טלאי, נוירונים שמיעתיים מתורבתים בכל תצורת התא על מנת לחקור את המאפיינים החשמליים שלהם. לאחר מכן, חשיפת הנוירונים לקרינת לייזר יכולה לעורר תגובות חשמליות בתא החשוף, אותן ניתן למדוד באמצעות מערך מהדק טלאי.

לאחר מכן ניתן לגוון את פרמטרי התאורה והמשתנים הסביבתיים על מנת לבחון את השפעותיהם על תגובות חשמליות הנגרמות על ידי לייזר. נוירוני השמיעה החשופים לאור הלייזר יציגו פעילות חשמלית חוזרת בתגובה לכל פולס לייזר לניתוח מאוחר יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המנגנונים העומדים בבסיס גירוי אינפרא אדום של נוירונים של גנגליון ספירלי.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גירוי אינפרא אדום של תאי גנגליון ספירליים באופן ספציפי, ניתן להרחיב אותה גם לסוגי תאים אחרים או למודלים פשוטים כגון שכבות דו-שכבתיות של שומנים כדי להבהיר עוד יותר את התהליכים הפיזיקליים המעורבים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה כדי להבטיח מיקום מדויק של הסיב האופטי של אספקת האור, מכיוון שהחשיפה לזוהר המתקבלת היא פרמטר קריטי, הכינו מיקרו פיפטות הקלטה עם התנגדות של שניים עד שישה מגה אוהם. ניתן לשלוף אותם מזכוכית סיליקט עם מושך לייזר CO2.

הכן את הלייזר המצמד לסיבים. מגוון רחב של סיבים אופטיים יעבוד. חיתוך סיב בתצורת כבל תיקון עם מחברי FCPC לשניים מייצר שתי חוליות סיבים עם מחבר בקצה אחד וסיבים חשופים בקצה השני.

אלה הצמות. הכן את קצה הדוב של צמה אחת על ידי הסרת מעיל הסיבים, ניקוי באתנול ודבקות בכלי מתאים מתחת למיקרוסקופ. בדוק שהקצה מאונך לציר הסיבים ושהוא נראה שטוח.

חבר את הקצה השני של צמת הסיבים לפלט לייזר הגירוי באמצעות מחבר דרך מתאים במידת הצורך. בשלב זה, הקפד תמיד למדוד את עוצמת הלייזר המוצא מהסיב. עשה זאת גם לאחר כל מניפולציה נוספת של הקצה.

כעת הכנס את הסיב לצ'אק וקבע את הצ'אק למיקום המיקרו המתאים. לאחר מכן, קבע את הזווית שהסיב האופטי יוצר עם החלקת כיסוי. צלם את הסידור וחשב את הזווית באמצעות תמונה J.כעת, אבטח את החיבורים המסנכרנים את הלייזר עם מערכת רכישת הנתונים של מהדק התיקון.

יש לחבר את הפלט הדיגיטלי ממערכת רכישת הנתונים של מהדק התיקון ללייזר באמצעות מחולל פונקציות חיצוני, מה שמאפשר לציין פרמטרים של דופק לייזר ללא תלות במערכת רכישת הנתונים, יש לחבר את האות המשמש להפעלת הלייזר בחזרה לכניסה של מערכת רכישת הנתונים כדי להבטיח שניתן יהיה לרשום את התזמון והאורך של פולסי הלייזר במקביל לאות האלקטרופיזיולוגי, הגדר את קצב הזרימה של מערכת הזלוף בין מיליליטר לשני מיליליטר לדקה. מערכת המוזנת בכוח הכבידה עם תנור מוטבע לחימום מהיר של התמיסה ומשאבה פריסטלטית להסרת תמיסה שהוצאה על ידי יניקה תעבוד. ובכן. הנח תלוש כיסוי עם תאים מתורבתים לתוך תא ההקלטה של מיקרוסקופ זקוף באמצעות מטרת טבילה במים בהגדלה גבוהה וניגודיות פאזה, אתר נוירון גנגליון ספירלי.

נוירון גנגליון ספירלי טיפוסי הוא עגול בהיר וקוטרו כ-15 מיקרון עם גרעין בולט. לאחר איתור תא עצב מתאים, עבור למטרה בהגדלה נמוכה יותר ואתר את נוירון המטרה. לאחר מכן השתמש במיקרו מיקום כדי להזיז את הסיב האופטי עד שהקצה קרוב לנוירון המטרה במישור האופקי והאנכי כאחד.

חזור למטרת ההגדלה הגבוהה ומקם את קצה הסיב האופטי במיקומו המיועד ליד הנוירון. בעת התאמת המיקום האנכי של הסיב, חשוב שהקצה התחתון של הסיב יונח על שפת הכיסוי. כדי למזער את אי הוודאות במיקום הסיב, ניתן לזהות את נקודת המגע באמצעות רמזים חזותיים בתמונת המיקרוסקופ.

לאחר שהסיב נמצא במקומו, הזיזו אותו החוצה בכמות ידועה לאורך ציר האורך שלו כדי לא להשפיע על מיקום המיקרו פיפטה. יש למלא את המיקרו פיפטה בתמיסה תוך-תאית ולהתאים אותה היטב למקומה על הראש stage של המגבר. בעזרת צינורות המחוברים לצד מחזיק המיקרו אלקטרודה, הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי כדי למנוע סתימה של המיקרו פיפטה.

בעזרת מניפולטור מיקרום, הזיזו את המיקרו-פיפטה למקומה ממש מעל נוירון המטרה והמשיכו ביצירת אטימה של ג'יגה אוהם. רשום את התנגדות סדרת קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה כפי שנקבעו מהעקומה האקספוננציאלית המותאמת לזרם. במהלך דופק בדיקת האיטום.

צמצם את טרנזיינט הקיבול על ידי כוונון פקדי ה-CP המהיר וה-CP האיטי במגבר. לאחר מכן העבר את המגבר למצב תא שלם ושנה את הקיבול ופיצוי ההתנגדות עד שנצפה זרם שטוח במהלך בדיקת SEAL. לאחר מכן, החל פיצוי התנגדות סדרתי עם תיקון של כ-70%, חיזוי של 70%, התאמת בקרות הקיבול וקיזוז ההתנגדות כדי לשמור על תגובת איטום בדיקה שטוחה.

לאחר מכן העבר את המגבר לזרם clamp מצב. שימו לב לפוטנציאל הממברנה במנוחה בהיעדר הזרקת זרם. כעת הגדר זרם החזקה כדי לייצב את פוטנציאל הממברנה ברמה הרצויה.

נטרל את קיבול הפיפטה והתאם את איזון הגשר כדי לאזן את נפילת המתח. בדוק את תכונות הירי של הנוירון על ידי גירוי בזרם דה-פולריזציה. בשלב זה, הזיזו את הסיב האופטי בחזרה למקומו ליד הנוירון באמצעות תוכנת הדמיה בשילוב עם מצלמת CCD ללכוד תמונות המתמקדות במישור הנוירון בתחילה ולאחר מכן להתמקד בקצה העליון של הסיב האופטי.

נתח את התמונות כדי לקבוע את ערך הדלתא, שהוא המיקום של הקצה העליון של הסיב האופטי ביחס למרכז נוירון המטרה. חשוב מאוד לדעת במדויק את מיקום הסיב האופטי. הסיבה לכך היא שהאנרגיה ליחידה, שטח או חשיפה לזוהר המועברת לתא המטרה היא פרמטר קריטי לגירוי עצבי אינפרא אדום, וזה יכול להיות מושפע באופן משמעותי ממיקום הסיב ביחס לתא.

לייזר זה הוא כוח אופטי הנשלט על ידי מחשב באמצעות כניסה ישירה ללייזר וניתן לציין אותו באופן ידני לפני כל הקלטה. ניתן לשלוט על אורך הדופק וקצב החזרה באמצעות מחולל הפונקציות כמתואר קודם לכן, ודא שהנתונים נרשמים הן מערוץ מהדק התיקון והן מערוץ ההדק של הלייזר פולסי לייזר של חצי עד 15 אלפיות השנייה ב-0.25 עד חמש. מיליג'אול מניב בדרך כלל תגובות חשמליות מדידות. בתחילה.

זה עשוי להיות שימושי להגדיר את קצב החזרה של פולסי לייזר להרץ אחד או פחות כדי למזער השפעות לא רצויות. לאחר הגדרת כל פרמטרי הלייזר. המשך באיסוף הנתונים.

נוירונים של גנגליון ספירלי מגיבים לתאורת לייזר עם צורות גל הניתנות לחזרה הן במהדק מתח והן במהדק זרם הקלטת תצורות בתגובה לפולסי לייזר של 2.5 אלפיות שנייה 0.8 מילי-ג'אול. תא טיפוסי מייצר זרם פנימה נטו בפוטנציאל החזקה שונים. רישומי מהדק נוכחיים מראים דפולריזציה קבועה של הממברנה במהלך פולסי הלייזר הללו, ואחריה ירידה אקספוננציאלית בערך לכיוון פוטנציאל הממברנה במנוחה לאחר הדופק.

במקרים מסוימים, יש גם דפולריזציה קטנה נוספת של הממברנה בעקבות דופק הלייזר. הארה באנרגיה מוגזמת או חשיפה לעלייה גדולה בטמפרטורה עלולה לגרום לנזק לתאים שנצפה כתוצאה מהידרדרות התכונות החשמליות של התא או מוות מיידי של תאים. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לגוון מגוון של פרמטרים סביבתיים כגון טמפרטורת התמיסה או גורמים כימיים כדי לבדוק את השפעתם על הפעילות החשמלית המושרה בלייזר.

אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט אמצעי זהירות סטנדרטיים. אלה כוללים שימוש במשקפי בטיחות לייזר, שלטי אזהרה ולוודא שהקרן לא מצטלבת בטעות עם משטחים מחזירי אור במיוחד.