Name: הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: חקור את השפעת תאורת לייזר אינפרא-אדום על נוירונים שמעיים באמצעות שיטת patch clamp בתצורת whole cell. למד כיצד גירוי אינפרא-אדום מעורר תגובות חשמליות הניתנות למדידה ומוביל להבנת מנגנוני גירוי עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי תחת הצמדת פרויקט מענק LP120100264.

<ol><li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).</li>
<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+with+optical+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li>
<li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Bec, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li>
<li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li>
<li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li>
<li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+the+facial+nerve%3A+A+new+monitoring+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li>
<li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+pacing+of+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effects+of+acute+and+chronic+deafening%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li>
<li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation%3A+A+study+of+pulse+duration%2C+repetition+rate%2C+and+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li>
<li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li>
<li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li>
<li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).</li>
<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי. פרמטרים גירוי לייזר כגון אורך גל, דופק אנרגיה, אורך הפולס, צורת דופק, ורצפי חזרה דופק ניתן ללמוד במסגרת שחזור. בנוסף, הסביבה שבה תאי העצב נשמרים (טמפרטורת פתרון למשל, גורמים כימיים) יכולה להיות שיטתי ...

תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של ​​תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת 1. בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך 2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) 3 או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) 4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח&quot;י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית 2 מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח&quot;י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור. כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח&quot;י 5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח&#39;. 7 להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח&#39;. 5 טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה. למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות 5,7-9) חקרו אח&quot;י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל 1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול 10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח&quot;י. דו&quot;ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה. טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי 19 הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה. הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח&quot;י.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>חומרים וציוד לתרבית תאים</חזק> </td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 4 טבעות </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-אורניתין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>מעוקל מלקחיים</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 פינצטה (45& מעלות; קצה זווית)</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td></td><td>ThermoScientific Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 1. חומרים וציוד לתרבית תאים.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal media</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 ללא סרום</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תמיסה תוך-תאית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן D-גלוקונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק> תמיסה חוץ-תאית</חזקה> </td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>טבלה 2. פתרונות לתרבית תאים ומהדק תיקון.</חזק> א) מדיה נוירו-בזאלית. ב) פתרון תוך-תאי. ג) פתרון חוץ-תאי.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>מצויד בניגודיות Dodt </td></tr><tr><td>מטרת טבילה במים</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמה ושלב XY </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh תא הקלטה גיברלטר</td><td></td></tr><tr><td></td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי אבחון</td> <td>מצלמת CCD</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מצלמה</td><td>מכשירי אבחון</td><td>SPOT מחמם פתרון בסיסי</td><td></td></tr><tr><td>בשורה</td><td>וורנר</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>וורנר</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>מהדק תיקון מערכת רכישת נתונים</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי סאטר זכוכית מיקרופיפטה</td><td></td><td>GBF100-58-15</td><td>זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הקלטה</td> חבילת מעבדת <td>AxoGraph</td><td></td><td>ו כלים אלקטרופיזיולוגיים</td></tr><tr><td>בקבוק שואב</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS12201L</td><td>בקבוק שואב פיירקס 1 ליטר, עם יציאה לצינורות</td></tr><tr><td>צינורות PE</td><td>הרווארד</td><td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>טבלה 3.ציוד מהדק תיקון.</חזק></td></tr><tr><td>1,870 ננומטר דיודת לייזר</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &mu; כבל תיקון סיבים אופטיים מולטי-מוד בקוטר m (FC/PC)</td> <td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td><td>סיבים אופטיים לאספקת אור, ליבת סיליקה וחיפויים, 0.22 NA</td></tr><tr><td>סיבים אופטיים דרך מחבר (FC/PC)</td> <td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>קליבר סיבים אופטיים</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>כלי הפשטת סיבים אופטיים (0.25 - 0.6 מ"מ) </td><td>סימנס</td> להסרת מעטפת סיבים אופטיים <td></td><td></td></tr><tr><td>כלי הפשטת סיבים אופטיים (0.6 - 1.0 מ"מ)</td><td>סימנס</td><td></td><td>להסרת ציפוי חיצוני של כבל תיקון</td></tr><tr><td>מחולל</td><td></td><td></td> אותות <td>כל מחולל אותות שיכול להפיק את צורות הדופק הדרושות ומסוגל להיות מופעל חיצונית</td></tr><tr><td>מיקום</td><td></td><td></td> סיבים אופטיים <td>בהתאמה אישית. יכול להחליף במיקרופוזיציה סטנדרטית המשמשת לניסויי מהדק תיקון</td></tr><tr><td>צ'אק סיבים אופטיים</td><td>ניופורט</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח לייזר וראש גלאי</td><td>קוהרנטי</td><td>FieldMate (מד כוח) עם LM-3 (ראש גלאי)</td><td></td></tr> <tr><td colspan="4" ><חזק>טבלה 4. ציוד לייזר.</חזק></td></tr></tbody></table>

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח&quot;י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.

נוירונים הגנגליון ספירלה להגיב לתאורת לייזר עם צורות גל הדיר בשני תצורות הקלטה נוכחי, מהדק מתח ומהדק. 3a איור מראה שינויים אופייניים בזרימה הנוכחית על פני קרום תא בתגובה ל2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר, שחזרו במרווחים של 1 SEC) עם פוטנציאל הממברנה שנערך ב -70 mV, ו-60 mV -50 mV. זרמים פנימה נטו עוררו באופן עקבי בתגובה לפעימות לייזר, וחזרו לערכים ההתחלתיים לאחר ההארה חדלה. הצורה של הזרמים המושרה לייזר ניתן לראות להשתנות כפוטנציאל ...

גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מערכת מודל לבחינת ההשפעות של הקרנת לייזר באינפרא-אדום על נוירונים שמיעתיים in vitro. דבר זה מושג באמצעות patch clamping של נוירונים שמיעתיים מתורבתים בתצורת תא שלם (whole cell configuration) כדי לחקור את מאפייניהם החשמליים. לאחר מכן, חשיפת הנוירונים להקרנת לייזר עשויה לעורר תגובות חשמליות בתא החשוף, אותן ניתן למדוד באמצעות מערך patch clamp.ניתן להוarias את פרמטרי התאורה והמשתנים הסביבתיים כדי לבחון את השפעתם על תגובות חשמליות המושרות על ידי לייזר. הנוירונים השמיעתיים שנחשפו לאור הלייזר יפגינו פעילות חשמלית הניתנת לשחזור בתגובה לכל פולס לייזר לצורך ניתוח מאוחר יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע למנגנונים העומדים בבסיסה של גרייה באינפרה-אדום של נוירוני הגנגליון הספירלי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גרייה באינפרא-אדום של תאי הגנגליון הספירלי באופן ספציפי, ניתן להרחיב אותה לסוגי תאים אחרים או למודלים מפושטים יותר, כגון שכבות ליפיד דו-שכבתיות, כדי להבהיר עוד יותר את התהליכים הפיזיקליים המעורבים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא חשובה כדי להבטיח מיקום מדויק של הסיב האופטי להולכת האור, מאחר שחשיפת הקרינה שנוצרת היא פרמטר קריטי. הכינו מיקרו-פיפטות להקלטה עם התנגדות של 2 עד 6 mega ohms. ניתן למתוח אותן מזכוכית בורוסיליקאט באמצעות שובך לייזר CO2.הכינו את הלייזר המחובר לסיב. מגוון רחב של סיבים אופטיים יתאימו למשימה. חיתוך של סיב בתצורת כבל חיבור (patch cord) עם מחברי FCPC לחצי, ייצור שני מקטעי סיב עם מחבר בקצה אחד וסיב חשוף בקצה השני.אלו הם ה-pigtails. הכין את הקצה החשוף של pigtail אחד על ידי הסרת מעטפת הסיב, ניקוי באתנול ושבירה (cleaving) באמצעות כלי מתאים תחת מיקרוסקופ. ודא שהקצה ניצב לציר הסיב ושהוא נראה שטוח.חבר את הקצה השני של ה-fiber pigtail למוצא של לייזר הגירוי, תוך שימוש במחבר מעבר מתאים במידת הצורך. בנקודה זו, הקפד תמיד למדוד את הספק הלייזר במוצא הסיב. בצע זאת גם לאחר כל מניפולציה נוספת של הקצה.כעת הכניסו את הסיב לתוך תפס (chuck) וחברו את התפס לממקם המיקרו (micro positioner) המתאים. לאחר מכן, קבעו את הזווית שיוצר הסיב האופטי עם לוחות הכיסוי (cover slip). צלמו את הסידור וחשבו את הזווית באמצעות Image J. כעת, הדקו את החיבורים המסנכרנים את הלייזר עם מערכת רכישת הנתונים של ה-patch clamp.יש לחבר את הפלט הדיגיטלי ממערכת רכישת הנתונים של ה-patch clamp ללייזר באמצעות מחולל פונקציות חיצוני, באופן שמאפשר להגדיר את פרמטרי פולס הלייזר באופן בלתי תלוי במערכת רכישת הנתונים; יש לחבר את האות המשמש להפעלת הלייזר חזרה לכניסה של מערכת רכישת הנתונים כדי להבטיח שניתן יהיה להקליט את התזמון ואת משך פולסי הלייזר בו-זמנית עם האות האלקטרופיזיולוגי. הגדירו את קצב הזרימה של מערכת הפרפוזיה לבין 1 ו-2 milliliters per minute. מערכת המבוססת על כוח הכבידה הכוללת מחמם שורה (inline heater) לחימום מהיר של התמיסה ומשאבה פריסטלטית לסילוק התמיסה המשומשת באמצעות שאיבה תעבוד היטב. הניחו לבידה עם תאים מתורבתים בתוך תא ההקלטה של מיקרוסקופ אנכי תוך שימוש בעדשה שקועה במים בהגדלה גבוהה ובניגודיות פאזה (phase contrast), ואתרו נוירון של הגנגליון הספירלי (spiral ganglion neuron).נוירון טיפוסי של גנגליון ספירלי נראה כעיגול בהיר בקוטר של כ-15 מיקרון עם גרעין בולט. לאחר איתור נוירון מתאים, עברו לעדשה עם הגדלה נמוכה יותר ואתרו את נוירון המטרה. לאחר מכן, השתמשו במיקרו-מיקם (micro positioner) כדי להזיז את הסיב האופטי עד שהקצה יהיה קרוב לנוירון המטרה הן במישור האופקי והן במישור האנכי.חזרו לעדשה עם ההגדלה הגבוהה ומקמו את קצה הסיב האופטי במיקום המיועד לו לצד הנוירון. בעת כיוון המיקום האנכי של הסיב, חשוב שהקצה התחתון של הסיב ינוח על שפת מכסה הזכוכית (cover lip). כדי למזער את אי-הוודאות במיקום הסיב, ניתן לזהות את נקודת המגע באמצעות סימנים חזותיים בתמונת המיקרוסקופ.לאחר שהסיב נמצא במיקומו, הזז אותו החוצה בכמות ידועה לאורך הציר האורכי שלו, כדי לא להשפיע על מיקום המיקרו-פיפט. יש למלא את המיקרו-פיפט בתמיסה תוך-תאית ולהתקינו בבטחה בראש המגבר (head stage). באמצעות צינור המחובר לצדו של מחזיק המיקרו-אלקטרודה, הפעל לחץ חיובי קטן כדי למנוע סתימה של המיקרו-פיפט.באמצעות מניפולטור מיקרוסקופי, העבירו את המיקרו-פיפט למיקום שמעל הנוירון המטרה והמשיכו ביצירת אטום גיגה-אוהם (giga ohm seal). רשמו את קיבול הממברנה, ההתנגדות טורית וההתנגדות לכניסה, כפי שנקבעו מהעקומה המעריכית שהותאמה לזרם במהלך פולס בדיקת האטום.יש למזער את תגובת הקיבוליות העוברת (capacitance transient) על ידי כיוונון בקרות ה-CP fast וה-CP slow במגבר. לאחר מכן, העבירו את המגבר למצב whole cell וכוונו את פיצוי הקיבוליות וההתנגדות עד להשגת זרם שטוח במהלך בדיקת ה-SEAL. בשלב הבא, החילו פיצוי התנגדות טורית עם כ-70% correction ו-70% prediction, תוך התאמת בקרות פיצוי הקיבוליות וההתנגדות כדי לשמור על תגובת seal שטוחה בבדיקה.לאחר מכן, העבירו את המגבר למצב current clamp. רשמו את פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה בהיעדר הזרקה של זרם. כעת, הגדירו זרם החזקה (holding current) כדי לייצב את פוטנציאל הממברנה ברמה הרצויה.בצעו נטרול של קיבול הפיפטה (pipette capacitance) וכיילו את מאזן הגשר (bridge balance) כדי לאזן את מפל המתח. בדקו את תכונות הפריקה של הנוירון באמצעות גרייה בזרם דפולריזציוני. בשלב זה, החזירו את הסיב האופטי למיקומו לצד הנוירון באמצעות תוכנת הדמיה המחוברת למצלמת CCD; צלמו תמונות הממוקדות בתחילה במישור של הנוירון ולאחר מכן בקצה העליון של הסיב האופטי.נתחו את התמונות כדי לקבוע את ערך הדלתא (delta), המייצג את מיקום הקצה העליון של הסיב האופטי ביחס למרכז הנוירון המטרה. חשוב מאוד לדעת במדויק את מיקומו של הסיב האופטי. זאת מכיוון שהאנרגיה ליחידת שטח, או החשיפה לקרניאנס (radiance exposure) המסופקת לתא המטרה, היא פרמטר קריטי עבור גרייה עצבית באינפרא-אדום, ופרמטר זה עלול להיות מושפע משמעותית ממיקומו של הסיב ביחס לתא.ההספק האופטי של לייזר זה נשלט על ידי מחשב באמצעות קלט ישיר ללייזר וניתן להגדרתו ידנית לפני כל הקלטה. ניתן לשלוט באורך הפולס ובקצב החזרות באמצעות מחולל הפונקציות כפי שתוּאר קודם לכן; ודאו שהנתונים מוקלטים הן מערוץ ה-patch clamp והן מערוץ הטריגר של הלייזר. פולסי לייזר של 0.5 עד 15 millisecond בהספק של 0.25 עד 5 millijoules מניבים בדרך כלל תגובות חשמליות מדידות בתחילה.ייתכן שיהיה מועיל להגדיר את קצב החזרת פולסי הלייזר ל-1 Hz או פחות, כדי למזער השפעות לא רצויות. לאחר שהגדרת את כל פרמטרי הלייזר, התחל באיסוף הנתונים.נוירונים של הגנגליון הספירלי מגיבים להארה בלייזר עם צורות גל עקביות הן בתצורות הקלטה של קיבוע מתח (voltage clamp) והן בתצורות של קיבוע זרם (current clamp), בתגובה לפולסי לייזר של 2.5 millisecond ו-0.8 millijoules. תא טיפוסי מייצר זרם פנימה נטו בפוטנציאלי החזקה שונים. הקלטות בקיבוע זרם מראות דפולריזציה קרומית רציפה במהלך פולסי לייזר אלו, ולאחריה ירידה מעריכית בקירוב לעבר פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה לאחר הפולס.במקרים מסוימים, קיימת גם דפולריזציה ממברנלית נוספת וקטנה בעקבות פולס הלייזר. הארה באנרגיה מופרזת או חשיפה לעליות טמפרטורה משמעותיות עלולות להוביל לנזק תאי, הנצפה בהידרדרות של התכונות החשמליות של התא או במוות תאי מיידי. על ידי ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לשנות מגוון של פרמטרים סביבתיים, כגון טמפרטורת התמיסה או גורמים כימיים, כדי לבחון את השפעתם על פעילות חשמלית מושרית בלייזר.אין לשכוח כי עבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט באמצעי בטיחות סטנדרטיים. אלה כוללים שימוש במשקפי מגן לייזר, שילוט אזהרה, ווידוא שהקרן אינה נחתכת בטעות במשטחים מחזירי אור באופן משמעותי.

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים את טכניקת מהדק המדבקה למדידת זרמים יוניים בגופי תאי נוירון חושיים באוזן הפנימית. הוא מפרט את ההכנה והשימוש בפיפטת מהדק טלאי מלוטשת מלאה בתמיסה פנימית המכילה אמפוטריצין B, המנקב את הממברנה כדי לאפשר תנועת יונים תוך שמירה על התנאים התוך-תאיים. פולסי מתח מופעלים כדי להפעיל ולתעד את פעילות תעלת היונים, ומספקים תובנות לגבי תכונותיהם והתנהגותם.

הקלטות מהדק טלאי מחורר של גופי תאי עצב חושיים באוזן הפנימית

סרטון זה מדגים את בחינת עוררות תאי העצב התחושתיים בגרעיני השורש הגבי באמצעות טכניקת מהדק טלאי כדי למדוד את בסיס הריאוס ואת פוטנציאל הממברנה, תוך ניתוח תגובות הנוירונים לזריקות זרם מצטבר.

הקלטות מהדק טלאי של תא שלם על גרעיני שורש גבי חולדה שלמים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

חקור את השפעת תאורת לייזר אינפרא-אדום על נוירונים שמעיים באמצעות שיטת patch clamp בתצורת whole cell. למד כיצד גירוי אינפרא-אדום מעורר תגובות חשמליות הניתנות למדידה ומוביל להבנת מנגנוני גירוי עצבי.

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

גלה סרטונים נוספים