מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (

פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקות חדשניות להשקתה (knock down) סימולטנית של שני גנים בדבורי דבש בוגרות, ולאחר מכן ביצוע בדיקת תגובת פריסת חוטם (PER assay) למדידת ההשפעה של השהקתת הגנים הכפולה על התפיסה הטעמית של דבורי הדבש. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של RNAs רב-גדיליים, המכוונים לגנים של שלושה חלבונים: vitelli, genin, ultras, spherical, וחלבון פלואורסצנציה ירוק.

כיוון שהגן המקודד ל-GFP אינו נמצא בגנום של דבורת הדבש, ה-RNA דו-גדילי של GFP משמש כביקורת שלילית. השלב השני הוא הזרקת RNA דו-גדילי לדבורי דבש באמצעות ארבע אסטרטגיות טיפול: הזרקה של RNA דו-גדילי של GFP בלבד; הזרקה בודדת של תערובת RNA דו-גדילי של VG ו-USP; הזרקה של RNA דו-גדילי של vg ביום הראשון, ולאחריה הזרקה של RNA דו-גדילי של USP ביום השני; והזרקה של RNA דו-גדילי של USP ביום הראשון, ולאחריה הזרקה של RNA דו-גדילי של VG ביום השני. לאחר ההזרקות, סומנו הדבורים בנקודות צבע מקודדות בהתאם לטיפולים והוחזרו לכוורת.

שישה ימים לאחר מכן, השהיית הביטוי (knockdown) של הגנים VG ו-USP בדבורים המטופלות מאומתת באמצעות real-time PCR, והשפעתו של knockdown כפול של VG ו-USP על התפיסה הטעמית נקבעת באמצעות בדיקת PER. לבסוף, נמצא כי לדבורים עם knockdown כפול יש ירידה משמעותית בביטוי של הגנים VG ו-USP ועלייה משמעותית בתפיסה הטעמית לסוכרוז. ההשבשה שביצענו היא כלי רב עוצמה שבו אנו יכולים להשתמש כדי לחשוף תפקודי גנים.

בדרך כלל משתמשים בשיטה זו כדי להתמקד בגן בודד. עם זאת, גנים הם חלק מרשת רגולטורית מורכבת. דרך אחת שבה נוכל להבין טוב יותר כל תהליך ביולוגי היא ללמוד כיצד גנים מקיימים אינטראקציה עם רשת גנים.

כדי לעשות זאת, עלינו לבצע מניפולציה של מספר גנים בו-זמנית. עד כה, יכולנו להשתיק גן אחד בלבד בכל פעם בחרקים; כאן, בפעם הראשונה, אנו רוצים להראות לכם כיצד לבצע knockdown לשני גנים בדבורי דבש במקום לאחד. רפלקס הרחקה של ה-SCU, או PER, הוא טכניקה שימושית מאוד למדידת תפיסה טעמית, המהווה מנבא התנהגותי להתנהגות חברתית של דבורי דבש.

לדוגמה, דבורי קן בעלות תפיסה טעמית גבוהה, מבשילות מבחינה התנהגותית במהירות, יוצאות לאסוף מזון בשלב מוקדם של חייהן, ומעדיפות לאסוף אבקה. כדי להתחיל בהליך זה, תכננו פריימרים של RNAs דו-גדיליים המכוונים לגנים המיועדים להשתקה (knockdown) באמצעות התוכנה החינמית primer.Three. בניסוי זה, שני הגנים המיועדים להשתקה הם vitelli, genin, או VG ו-ultras spherical או USP.

בנוסף לעיצוב של VG ו-USP, תוכננו פריימרים עבור RNA דו-גדילי המכוון לגן בקרה המקודד לחלבון פלואורסצנציה ירוקה, או GFP, אשר אינו קיים בגנום של דבורת הדבש. לאחר מכן, סינתזת ה-RNA הדו-גדילי עבור VG, USP ו-GFP בוצעה באמצעות תמלול in vitro תוך שימוש במערכת RibMax T7 לייצור RNA מבית Promega.

לאחר טיהור ה-RNAs בעלי הגדיל הכפול באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות, המיסו כל משקע של RNA דו-גדילי במים נטולי נוקלאז. כדי להבטיח את יעילות ההשתקה של הגן, ריכוז ה-RNA הדו-גדילי צריך להיות סביב 9 עד 10 µg/µL. כדי להכין את הדבורים להזרקה, קררו דבורים שזה עתה בקעו במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך דקה אחת עד שתיים. ברגע שהדבורים מקובעות, הצמידו שלוש עד ארבע דבורים במקביל על צלחות פטרי מלאות בשעווה מוצקה, כאשר סיכות לחרקים חוצות בין הבטן לחזה שלהן.

קררו שוב את הדבורים במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך כדקה עד שתיים. ודאו שהדבורים אינן נעות כלל. הדבורים צריכות להיראות רפויות, ולא מכווצות או מעוותות.

קיבוע מלא הוא חשוב, כיוון שכל תנועה עלולה להגדיל את גודל הפצע ואת התמותה. דבורים שהן מכופפות או מעוותות קוררו למשך זמן רב מדי ואין להשתמש בהן בשל שיעור תמותה גבוה. הרכיבו מחט חד-פעמית במידה 30 gauge על מזרק מיקרו של Hamilton.

מלאו את המזרק ב-3 µL של RNA דו-גדילי וודאו שאין בועות אוויר במזרק. אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה בודדת, מלאו את המזרק בתערובת של ה-RNA הדו-גדילי של שני הגנים. אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה של יומיים, מלאו את המזרק באחד משני סוגי ה-RNA הדו-גדילי.

החדירו את המחט לצד הבטן. כדי למנוע נזק לאיברים פנימיים, לחצו על בוכנת המזרק לאט כדי לאפשר את ספיגת ה-double stranded RNA. מכיוון ש-double stranded RNA הוא צמיגי מאוד, נדרשות שתי עד שלוש שניות כדי להוציא אותו לחלוטין מהמזרק.

לאחר לחיצה מלאה על הבוכנה, השאירו את המחט בפצע למשך ארבעה עד חמישה שניות. עקבו אחר הדבורים למשך שלוש עד חמש שניות לאחר ההזרקות. אם דליפת טיפת המולימפה מהפצע, השליכו את הדבורה; סמנו את התורקס של הדבורים בצבעים שונים התואמים לטיפולים השונים.

בשלב זה, אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה בודדת, יש להשגיח על הדבורים במשך שעה אחת בתוך מיכל שסופק בו דבש, ולאחר מכן להחזירן למושבה. עם זאת, אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה של יומיים ורק ה-double stranded RNA הראשון הוזרק, יש להניח את הדבורים בכלוב רשת גלילי שסופק בו דבש בצד. יש לשמור את הדבורים באינקובטור בטמפרטורה של 34 °C ובלחות של 80% למשך הלילה ועד ליום המחרת.

הזריקו לדבורים את ה-RNA דו-גדילי השני, תוך שימוש באותו נוהל שבו נעשה שימוש עבור ה-RNA דו-גדילי הראשון. אפשרו לדבורים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך שעה בתוך מיכל עם דבש זמין, ולאחר מכן החזירו אותן למושבה. שישה ימים לאחר ההזרקות, אספו את הדבורים המטופלות מהמושבה, ללא שימוש במכשיר עישון לפתיחת הכוורת.

לא נעשה שימוש בעשן מכיוון שהוא עלול להשפיע על התפיסה הגסטטורית (טעם) של הדבורים, אשר תיבדק בהליך זה. אספו דבורים לתוך כלובים בצורת גליל מרשת מתכת באמצעות פינצטה רכה, תוך השמה של לא יותר משלוש דבורים לכל כלוב, לצורך ביצוע בדיקת ה-PER.

קררו את הדבורים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד שיהיו מוטמעות לחלוטין. הצמידו כל דבורה בצורה אנכית לתוך פרובטת פלסטיק, שתוכננה במיוחד עבור PER. השתמשו בסרט דבק כדי להחזיק את הבטן בתוך הפרובטה ולהשאיר את הראש בולט ממנה.

הניחו את המבחנות על מתאם בעל שתי שורות של עמודי פלסטיק קטנים. אחת השורות ממוספרת כדי שניתן יהיה להקצות מספר זיהוי לדבורים המורכבות. הכניסו את המתאמים עם הדבורים שעברו טיפול לאינקובטור בטמפרטורה של 34 °C ובלחות של 80% למשך שעתיים בזמן שהדבורים עוברות אינקובציה.

הכינו סדרה של תמיסות סוכרוז במים. העבירו את התמיסות למזרקים עם מחטים בכיול 15 עד 20 gauge עבור בדיקת ה-PER.

הדבורים נבדקות בקבוצות. ראשית, נגעו במחוש של כל דבורה עם טיפה של תמיסת 0%, שהיא מים, ולאחר מכן בצעו בדיקה עם תמיסות סוכרוז בריכוזים של 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ו-30%. השאירו לפחות שתי דקות של מרווח בין כל תמיסת מים.

בדרך כלל נדרשות כשתי דקות לבדיקת 20 דבורים באמצעות ריכוז אחד של סוכרוז. לכן, תמיד צריכות להיות יותר מ-20 דבורים בכל קבוצה. אם דבורה פולשת את ה-proboscis שלה במלואה, הדבר נספר כתגובה חיובית. בזמן אמת.

ניתוח PCR אישש כי הן אסטרטגיית ההזרקה הבודדת והן אסטרטגיית ההזרקה ביומיים הפחיתו באופן משמעותי את רמות התעתוק של Fiji ו-USP בדבורי דבש. שישה ימים לאחר ההזרקה של ה-RNA דו-גדילי, בגרפים אלה, ה-RQ מציין את רמת הכימות היחסי של תעתוקי הגן המטרה, והאותיות השונות מעל העמודות מציינות הבדלים מובהקים בין קבוצות הטיפול. ניתוח post-hoc גילה כי דיכוי תעתוק USP באמצעות הזרקה בודדת של תערובת RNA דו-גדילי והזרקה ביומיים שבה VG הוזרק ראשון ו-USP שני, היה נמוך באופן משמעותי מהזרקה ביומיים שבה USP הוזרק ראשון ו-VG שני.

דבר זה מעיד על כך ש-VG עשוי להיות ווסת מרכזי בלולאת הבקרה של VG והורמון הנעורים. מדדי התגובה של GUA או ה-GRS עבור הדבורים שעברו טיפול חושבו מתוצאות של מבחן תגובת פרישת השפה (proboscis extension response) או מבחן PER כפי שמוצג כאן. ה-GRS בדבורים שהוזרקו תערובת של RNA דו-גדילי עבור VG ו-USP היה גבוה משמעותית מה-GRS בדבורי הביקורת שקיבלו GFP, מה שמעיד על כך שהדבורים עם ה-double knockdown היו רגישות יותר לסוכרוז.

האותיות השונות מעל העמודות מצביעות על הבדלים מובהקים בין קבוצות הטיפול. מוצגת כאן רשת רגולטורית אפשרית בין vi genin ultras, spherical, ו-juvenile hormone שנחשפה על ידי השתקה סימולטנית של הגנים VG ו-USP. בעוד ש-knockdown בודד של USP אינו גורם לשינוי כלשהו ב-juvenile hormone, double knockdown של VG ו-USP גורם לעלייה גדולה יותר ב-juvenile hormone מאשר knockdown בודד של VG.

דבר זה מרמז כי vitelli לא רק מעכב את ייצור ההורמון הגדילתי (juvenile hormone), אלא מעכב תגובת משוב של ההורמון הגדילתי ל-knockdown של USP. ב-double knockdowns, העלייה הדרמטית בייצור ההורמון הגדילתי נובעת מעיכוב מופחת של VI genin הנגרם על ידי knockdown של VG, ומתגובה מפיתה להפחתה בהעברת המסר של ההורמון הגדילתי הנגרמת על ידי knockdown של USP. דיון מפורט יותר ברשת בקרה זו מופיע בטקסט של הפרוטוקול הנלווה.

באמצעות שימוש בגישה של השתקה כפולה של גנים, חשפנו קשר מפורט בין הגנים vital, ultras, spherical ו-juvenile hormone, קשר שלא היינו מגלים לו היינו מדכאים גן אחד בלבד. כעת, באמצעות שימוש בטכניקה זו, חוקרים יכולים לבחון את יחסי הגומלין בין גנים בתוך רשתות בקרה. PR היא שיטה סטנדרטית המשמשת למדידת תפיסה טעמית בדבורי דבש, עם זאת, היא רגישה מאוד לאופן הטיפול, ולכן יש לנקוט זהירות רבה בשמירה על עקביות בין הסביבה לבין הטיפול בבעלי החיים.

בנוסף, אם הניסוי יבוצע לאורך מספר ימים, מומלץ לנהל לוח זמנים קצר ולעקוב כדי לוודא שהמזג האוויר והסביבה אינם משתנים.