מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש ( אפיס mellifera)

פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקות חדשות להפיל בו זמנית שני גנים בדבורי דבש בוגרות ולאחר מכן לבצע תגובת הרחבת פרובוס או בדיקת PER כדי למדוד את ההשפעה של הפלת הגן הכפול. על תפיסת טעם של דבורת דבש. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של RNA דו-גדילי, המכוון לגנים של שלושה חלבונים, ויטלי, ג'נין, אולטראס, כדורי וחלבון פלואורסצנטי ירוק.

מכיוון שהגן המקודד GFP אינו נמצא בגנום של דבורת הדבש, ה-RNA הדו-גדילי GFP משמש כבקרה שלילית. השלב השני הוא הזרקת RNA דו-גדילי לדבורי דבש באמצעות ארבע אסטרטגיות טיפול. הזרקה עם GFP כפול גדילי, RNA לבדו, הזרקה בודדת עם VG ו-USP כפול גדילי, הזרקת תערובת RNA עם RNA כפול גדילי vg ביום הראשון, ולאחר מכן הזרקה עם RNA דו-גדילי USP ביום השני, והזרקה עם RNA דו-גדילי USP ביום הראשון, ולאחר מכן הזרקה עם RNA כפול VG ביום השני לאחר שההזרקות סימנו את הדבורים בנקודות צבע מקודדות צבע המתאימים לטיפולים והחזרתם לכוורת.

שישה ימים לאחר מכן, הפלת הגנים VG ו-USP בדבורים המטופלות מאומתת על ידי PCR בזמן אמת וההשפעה של נוקדאון כפול של VG ו-USP על תפיסת הטעם נקבעת על ידי בדיקת PER. בסופו של דבר הוכח כי לדבורים כפולות יש הפחתה משמעותית בביטוי הגנים VG ו-USP ועלייה משמעותית בתפיסת הטעם לסוכרוז. ההתערבות שלנו היא כלי רב עוצמה שאנו יכולים להשתמש בו כדי לחשוף תפקודי גנים.

הוא משמש בדרך כלל כדי למקד גן בודד. עם זאת, גנים הם חלק מרשת רגולטורית מורכבת. אחת הדרכים שבהן אנו יכולים להבין טוב יותר כל תהליך ביולוגי היא ללמוד כיצד גנים מתקשרים עם רשת גנים.

כדי לעשות זאת, עלינו לתמרן מספר גנים בו זמנית. עד כה, הצלחנו להפתיע רק גן אחד בכל פעם בחרקים כאן בפעם הראשונה, אנו רוצים להראות לכם כיצד להפיל שני G בדבורי דבש במקום אחד. רפלקס ההרחבה של SCUs או PER הוא טכניקה שימושית מאוד למדידת תפיסת טעם, המהווה מנבא התנהגותי להתנהגות חברתית של דבורי דבש.

לדוגמא, דבורי קן עם תפיסת טעם גבוהה, מתבגרות מהר מבחינה התנהגותית, מתעצבות מוקדם בחיים ומעדיפות לאסוף אבקה. כדי להתחיל בהליך זה, תכנן פריימרים של RNA דו-גדילי המכוון לגנים להפלה באמצעות פריימר התוכנה החינמית. שלוש. בניסוי זה, שני הגנים המיועדים להפלה הם ויטלי, ג'נין או VG ואולטראס כדורי או USP.

בנוסף לתכנון VG ו-USP, פריימרים של RNA דו-גדילי מכוונים לגן בקרה המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP, שאינו נמצא בגנום של דבורת הדבש. לאחר מכן תקיעה כפולה. סינתזת RNA עבור VG USP ו-GFP מושגת על ידי שעתוק חוץ גופי באמצעות מערכת ייצור ה-RNA של צלעות מקס T שבעה מבית Promega.

לאחר טיהור ה-RNA הדו-גדילי באמצעות נהלים סטנדרטיים ממיסים כל כדור RNA דו-גדילי במים נטולי נוקלאז על מנת להבטיח את יעילות הפחתת הוויסות של הגנים, ריכוז ה-RNA הדו-גדילי צריך להיות בסביבות תשעה עד 10 מיקרוגרם למיקרוליטר. כדי להכין את הדבורים לצינת הזרקה, דבורים שזה עתה הגיחו במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים. לאחר שהדבורים משותקות, הרכיבו שלוש עד ארבע דבורים במקביל על צלחות פטרי מלאות בשעווה מוצקה עם סיכות חרקים מוצלבות בין הבטן לבית החזה.

מצננים את הדבורים שוב במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך כדקה עד שתיים. ודא שהדבורים חסרות תנועה לחלוטין. הדבורים צריכות להיראות משוחררות, לא מסולסלות או מעוותות.

קיבוע מוחלט חשוב מכיוון שכל תנועה עלולה להגדיל את גודל הפצע והתמותה. דבורים מסולסלות או מעוותות צוננו זמן רב מדי ואין להשתמש בהן בגלל תמותה גבוהה. שים מחט חד פעמית בגודל 30 על מזרק מיקרו של המילטון.

מלאו את המזרק בשלושה מיקרוליטרים של RNA כפול גדילי וכדי לוודא שאין בועת אוויר במזרק. אם משתמשים באסטרטגיית הזרקה אחת, המזרק מתמלא בתערובת של RNA דו-גדילי של שני הגנים. אם משתמשים באסטרטגיית הזרקה של יומיים, המזרק מתמלא באחד משני ה-RNA הדו-גדיליים.

הכנס את המחט לצד הבטן. כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים, לחץ לאט על בוכנת המזרק כדי לאפשר ל-RNA הדו-גדילי להיספג מכיוון ש-RNA דו-גדילי הוא צמיג מאוד, לוקח שתיים עד שלוש שניות להוציא אותו לחלוטין מהמזרק.

לאחר דחיפה מוחלטת של הבוכנה, השאר את המחט בפצע למשך ארבע עד חמש שניות. התבונן בדבורים במשך שלוש עד חמש שניות לאחר הזריקות. אם טיפת לימפה המו דולפת מהפצע, השליכו את הדבורה, סמנו את בית החזה של הדבורים בצבעים שונים המתאימים לטיפולים שונים.

בשלב זה, אם נעשה שימוש באסטרטגיית ההזרקה הבודדת, התבוננו בדבורים במשך שעה במיכל עם דבש שסופק, ולאחר מכן החזירו אותן למושבה. עם זאת, אם נעשה שימוש באסטרטגיית ההזרקה של יומיים והוזרק רק ה-RNA הדו-גדילי הראשון, הניחו את הדבורים בכלוב רשת גליל עם דבש המסופק בצד. שמור את הדבורים באינקובטור בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ו-80% לחות למשך הלילה למחרת.

הזריקו לאותן דבורים את ה-RNA הכפול השני, תוך שימוש באותו הליך כמו עבור ה-RNA הכפול הראשון. תנו לדבורים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך שעה במיכל עם דבש שסופק, ואז הכניסו אותן למושבה. שישה ימים הזריקות אוספות דבורים מטופלות מהמושבה ללא שימוש במעשנת לפתיחת הכוורת.

לא משתמשים בעשן מכיוון שהוא עלול להשפיע על תפיסת הטעם של הדבורים, אשר תיבדק בהליך זה. אספו דבורים בכלובי גליל רשת מתכת באמצעות מלקחיים רכים עם לא יותר משלוש דבורים לכלוב כדי להרכיב דבורים. לבדיקת PER.

מצננים את הדבורים בארבע מעלות צלזיוס עד שהן משותקות לחלוטין. התקן כל דבורה אנכית לתוך צינור פלסטיק, שתוכנן במיוחד עבור PER. השתמש בסרט כדי לשמור על הבטן בתוך הצינור ולשמור על הראש בולט מחוץ לצינור.

הניחו את הצינורות על מתלה עם שתי שורות של עמודי פלסטיק קטנים. שורה אחת ממוספרת כך שניתן להקצות לדבורים המותקנות מספר תעודת זהות. הכניסו את המדפים עם הדבורים המטופלות לחממה בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ו-80% לחות למשך שעתיים בזמן שהדבורים דוגרות.

הכינו סדרה של סוכרוז. פתרונות מים. טען את התמיסות למזרקים עם 15 עד 20 מחטים לבדיקת PER.

הדבורים נבדקות בקבוצות. ראשית גע באנטנה של כל דבורה עם טיפה של 0% תמיסה, שהיא מים לאחר בדיקה זו עם 0.1%0.3%1%3%10% ו-30% סוכרוז. תמיסות מים המאפשרות לפחות שתי דקות למרווח בין כל תמיסה.

בדרך כלל לוקח כשתי דקות לבדוק 20 דבורים באמצעות ריכוז אחד של סוכרוז. לכן, תמיד צריכות להיות יותר מ -20 דבורים בכל קבוצה. אם דבורה מאריכה את החרטום שלה במלואו, נספרת תגובה חיובית. בזמן אמת.

ניתוח PCR אישר כי גם אסטרטגיות ההזרקה הבודדת וגם ההזרקה ליומיים הפחיתו משמעותית את רמות התעתיק של פיג'י ו-USP בדבורי הדבש. שישה ימים לאחר הזרקת ה-RNA הדו-גדילי בגרפים אלה, ה-RQ מציין רמת כימות יחסית של תעתיקי גן המטרה והאותיות השונות מעל העמודות מציינות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול. ניתוח לאחר ההרצאה גילה כי הדיכוי של תעתיק USP על ידי שימוש בזריקה בודדת עם תערובת RNA דו-גדילית והזרקה בת יומיים עם VG ראשון ו-USP שני היה נמוך משמעותית מהזריקה ליומיים עם USP ראשון ו-VG שני.

זה מצביע על כך ש-VG עשוי להיות מווסת עיקרי בלולאת ויסות ה-VG וההורמונים הצעירים. ציוני GUA לתגובה או GRS עבור הדבורים שטופלו חושבו מתוצאות תגובת הארכת החרטום או בדיקת PER כפי שמוצג כאן. ה-GRS בדבורים שהוזרקו עם תערובת RNA דו-גדילית VG ו-USP היה גבוה משמעותית מה-GRS בדבורי הביקורת של GFP, מה שמצביע על כך שהדבורים הכפולות היו רגישות יותר לסוכרוז.

האותיות השונות מעל העמודות מציינות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול. מוצגת כאן רשת ויסות אפשרית בין vi genin ultras, כדורי והורמון נעורים המתגלה על ידי דיכוי בו זמנית של גנים VG ו-USP. בעוד שנוקדאון יחיד של USP אינו גורם לשינוי כלשהו בהורמון הנעורים, נוקדאון כפול של VG ו-USP גורם לעלייה גדולה יותר בהורמון הנעורים מאשר נוקדאון יחיד של VG.

זה מצביע על כך שוויטלי לא רק מעכב ייצור הורמוני נעורים, אלא מעכב תגובת משוב של הורמון הנעורים להפלת USP. בנוקדאון כפול, העלייה הדרמטית בייצור הורמוני הנעורים נובעת מעיכוב מופחת מג'נין VI הנגרם על ידי נוקדאון VG ותגובה מפצה להעברת הורמון נעורים מופחתת הנגרמת על ידי נוקדאון USP. דיון מפורט יותר ברשת רגולטורית זו נמצא בטקסט הפרוטוקול הנלווה.

על ידי שימוש בגישת הפלת גנים כפולים, חשפנו קשר מפורט בין הורמון גניק, אולטראס, כדורי והורמון נעורים חיוני, שלא היינו מגלים על ידי דיכוי גן אחד בלבד. כעת, על ידי שימוש בטכניקה זו, חוקרים יכולים לחקור את יחסי הגומלין בין גנים בתוך רשתות רגולטוריות. PR היא שיטה סטנדרטית המשמשת למדידת תפיסת טעם אצל דבורי דבש, עם זאת, היא רגישה מאוד לטיפול, ולכן יש להיזהר מאוד כאשר שומרים על עקביות בין הסביבה לטיפול בבעלי החיים.

בנוסף, אם החיבור הולך להתבצע על פני מספר ימים, כדאי לשמור על ציר זמן קצר ולפקוח עין כדי לוודא שמזג האוויר והסביבה לא ישתנו.