Name: התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: למדו שיטת הדבקה אדנובירלית לתאי CD4 תמימים לפני הבדלת תאי Treg. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גבוה וזמני של גנים לחקירת אירועים מולקולריים מוקדמים בהתפתחות תאי Treg ללא פגיעה בחיוניות התאים או בפוטנציאל ההבדלה שלהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לLirui דו לבניית וקטור pCAGAdDU ואוליבר גורקה למתן פרוטוקול הקיבעון.

1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה. </li></ol> 2. העברת הגן של עניין לוקטור יעד pCAGAdDu <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגן של עניין מוקטור כניסתו לוקטור היעד על ידי רקומבינציה LR (מיקס למשל Gateway LR Clonase השני אנזים). הפעולה זו תיצור וקטור ביטוי adenoviral (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize 10 מיקרוגרם של וקטור ביטוי adenoviral בפאצ&#39;י הגבלה לעכל, לזרז את ה-DNA וresuspend אותו במים בריכוז של 3 מיקרוגרם לכל 100 μl. ינאריזציה משחררת את החזרות ההפוכות נגיפיות (ITR), אשר נדרשות לשכפול וencapsidation של Vה-DNA iral לחלקיקי נגיף. </li></ol> 3. דור של lysate הווירוס היסודי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 1 x 10 5 תאי HEK293A ב2 תרבות תקשורת סלולרי מ&quot;ל (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) באחד טוב של 6 גם צלחת ודגירת התאים עבור 6-14 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב10% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר להם לדבוק. לאחר מכן תאים צריכים להיות בכ -50% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipofection: העברת 6 μl של מגיב jetPEI ל94 μl של 50 מיקרומטר NaCl, בקצרה מערבולת. מוסיף את הפתרון המעורב עד 100 וקטור אדנווירוס ינארית μl תוך vortexing ודגירת תמהיל transfection זה במשך 15 - 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol> לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים המתאימים biosafety לזיהום אדנווירוס! <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על פתרון dropwise על התא המכיל גם HEK293A ודגירת התאים ב 37 ° C ו-CO 2 10%. בעת שימוש בסמן פלואורסצנטי, להעריך transfection יעילות חזותי לאחר 12-36 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הוסף 0.5 מ&quot;ל של מדיום חדש כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו כל 2 - 3 ימים עם מיקרוסקופ אור או הקרינה לתופעות cytopathic (CPE), שהם אזורים עם תאים מוגדלים ומעוגלים שמתחילים לניתוק. זה מעיד על דור וירוס יעיל. על המופע של אזורים רחבים יותר של CPE (איור 3), זה ייקח 24-72 שעות לפני שכל התאים נגועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים להראות סימנים של CPE, אבל לפני ניתוק כולל של תאים מתרחש, לנתק את התאים על ידי pipetting העדין ותאים עם העברת supernatant (SN, 3 - 5 מ&quot;ל) לצינור פוליסטירן 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התאים בSN על קרח יבש במשך 15 - 20 דקות ולהפשיר אותם במהירות על 37 מעלות צלזיוס לאחר מכן לקרע התאים. חזור על הקפאה והפשרה, מחזור זה (נ / TC) פעמיים נוספות. שמור lysate הווירוס העיקרי על קרח לשימוש תוך יום או להקפיא אותו ב -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. כל F נוסף/ TC יפחית את כייל הנגיף על ידי 30 - 50%. </li></ol> 4. הגברה וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים ולגדל תאי HEK293A למפגש 90% על צלחת תרבית רקמת ס&quot;מ 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם מחצית lysate הווירוס העיקרי (1.5-2.5 מ&quot;ל) ודגירת התאים במשך לפחות 36 שעות. כמעט כל התאים צריכים להיות נגועים לאחר מכן, כפי שניתן לקבוע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור מחדש ההגברה של מניות וירוס כבר מוגבר (כלומר מרוכז יותר), להדביק HEK293A בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 50 (ראה 6.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות בצור כאשר כל אחד מהם מראים CPE אבל לפני הניתוק. עם ייצור וירוס יעיל מצב זה הוא הגיע בתוך 48 שעות לאחר הדבקה. (אם זה לוקח עד שבוע, לשקול סיבוב נוסף של הגברה על ידי הגדלת כמות מניות אדנווירוס משמשת לזיהום המתואר ב4.2.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי pipetting העדין והעברת תאים וSN לצינור פוליסטירן 50 מ&quot;ל. ספין למטה תאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את SN וresuspend גלולה בהיקף מתאים של מדיום או SN (1 מיליליטר בקירוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 F / TC לשבש את התאים ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תוריד את מספר סידורי המכיל את חלקיקי הנגיף (כלומר lysate הנגיף המרוכז), וaliquot lysate הווירוס לאחסן אותו ב -80 ° C. </li></ol> 5. קביעת כייל נגיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 10 5 תאים לכל A549 גם ל5 בארות של צלחת 12 גם במדיום 1 מ&quot;ל ולתת לתאים לדבוק 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש μl 1 של אדנווירוס המרוכז (מופשר על קרח) לביצוע דילול סדרתי במדיום (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) ולהוסיף 10 μl בכל טוב. להשאיר אחד גם נגוע להתאים gating בcytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 36 שעות, תוריד את מספר סידורי, לשטוף עם תאי PBS ולנתק (לדוגמה על ידי trypsinization). לקבלת הוראות בטיחות Biohazard, מומלץ לתקן גאמות בparaformaldehyde 4% μl 100 ב PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף עם PBS פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח FACS של ביטוי זיהום סמן. עלילה &#39;lysate הנגיפי μl ייושם כנגד המספר המוחלט של תאים נגועים (איור 4). לקבוע את הטווח ליניארי של זיהום ולחשב לכל מ&quot;ל של כייל נגיף חי מהעקומה הסטנדרטית על פני הטווח ליניארי באמצעות x = 1,000 μl. </li></ol> 6. זיהום תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי T מסוג CD4 תמימים / מנוחה מDO11.10 TG; עכברי TG CARΔ1 באמצעות MACS (מסוג CD4 + T הנאיבי צינוק ערכה השני) או FACS מיון (מסוג CD4 + CD25-CD44-CD62L +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים בקנה מידה קטנה, פיפטה נפח מתאים של lysate הנגיפי כדי להשיג משרד הפנים של 50 לאחד גם צלחת תחתונה 96, גם סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עד 4 x 10 5 תאי T בנפח סופי זיהום של 50 μl במדיום תא T (RPMI1640, 10% FBS, PenStrep 5%, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x ממ חיוניויטמין, 1x-L-גלוטמין, 1:250,000 mercaptoethanol, 10 HEPES מ&quot;מ). לדוגמה: משרד הפנים של 50 ישמשו להדביק 3 x 10 5 תאי T; כייל הנגיף הוא 3 X 10 9 מ&quot;ל -1 נפח וירוס = משרד הפנים x T מספר תא / כייל נגיף = 50 x (3 x 10 5) / (3 x מיליליטר -1 10 9) = 0.005 מ&quot;ל </li></ol> הערה: לזיהום של מספרים סלולריים גדולים יותר, בקנה מידה של דבר באמצעות משרד הפנים של 50 בהיקף זיהום של 165 μl לכל 10 6 תאי T נאיביים בצינור קלקר עם כוס רופפת (עד 3 מ&quot;ל לכל צינור TP). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. </li></ol> (אופציונלי: התאים עלולים להישטף שוב כדי להסיר את הווירוס באופן יעיל יותר) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspendב200 בינונית μl תא T בלי גירוי נוגדנים וציטוקינים אחרים בלי IL-2 או לנוח ו 40 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר ביטוי של הגן של עניין לפני ההפעלה. </li></ol> 7. הפעלת תא T וקיטוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בנפח של אנטי CD3-וחרוזים אנטי CD28 מצמידים ששווים למספר התא (לדוגמה: 4 x 10 5) לתוך כוס מגיב קטנה, להוסיף נפח של פי 10 של PBS ולשים אותם על מגנט במשך 2 דקות . קח את supernatant ו resuspend את חרוזי 200 בינוני קיטוב μl (לTregs: בינונית + T תא TGFβ ng / 1 מ&quot;ל, 100 U / ml IL-2). </li></ol> הערה: ניתן גם להפעיל תאים באמצעות תרבות מנות רקמות מצופות בנוגדנים נגד CD28 ואנטי CD3, או באופן ספציפי לקולטן תא T DO11.10 באמצעות splenocytes BALB / ג מוקרן פעם עם אנטיגן ovalbumin 323-339 פפטיד. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugהדואר נח תאים כמו קודם, תוריד את תאי resuspend SN וב200 בינונית μl קיטוב המכילים אנטי CD3-וחרוזים-CD28 נוגדן אנטי מצמידים. דגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור ללא שינוי בינונית. </li></ol> 8. קיבוע תא T ומכתים עבור cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים: ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. לבצע את כל שלבי הכביסה הבאים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בתמיסת 100 μl ניתן לתקן מת תא מכתים ודגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, resuspend ב100 PBS μl, להוסיף paraformaldehyde 4% μl 100 PBS, 15 דקות לדגור על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, resuspend אותם במתנול 70% μl 200 קר כקרח PBS ו דגירה למשך 30 דקות על קרח. </li></ol> הערה: ניתן לטפל בתאים מעתה והלאה ללא אמצעי זהירות Biohazard!<ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 60 אדון ותמהיל של 60 μl μl PBS + 10 מיקרוגרם / מיליליטר FC-בלוק (אנטי FCR3 לחסום מחייב נוקבים). שטוף תאים, resuspend אותם 40 μl של PBS + אנטי FCR3 ודגירת 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של PBS + אנטי FCR3 המכיל נוגדני 1 מיקרוגרם PE-מצמידים אנטי FOXP3, מערבב היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמים PBS ולנתח תאים בcytometer זרימה. </li></ol>

<ol><li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li>
<li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li>
<li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li>
<li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Peripheral+CD4%2BCD25-+Naive+T+Cells+to+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+TGF-%CE%B2+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li>
<li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).</li>
<li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+%28TCR%29+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li>
<li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+%28MEA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).</li>
<li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li>
<li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+the+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li>
<li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4(2002).</li>
<li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li>
<li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li>
<li>Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+bic%2FmicroRNA-155+for+Normal+Immune+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%CE%B3+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.

דור וירוס וטיטרציה לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. עם זאת, ייצור נגיף על ידי תאי HEK293A יכול להיות מושפע ממוסיף ארוך שמפחיתים את היעילות. כמה מסגרות קריאה פתוחות למעשה נמצאו להפריע לייצור וירוס. בדרך כלל ניתן הצילו מניות נגיפיות א...

Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל 1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם 1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים ממזון והאוויר, חיידקי commensal, ואלרגנים 3,4. בנוסף, Tregs הם קריטיים להקמת סובלנות אימהית לעובר 5 פפטידים ומראשמחלת שתל נגד מארח פורקן 6. במקביל, גם Tregs לתווך לוואי בלתי רצוי על ידי הפחתת ערך מעקב חיסונית של תאים סרטניים 7,8. תכונת ההיכר של Tregs היא הביטוי של-משנה ציון FOXP3 גורם השעתוק, גורם שעתוק המכיל תחום המזלג בראש, כי הוא הכרחי ומספיק להעניק Treg פונקציה 9,10. כמה מסלולי איתות שיכול לגרום ביטוי FOXP3 ידועים. עם זאת, התהליכים המולקולריים השליטה, להסדיר, או לווסת Treg בידול בתגובה לקולטן תא T מפעילה הם הבינו פחות טובים. יכול מאוד יעיל להיגרם Tregs במבחנה על ידי הגירוי של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28 בנוכחות TGFβ ו-IL-2 11. כTregs מתעורר הם פונקציונליים in vivo, המניפולציה של מולקולות המקדמות בידול Treg נושא פוטנציאל עצום לעתיד therapies, למשל, טיפול באסתמה, מחלת Crohns, והשתלת 11,12. לעומת זאת, אפנון טיפולי של מולקולות כדי לחסום בידול Treg עשוי לספק תועלת בגישות עתידיות של טיפול המשולב של חולי סרטן. במבחני בידול במבחנה כבר סייע לתיאור של שינויים מולקולריים הקשורים להתמיינות תאי T משנה. באותו הרגע, ניסיונות ניסיוניים לחיפוש או מסך למוצרי גן שהתמיינות תאי T שליטה הם הקשו על ידי העובדה שהשיטות הנפוצות ביותר של ביטוי גנים מחוץ לרחם להיכשל בתאי T נאיביים. לדוגמה, electroporation ותמרת retroviral הם יעילים רק בתאי T מופעלים. בניגוד לציפיות ראשוניות, תמרת lentiviral, שהוא בדרך כלל יעיל בתאי מנוחה, דורשת מראש הפעלה של תאי T נאיביים ידי ציטוקינים 13. יתר על כן, ההעברה של cDNA או mRNA במהלך electroporationכרוך בשלילת קוטביות של קרום הפלזמה, שהיא עצמה מעניקה תכונות של הפעלת תאי T ואולי אף לגייס Ca 2 + איתות ולהפעיל את חלבוני NFAT (תצפית ושופט שלא פורסם. 14). באופן דומה, לתמרת retroviral, תאי T הנאיביים צריכים להיות מופעלים עבור 18 - 40 שעות. במהלך תקופה זו, הפירוט של קרום הגרעין במהלך חלוקת תא מתרחש, ומאפשר לשילוב הגנומי הבא של וקטור retroviral 15. שיטות אלה אינם מסוגלים להתמודד עם הרגולציה המולקולרית המוקדמת של מפגש ראשוני עם תא T אנטיגן, המהווה את השלב המכריע של התמיינות תאי T מסייע. התמרה adenoviral ידועה להעניק ביטוי גנים מחוץ לרחם חולף במספר סוגי תאים האנושיים המבטאים את הקולטן אדנווירוס Coxsackie האנושי (מכונית). הוא ממשיך ללא דרישה להפעלת תא או התקדמות מחזור התא. משטח הביטוי של גAR הוא חיוני לקובץ מצורף וירוס יעיל והפנמה, וביטוי מהונדס של הגרסה המקוצצת CARΔ1 תחת אמרגן תא ספציפי T נמצא כדי להבהיר thymocytes העכבר ותאי T הרגישים לזיהום adenoviral 16. חשוב לציין, transgene אינו משנה thymocyte פיתוח או בבידול מבחנה של CD4 תאי T נאיבי לתוך תת שונים (מידע לא מוצג; נ&quot;צ 17.). התמרה אדנווירוס בתיווך של תאי T ששימש בעבר לביטוי יתר 17,18 ועקום למטה גישות 19,20. יכולים להיות מטוהרים תאי T המהונדס מזמין מסחרי DO11.10 TG; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ונ&quot;צ 17.). חשוב לציין, התמרה adenoviral מאפשרת ביטוי גבוה של גן של עניין בתאי T נאיביים ללא גרימת סימנים ברורים של הפעלה. תאי ה-T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) לאחר infectiוביכול להיות מופעל ומובחן לTreg דומה לתאים שאינם נגועים. ייצור של adenoviruses רקומביננטי יכול להיות מושגת לאחר transfection של תאי HEK293A עם פלסמידים adenoviral (איור 1). פלסמידים אלה מכילים בדרך כלל את הגנום האנושי אדנווירוס מסוג 5 עם גני E1 ו-E3 שנמחקו כדי להבהיר adenoviruses רקומביננטי שכפול פסול 21. תאי HEK293A להשלים מחסור שכפול כפי שהם כבר הונצחו באמצעות שילוב יציב של אדנווירוס טעון 22. מאז וקטורי adenoviral גדולים (~ 40 KB) וכתוצאה מכך לא מתאים גם לשיבוט בתיווך אנזים הגבלה מסורתי, אנחנו עובדים במערכת השער. הגן של עניין הוא משובט תחילה לתוך וקטור כניסה קטן יותר, שממנו ניתן להעביר אותו בקלות לתוך וקטור יעד adenoviral דרך תגובת רקומבינציה מבדה (LR) 23. אנחנו בניתי את וקטור pCAGAdDuעל ידי שילוב של אמרגן CAG (אמרגן אקטין עוף ומשפר CMV) עם קלטת ביטוי המכילה אתרי LR איגוף סמן בחירת ccdB procaryotic 24. קלטת ביטוי זה התמזגה לאתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) רכיב המאפשר coexpression של החלבון אוקריוטים זיהום הסמן המשופר הירוק הניאון (eGFP), אשר התמזג רצף המכיל הורמון גדילת פולי השור () אות. אנחנו בחרנו את רצפי cis-הרגולציה חטיבת כלי טיס, שכן אמרגן CMV prototypic נמצא להיות מאוד הפעלה תלויה ושלילי ולכן לביטוי גנים בתאי T נאיביים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להתמיינות יעילה בTreg מבחנה ושיטה לtransduce תאי T מסוג CD4 תמימים ללא הפעלה (איור 2). השיטה מאפשרת ביטוי אקטופי גן או להפיל מסוג CD4 שקדמו התמיינות תאי T במצב הנאיבי. זה מאפשר לבחון את ההשפעה של overexpresseגן ד של ריבית במהלך אירועי איתות ראשונים על גירוי ראשוני TCR עד מחויבות משנה תא T. ניסויי האימות שלנו גם מספקים את הבסיס להקמת יישום דומה באדנווירוס הבידול של תת קבוצות אחרות כגון תאי T Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, או תאי TFH.

<table><tbody><tr><td>ערכת שיבוט pENTR / D-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II תערובת אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfection</td><td>101-10N HEK293A</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 14 ס"מ</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1) 1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>דגם מס' 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Veneza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM תערובת ויטמינים חיוניים (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads עכבר T-Activator CD3/CD28 להרחבת תאים והפעלה</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TGF-beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים כחולים ניתנים לתיקון</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>עכבר BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר/חולדה Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4427975 LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

התמרה adenoviral של cd4 תמימים תאי t ללמוד בידול treg

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים. ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.

ייצור וירוס עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי HEK293A עם וקטור שליטת pCAGAdDu ללא הוספה. CPE מאופיין על ידי ההופעה של אזורים עם תאים מוגדלים ועיגול לטובה שמתחילים לנתק ולהציג ביטוי גבוה של ה-GFP סמן הזיהום. ה...

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים<em&gt; במבחנה</em&gt;.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה להפקה של חלקיקי אדנו-וירוס זיהומיים המשמשים להחדרת גן רצוי לתאי T נאיביים, אשר לאחר ביטוי אטופי של הגן המועבר או התמיינות הופכים לתאי T רגולטוריים או tregs. ראשית, הגן הרצוי משובט לתוך וקטור היעד האדנו-וירוסלי. לאחר מכן, הווקטור מועבר לשורת תאי ההפקה של האדנו-וירוס, HC 2 93 A, ונוצרים חלקיקי אדנו-וירוס זיהומיים.הווירוסים שהתקבלו משמשים להדבקת תאי T נאיביים מעכברים עם טרנסגן של רצפטור לאדנווירוס לאחר ההדבקה. לאחר מכן, התאים נמנוחים כדי להבטיח את ביטויו של הגן הרצוי. בתאי T נאיביים, תאי ה-T מופעלים בתנאי קיטוב כדי להשרות התמיינות של treg.לאחר מכן מקבעים את התאים וצובעים אותם לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של סמן הדיפרנציאציה של treg,‏ Fox P three, ושל סמן הזיהום GFP, אשר עשויים להיות מושפעים מהביטוי העודף של הגן הנחקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנסדוקציה רטרוויראלית של גנים, הוא שהיא מאפשרת ביטוי עודף של גן נחקר בתאי T נאיביים.דבר זה מוביל לרמה גבוהה של ביטוי יתר הנוכחת ברגע הפעלת תאי T. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תאי T רגולטוריים. לדוגמה, בנוגע לבקרה הגנטית הפוסט-טרנסקריפציונלית העומדת בבסיס ביסוס זהות תאי T-Rex.התחל את הפרוטוקול על ידי שיבוט הגן המבוקש לתוך וקטור כניסה (entry vector). הגן המבוקש שהוגבר ב-PCR הוא בעל קצוות קהים (blunt) ומולחם לתוך הוקטור P enter D topo המצומד לטופואיזומראז. לאחר מכן, הגן המבוקש מועבר באמצעות רקומבינציית LR לתוך וקטור היעד P kakadu.הוא מכיל את הגנים האדנו-ויראליים ואתר כניסה ריבוסומלית פנימי או iris, ולאחריהם מסגרת קריאה פתוחה של GFP, כדי ליצור וקטור ביטוי אדנו-ויראלי עם סמן זיהוי להדבקה. לאחר מכן, 10 micrograms של וקטור הביטוי האדנו-ויראלי עוברים ליניאריזציה. בעיכול רסטריקציה ב-PAC one, ה-DNA עובר משקעים ואז מומהס מחדש במים בריכוז של three micrograms ל-100 microliters.לינאריזציה משחררת את החזרים ההפוכים של הנגיף או ה-ITR, הדרושים לשכפול ולאנקפסולציה של ה-DNA הנגיפי לתוך חלקיקי נגיף. את כל השלבים הבאים יש לבצע תחת תנאי בטיחות ביולוגית מתאימים לזיהום באדנווירוס. כדי להכין וקטור לינארי עבור קוטרנספקציה (cotransfection), העבר שש µL של ריאגנט jet PEI אל תוך 94 µL של sodium chloride בריכוז 50 µM וערבב במערבל (vortex).בקצרה, תוך כדי ערבוב ב-vortex, הוסף את התמיסה המעורבבת ל-100 µL של וקטור adenoviral ליניארי. דגירה את תערובת הטרנספקציה הזו למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוצא מהאינקובטור פלטות של שש בארות עם תאי HEC 2 9 3 A שהגיעו ל-50% confluence.טפטפו את התמיסה לתוך הבארות המכילות תאי HEC 2 9 3 A והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C וב-10% carbon dioxide. הוסיפו 0.5 milliliters של מצע טרי מדי שלושה ימים, תוך שימוש בביטוי GFP כסמן להדבקה. העריכו את יעילות הטרנספקציה באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך מדי יומיים עד שלושה ימים, ובדקו את קיומם של אפקטים ציטופתים המתבטאים באזורים עם תאים מוגדלים ועגולים המתחילים להתנתק.דבר זה מעיד על ייצור נגיפים יעיל. ברגע שיופיעו אזורים רחבים יותר של אפקטים ציטופתיים, כל התאים יודבקו בתוך 24 עד 72 שעות. כאשר כל התאים יראו סימנים לאפקטים ציטופתיים, אך לפני שיתרחש ניתוק כללי של התאים, קצרו את התאים באמצעות פיפוט עדין והעבירו אותם יחד עם הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת פוליסטירן של 15 milliliter.כדי לפוצץ את התאים, הקפיאו את התליות על קרח יבש למשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן הפשירהו אותן במהירות בטמפרטורה של 37 °C. חזרו על מחזור הקפאה והפשרה זה פעמיים נוספות. תליית התאים המפוצצים מכונה כעת ליזאט וירוס ראשוני.יש לשמור את כל ליזאטי הנגיפים על קרח. אם לא יעשה בהם שימוש תוך יום, יש להקפיאם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך אחסון לטווח ארוך. יש לקחת בחשבון שכל מחזור נוסף של הקפאה והפשרה יפחית את סטר הנגיפים ב-30% עד 50%. כדי להגביר את ליזאט הנגיפים הראשוני, הדביקו תאי HC 2 93 A שגדלו עד ל-90% התמזגות (confluence) ב-15 צלחות תרבית רקמה באמצעות מחצית מהליזאט של הנגיף הראשוני, והדגרירו למשך 36 שעות לפחות.לאחר 36 שעות, בדקו את ההדבקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; כמעט כל התאים צריכים להיות מדובקים. ברגע שכל התאים מראים אפקטים ציטופתיים אך עדיין אינם ניתקים, אספו את התאים באמצעות פיפוט עדין להשגת ייצור ויראלי יעיל. מצב זה מושג בתוך 48 שעות מההדבקה; העבירו את התאים ואת העל-נוזל (supernatant) לשפופרת פוליסטירן של 50 milliliter.סבב את התאים בצנטריפוגה ב-300 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, הסר את supernatant ותלה את המשקע בנפח מתאים של medium. נפח של מיליליטר אחד אמור להניב titer בטווח של 10 בחזקת 10 למיליליטר.בצעו שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כפי שנעשה קודם לכן כדי לפרק את התאים. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-900 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, העבירו בזהירות את העלייה, אשר כעת תיקרא ליזאט של וירוס מרוכז, למבחנה לקריו (cryo tube).הכינו אליקוטים עבור מספר הדבקות ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לבסוף, קבעו את תיתור הנגיף באמצעות אנליזת fax של ביטוי סמני הדבקה בתאי 5 4 9. בהתאם להוראות במסמך המצורף, חלק זה של הפרוטוקול מבוצע בניסויים בהיקף קטן תוך שימוש בתאי CD four T נאיביים מבודדים מעכברי D 1110 transgenic car delta one transgenic.העבר בעזרת פיפט נפח מתאים של ליזאט ויראלי להשגת MOI של 50 לבאר אחת של פלטת 96 באערים עם תחתית עגולה. הוסף עד ארבע פעמים 10⁵ תאי T בנפח הדבקה סופי של 50 µL של תאי T.מדיום בינוני. הגדרה זו מאפשרת גישות ניסיוניות מקבילות. דגרו את התאים למשך 90 דקות ב-37 °C בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide.לאחר הדגירה, סובב את התאים בצנטריפוגה ב-300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הסבוב, השהה אותם ב-200 µL של PBS, סובב שוב בצנטריפוגה והסר את העלייה. השהה את התאים ב-200 µL של מצע לתרביות תאי T ללא נוגדנים מעוררים וללא IL-2 או ציטוקינים אחרים. לאחר מכן, השהה את התאים למשך 40 שעות ב-37 °C באינקובטור עם 5% CO2 כדי לאפשר את ביטוי הגן הרצוי לפני ההפעלה. כדי להפעיל ולהקטב את תאי ה-T, העבר בפיפטה חרוזי anti-CD3 ו-anti-CD28 מצומדים לכלי ריאגנטים קטן. מספר החרוזים צריך להיות שווה למספר התאים; לאחר מכן, הוסף פי עשרה מנפח ה-PBS והנח אותם על מגנט למשך שתי דקות.בשלב הבא, הסירו את הנוזל העליון ושחזרו את התוכן. השעו את החרוזים ב-200 µL של תווך קיטוב, וסובבו את התאים שנחו ב-300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, הסירו את הנוזל העליון ושחזרו את התאים ב-200 µL של תווך קיטוב המכיל חרוזים המשואבים לנוגדנים. דגרו למשך 72 שעות ב-37 °C באינקובטור עם 5% CO2 ללא החלפת התווך. הפרוטוקול לצביעה וקיבוע מתואר כאן בקצרה.ראשית, שוטפים את התאים ב-PBS ומדגירים אותם עם תמיסה לצביעת תאים מתים הניתנת לקיבוע. לאחר שלב שטיפה נוסף, מקבעים את התאים ב-paraformaldehyde; לאחר הקיבוע ניתן לטפל בתאים ללא אמצעי בטיחות ביולוגית של אדנו-וירוס. לאחר מכן שוטפים שוב את התאים ומבצעים חדירה (permeabilization) באמצעות מתנול. לאחר שלב שטיפה נוסף, מדגירים את התאים עם anti-FcR III כדי לחסום קישור לא ספציפי.לבסוף, מדגרירים את התאים עם נוגדנים anti-FcγRIII ו-anti-FoxP3 המשורשריים ל-PE. קיים סיכון לאובדן של תאים רבים במהלך הליך הקיבוע והצביעה עקב שלבי השטיפה המרובים; כדי למנוע אובדן, יש להסיר את העלייה מיד לאחר הסרכזגוגה מבלי להפריע למשקע בעזרת טיפ של פיפט. לאחר צביעת התאים, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS ונתחו אותם באמצעות ציטומטר זרימה.קורא 96 בארות המחובר לציטומטר הזרימה מאפשר לבצע הדבקה של תאי T, דיפרנציאציה, קיבוע וצביעה באותה פלטת 96 בארות, ובכך מספק תהליך עבודה יעיל לניתוחים מקבילים של מספר תנאים, אך ניתן לבצע את הניתוח גם בשפופרות FACS סטנדרטיות כדי להעריך את השפעת ההדבקה באדנווירוס על חיות תאי T ועל דיפרנציאציה של treg. תאי T נאיביים שפונו מעכברי DO 1110 transgenic car delta one transgenic הודבקו באדנווירוס ביקורת ב-MOIs שונים והופעלו בתנאי קיטוב של treg. תאים מקובעים וצבועים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לבחון את הביטוי של סמן ההדבקה.שילוב GFP של צבע לתאי מתים ועבור סמן הדיפרנציאציה. FOX P3 כפי שמוצג כאן. הגדלת ה-MOI מ-1 ל-50 גורמת לאחוז גבוה יותר של תאים נגועים.בעוד שלא נשפיעו לא החיוניות ולא הדיפרנציאציה של Treg, נבדק האם זיהום באדנווירוס משפיע על מצב האקטיבציה של תאי T. תאים מזוהמים ותאים שאינם מזוהמים נותחו לבדיקת ביטוי של סממני אקטיבציה ומנוחה באמצעות FACS כפי שניתן לראות כאן. הביטוי של סממנים אלו היה זהה בתאים מזוהמים ובשאינם מזוהמים כאשר התאים הופעלו לאחר מכן בתנאים המקדמים התמיינות ל-Treg.העלייה בביטוי של סמני אקטיבציה והירידה בביטוי של סמני תאי T נאיביים היו דומות מאוד בתאים מזוהמים ובאי-מזוהמים יחד. נתונים אלה מצביעים על כך שזיהום של תאי T במצב נאיבי אינו מפריע לאקטיבציה מאוחרת של תאי T. כדי לבחון את רמת הביטוי הגבוה (overexpression) שהושגה באמצעות פרוטוקול הטרנסדוקציה האדנו-ויראלית המתואר, תאי T נאיביים הוזיהמו עם אדנו-וירוס המקודד ל-microRNA 155 או אדנו-וירוס בקרה ב-MOI של 50; התאים הושארו במצב מנוחה למשך 40 שעות, הופעלו למשך 40 שעות, או הושארו במצב מנוחה למשך 40 שעות ולאחריהם הופעלו למשך 40 שעות. cDNA הופק וביטוי של microRNA 155 נקבע ביחס ל-snRNA 202.באמצעות quantitative PCR, רמות ביטוי-יתר של microRNA 1 55 בתאי T נאיביים שנחו במשך 40 שעות תואמות לרמות הביטוי האנדוגניות של microRNA 1 55. לאחר 40 שעות של הפעלת תאי T, הפעלת תאים אלו עדיין גורמת לעלייה תלוית-הפעלה בביטוי של microRNA 1 55.סרטון זה מדגים את רמת הביטוי העודף הגבוהה בתאי T נאיביים באמצעות אדנווירוס, בנוסף לביטוי ה-micro RNA האנדוגני המושרה על ידי אקטיבציה. לאחר שילטו בטכניקה, ניתן להשלים את תהליך השבט, ייצור הוירוס והדבקת תאי ה-T בתוך ארבעה שבועות. לאחר ייצורו, ניתן לאחסן את הוירוס לטווח ארוך או להגבילו שוב בתוך שלושה ימים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע בקרה קפדנית לכל הניסויים באמצעות וקטור ריק, וראשית לקבוע את ההשפעה של ההדבקה האדנו-ויראלית עצמה על התהליך הנחקר. יש לקחת בחשבון שהדבקה אדנו-ויראלית וביטוי יתר הם זמניים ונמשכים רק כחמישה עד שבעה ימים.

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה...

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח הפנוטיפ של תאי T רגולטוריים (Treg) שבודדו מעכברים נגועים בנגיף כוריומנינגטיס לימפוציטי נאיבי וכרוני. בנוסף, אנו מספקים תהליך להערכת הפעילות המדכאת של תאי ה-Treg.

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

מערכות ניסיוניות רבות כבר נוצלו כדי להבין את המנגנונים המסדירים פיתוח תאי T ולתפקד תגובה חיסונית. הנה גישה גנטית באמצעות תמרת retroviral מתוארת, אשר היא כלכלי, זמן יעיל, והכי חשוב, מאוד אינפורמטיבי בזיהוי מסלולים רגולטוריים.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

אנו מציגים פרוטוקול להתמרה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, המספקים חלופה יעילה לעריכת גנים בחקר התמיינות Th17.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

למדו שיטת הדבקה אדנובירלית לתאי CD4 תמימים לפני הבדלת תאי Treg. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גבוה וזמני של גנים לחקירת אירועים מולקולריים מוקדמים בהתפתחות תאי Treg ללא פגיעה בחיוניות התאים או בפוטנציאל ההבדלה שלהם.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

גלה סרטונים נוספים