בנייה של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוה עם יכולות קונבנציונליות והשמנה אופטיות הולוגרפי
22 באפריל 2013
המערכת המתוארת במסמך זה מעסיקה מלכודת אופטית מסורתית, כמו גם קו השמנה אופטי הולוגרפית עצמאי, מסוגלת ליצור מניפולציה ומלכודות רבות. זה מאפשר יצירת הסדרים גיאומטריים מורכבים של חלקיקים שבירה בעת גם מאפשרים מדידות בו זמנית במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה של הפעילות של אנזימים ביולוגיים.
בנוהל זה, מורכבים ומכווננים קו לכידה אופטית קונבנציונלי והולוגרפי. כדי להשיג זאת, ראשית, מדדו את המיקומים עבור הרכיבים האופטיים, ולאחר מכן התקינו את הרכיבים בביטחון במיקומם המתאים. לאחר מכן, כווננו את האופטיקה כדי לאפשר לכידה. השלב האחרון הוא חסימת קרן ה-TED מהמראה ההולוגרפית.
בסופו של דבר, המערכת המוכנה מאפשרת לכידה הולוגרפית ורגילה בו-זמנית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו לכידה רגילה בלבד, הוא שהיא מאפשרת מיקום בו-זמני של מספר אובייקטים שבירים בשלושה ממדים ומדידות מהירות של מניפולציה של אובייקטים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי, שכן התכנון, הפריסה והכיול עשויים להיות מאתגרים.
נקודת ההתחלה של סרטון זה היא שולחן אופטי שעליו מוצב מיקרוסקופ ליצירת מלכודת אופטית ב-980 nanometers. התחילו עם אחת מדיודות הלייזר הזמינות באורך גל זה. השתמשו בלייזר בעל יכולת הטיה (pig tilt) עם קיטוב, תוך שימוש בסיב אופטי במוד אחד (single mode fiber) בעל קוטר שדה מוד ידוע.
הסיב צריך להיות ארוך מספיק כדי לשמש כפילטר מצבים (mode filter) ויש לסיימו עם מחבר ערוץ סיב בעל מחבר FCPC או F-C-A-P-C. יש לטפל בסיב האופטי במצב יחיד (single mode) בזהירות ויש להימנע מקפלי סיב. אבטחו את דיודת הלייזר ואת התושבת המאפשרת בקרת הספק וטמפרטורה.
יש להצמיד את התושבת ישירות לשולחן האופטי כדי למקסם את פיזור החום הפסיבי. לאחר מכן, יש לחבר את מחבר הסיב האופטי לאופטיקת קיבוץ הגרמה. ודאו שפתח הסיב שנבחר תואם לקוטר שדה האופן (mode field diameter) של הדיודה.
חברו את מתאם האיסוף של סיב ה-Pigtail לשולחן האופטי במרחק מספיק מהמיקרוסקופ כדי לאפשר הרחבה של ניתוב הקרן והצבה של רכיבים אחרים. ניתן להשתמש בצבעי המוטות כדי לקבוע את המרווח בין העדשות עבור מיקום עמיד וניתן לשחזור. כוון את יציאת הסיב כדי להבטיח התפשטות עקבית של הקרן למרחקים הדומים לנתיב הקרן הכולל אל המיקרוסקופ.
ישנן חמש מראות במסלול קרן לייזר ה-DDE. החל מלייזר ה-DDE, ישנן שתי מראות המכוונות את הפלט שלו אל תוך בית המיקרוסקופ. הקרן צריכה לעבור גם דרך מראה דיכרואית, המאפשרת מעבר ללא עמעום של קרן דיודת הלייזר בזווית של 45 מעלות מזווית הפגיעה.
לבסוף, שתי מראות short pass diic נוספות המעבירות אור נראה, אך מחזירות קרינה באינפרא-אדום קרוב ומעלה. נתווב את הקרן אל תוך המיקרוסקופ וממנו החוצה. מרחב אינסוף (Infinity space) אחד נמצא בתוך מאראה המיקרוסקופ לצורך כיוון המראות; הסר את עדשת המיקרוסקופ.
השתמשו במראות ובכרטיס צפייה באינפרה-אדום כדי לנתב את הקרן דרך המפתח בבמה להרכבת העדשה. אם הקרן אינה ממורכזת, כווננו את המראות כדי לתקן את היישור כך שהקרן תהיה במרכז. בעת הרכבת עדשות, מערכת כלוב (cage system) יכולה להביא להרכבה קשיחה.
ניתן להשתמש במכוון (Calipers) למדידה מוקדמת של מרחקים בין עדשות לאורך מוטות הכלוב לפני ההתקנה. התקינו באופן זמני מצביע לייזר אדום עם מתאם מותאם במקום העדשה אובייקטיבית, כך שהקרן שלו תהיה לאורך הציר האופטי של המיקרוסקופ. השתמשו בקרן גלויה של מצביע הלייזר כדי למקם וליישר באופן גס את מרחיב הקרן של 980 nanometer.
מערך זה משתמש בעדשות בעלות אורך מוקד של 60 millimeters ו-125 millimeters בסידור keary כדי להכפיל בקירוב את מותני האלומה (beam waist). לאחר מכן, התקינו את עדשות ההכוונה של 980 nanometer תוך שימוש באלומה המכוונת (pointer beam) כמדריך. לכל עדשה יש תושבת לאורך מוקד של 60 millimeter; העדשה הראשונה במסלול האלומה מותקנת על במת X, Y, Z מדויקת עם טווח תנועה של חצי אינץ' לפחות כדי לאפשר הכוונה של האלומה.
ניתן כעת למקם את העדשה השנייה כך שתיווצר מערך Keary ביחס של אחד לאחד עם העדשה הראשונה. יש למקם עדשה זו כך שתהיה מצומדת אופטית למישור המוקד האחורי של העדשה האובייקטיבית. כדי להכין את מלכודת ההולוגרפיה, התקן את הלייזר בנתיב של 1064 nanometer על פלטפורמה מוגבהת, בגובה של קרן ה-980 nanometer בקירוב.
מקמו לוח רבע-גל ופולריזטור מיד לאחר יציאת הלייזר, כדי לאפשר כיוון ידני של הספק הלייזר. התקינו את מרחיב הגרורה עבור לייזר זה, כך שרוחב הגרורה יורחב כדי להתאים לגודל האלכסון של המראה ההולוגרפית.
במידה והמקום מוגבל, השתמשו כאן בעדשות בעלות אורכי מוקד קצרים, 16 millimeters ו-175 millimeters. כעת השתמשו בקרן של מצביע הלייזר כדי למקם את המודולטור של האור המרחבי (SLM), המהווה חלק מהערכה ההולוגרפית המסחרית שבשימוש. בניסוי זה, יש למקם את המודולטור של האור המרחבי כך שיהיה בצמידה אופטית למישור המוקד האחורי של העדשה.
מקם אותו כך שקרן הלייזר תהיה בזווית פגיעה מינימלית ככל האפשר, אך כך שההחזר שלה יעקוף בבטחה את כל הציוד על שולחן האופטיקה. מקם מראה נוספת לפני מרחיב קרן הלייזר של 1064 nanometer כדי להכווין את האור למודולטור האור המרחבי. ודא שאור הלייזר פוגע במרכז מפתח מרחיב הקרן.
לבסוף, התקינו זוג עדשות של טלסקופ בין המודולטור של האור המרחבי (spatial light modulator) לבין המראה הדיכרואית. לעדשות אלו אורכי מוקד של 125 מילימטרים ו-200 מילימטרים. הסירו את מצביע הלייזר, והשאירו את מתאם ההרכבה המותאם אישית שישמש כמפתח ליישור גס.
התחילו בבדיקת היישור באמצעות קרן ה-980 nanometer בלבד. השתמשו בצופה כרטיסים באינפרא-אדום כדי ליישר את קרן ה-980 nanometer כך שתעבור בציר המרכזי של המפתח במתאם המותאם אישית. לאחר מכן, השתמשו בכרטיס האינפרא-אדום כדי לוודא שקרן ה-1064 nanometer פוגעת באותן נקודות שבהן פוגעת קרן ה-980 nanometer לאורך נתיב הקרן המשותף שלהן.
לאחר סיום שלב זה, החלף את מתאם ההרכבה המותאם אישית של מצביע הלייזר בעדשה אובייקטיבית עם מספר מפתח גבוה (high numerical aperture) לשמן או למים. לאחר מכן, כוון את מלכודת ה-980 nanometer על ידי הזזת קרן הלייזר עד שניתן לראות תבנית התאבכות סימטרית רדיאלית במצלמה כאשר המראה ההולוגרפית כבויה. כוון את מלכודת ה-1064 nanometer באמצעות המודולטור של האור המרחבי (spatial light modulator) והמראה הדיכרואית הראשונה כדי להזיז את קרן ה-1064 nanometer שאינה עוברת עקיפה (UN DEFRACTED).
בדוגמה זו, התמונה המיושרת עבור שתי המלכודות מעידה על יישור טוב ללכידה יעילה, אך ניתן לדייק אותה עוד יותר. קיימות גם סטיות מינוריות הקשורות לקרן ה-1064 העגולה, הפוגעת במראת SLM מרובעת, שלא ניתן להסיר בקלות על ידי דיוק יישור העדשות. כדי לחסום את המלכודת הנוצרת על ידי הקרן הלא-מופעלת מהמתמר האור המרחבי, הכניסו אובייקט אטום קטן בנתיב האור הלא-מופעל במיקום הצמוד למישור הדגימה עבור מערכת זו.
מיקרוספירה אטומה בעלת קוטר של 100 עד 300 מיקרון, העשויה ממתכת, מודבקת ללוחית זכוכית עגולה או לחלון השקוף לקרינת אינפרא-אדום. הבלוק ממוקם בנקודת המוקד המשותפת של העדשות, המצומדת אופטית למישור הדגימה. אם קרני הלכידה האופטית מוזרקות למרחב האינסוף של המיקרוסקופ, ניתן למקם את חוסם הקרן כך שיחסום אור שאינו מנוחה, או להזיזו כדי לאפשר לכל האור לעבור.
המערך שהורכב מאפשר למפעיל ללכוד מספר אובייקטים שבירי שבירה בזמן אמת ולמקם אותם בשלושת הממדים בתוך שדה הראייה. כאן, היכולות ההולוגרפיות של המכשיר מוצגות באמצעות לכידת מיקרוספירות, התלויות במים דה-יוניים; עיגולים אדומים וירוקים מראים את מיקומי הלכידה, כאשר הצבע הירוק מצביע על לכידה שנבחרה למיקום מחדש בסרטון זה. מהירות ההשמעה מואצת לאחר לכידת אובייקט, ומיקום הלכידה שלו משונה באופן ידני.
הסידור הסופי כולל 11 חרו지를 המצטלבים לצורת הלוגו של אוניברסיטת Utah, שבה בוצע ניסוי זה. המערכת מאפשרת גם שימוש בו-זמני במלכודות הולוגרפיות ובמלכודות קונבנציונליות. כאן מוגדרות שתי שורות של מלכודות הולוגרפיות הנשלטות על ידי המפעיל.
מלכודת קונבנציונלית נוספת מוגדרת בין שתי השורות. מיקרוספירות התלויות במים דה-יוניים נקשרות על ידי המלכודות. החשבון המרכזי מוזז לעתק מרחבי מקסימלי של 4.1 micrometers ולאחר מכן מוחזר למיקומו המקורי תחת אותם נסיבות.
אולם כאשר חרוז המרכז נע במהירות של 82 micrometers per second, נוצרת רצפת פריימים זו. שימו לב לטשטוש התנועה בתמונות השנייה והשלישית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה של אופן התכנון והיישור של מערכת מלכודת אופטית כפולה עם מלכודת הולוגרפית ומלכודת רגילה עצמאיות באותה התקמה.
זכרו כי עבודה עם לייזרים בעלי הספק גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי מגן מתאימים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מערכת המשלבת טכניקות של לכידה אופטית קונבנציונלית והולוגרפית, המאפשרת מניפולציה של מספר לוכדות. גישה חדשנית זו מקלה על יצירת סידורים גיאומטריים מורכבים של חלקיקים שבירים, תוך שהיא מאפשרת מדידות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה של פעילות אנזימטית ביולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- לכוד אופטי
- ביופיזיקה
- מדידת פעילות אנזימטית
רקע
- שיטות לכידה אופטית מסורתיות מוגבלות ביכולתן להפעיל מניפולציה על מספר עצמים בו-זמנית.
- לכידה אופטית הולוגרפית מציעה גמישות משופרת במיקום ובמניפולציה של חלקיקים.
- שילוב של טכניקות אלו יכול לשפר את דיוק המדידה ואת המהירות.
- משתמשים חדשים עשויים להתמודד עם אתגרים בתכנון וביישור של רכיבים אופטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת המאפשרת לכידה אופטית קונבנציונלית והולוגרפית בו-זמנית.
- מתן אפשרות למניפולציה של מספר עצמים בעלי מקדם שבירה בשלושה ממדים.
- סבסוד ביצוע מדידות מהירות של פעילות אנזימים ביולוגית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה וכיול של רכיבי הלכוד האופטי.
- מדידת מיקומים עבור רכיבים אופטיים.
- קיבוע בטוח של רכיבים במיקומים הייעודיים.
- כיול האופטיקה כדי לאפשר לכידה יעילה.
תוצאות עיקריות
- המערכת משלבת בהצלחה טכניקות לכידה קונבנציונליות והולוגרפיות.
- היא מאפשרת מיקום סימולטני של מספר אובייקטים שוברי אור.
- הושגו מדידות במהירות גבוהה של פעילות אנזימטית.
- משתמשים דיווחו על קשיים בהגדרה הראשונית, אך הכירו ביתרונות המערכת.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היכולות של טכניקות לכידה אופטית.
- היא מספקת יתרונות משמעותיים לחוקרים הבוחנים תהליכים ביולוגיים.
- ייתכן שנדרש אימון נוסף עבור משתמשים חדשים כדי לשלוט בהגדרת המערכת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות לכידה אופטית מאפשרות מניפולציה מדויקת של אובייקטים בעלי מקדם שבירה לצורך מדידות כוח ותנועה ברזולוציה גבוהה בסביבות ננומטרים ופיקוניוטונים. שילוב של לכידה קונבנציונלית והולוגרפית מאפשר מיקום סימולטני של מספר אובייקטים ובקרה תלת-ממדית בזמן אמת, דבר התומך במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות מולקולריות ומכניקה תאית. יכולת זו מגבירה את הביטחון בחיזויים בעת תיקוף מטרות, על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה כמותית של כוחות קישור ושינויים קונפורמציוניים בתנאים פיזיולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה ישירה של כוחות קישור מולקולריים ודינמיקה של יצירת קומפלקסים.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי מדידת כוחות בסדר גודל של piconewton הנוצרים על ידי מנועים מולקולריים או פעילות אנזימטית בזמן אמת.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות הפקת נתונים כמותיים של כוח-העתקה המתואמים עם מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה מבוקרת של חרוזי דיאלקטר או אברונים תאיים כחיישני כוח.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירות באמצעות מיקום מדויק וקריאה סימולטנית של מיקום המלכודת ביחס לתנועת האובייקט.
- יכולת הרחבה: תומך במוכנות לסריקה באמצעות יצירת תבניות הולוגרפיות למלכוד מקבילי של מספר אובייקטים בשדה הראייה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על הרלוונטיות למחלה על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה של תכונות מכניות בננו-סקלה בתאים ראשוניים או במודלים שמקורם ברקמה תחת תנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים.
- הסרת סיכונים מכיסטית: מקשרת בין תצפיות בשלב הגילוי לאישוש פרה-קליני באמצעות קריאות של ייצור כוח, המנחות אסטרטגיות למודולציה של המטרה.
- קידום מותאם סיכון: תומכת בהחלטות go/no-go על ידי כימות האופן שבו הפרעות משפיעות על הפלט המכני במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
המערכת משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מדדים ביופיזיקליים כמותיים המנחים את תיעדוף המטרות ואת הבירור של המנגנון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של כוחות בין-מולקולריים ושינויים קונפורמציוניים בקומפלקסים של חלבונים.
- סינון (Screening): מספקת מוכנות למבחנים באמצעות מעקב בעל רזולוציה גבוהה ומהירות גבוהה אחר מיקום של עצמים לכודים, ובכך מקלה על הערכה אמינה של תרכובות באמצעות קריאות מבוססות כוח.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות של העתקה (displacement) בקנה מידה ננומטרי ומדידות כוח בפיקוניוטונים, המאפשרות לצומי מחקר להשוות בין תנאים ולהעריך את יעילות המודולציה של המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לפנוטיפ מכני במערכות תאיות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומכת בהתאמת ביומרקרים למסלולי מכנו-טרנסדוקציה (mechanotransduction).
- שימוש חוזר ברמת הארגון: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לצורך ניתוח רב-פרמטרי לאורך פרויקטים שונים, ובכך מפחיתה הגדרות מערכת כפולות ומאפשרת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מדידת כוח בין צוותים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון תחזיתי באמצעות מדידה ישירה וללא סימון (label-free) של פלטים מכניים, המפחיתה עמימות בפירוש המנגנון של המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות תבניות לכידה הולוגרפיות ובקרה סימולטנית של מספר אובייקטים, מה שמשפר את התפוקה במערכי מדידת כוחות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות באמצעות נתוני כוח כמותיים, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים עקב חסרונות מכניים בלתי צפויים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים וכמותיים על חוזק המעורבות במטרה ודינמיקה קונפורמציונית על פני מולקולות מועמדות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור אופטי, בטיחות בלייזר ואופטימיזציה של נתיב הקרן עבור מערכות לכידה בעלות שני אורכי גל.
- תלוי בתשתית יציבה של שולחן אופטי, שלבי הזזה מדויקים ורכיבים תואמים לאינפרה-אדום לשילוב לייזרים של 980 nm ו-1064 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי לכידה, נהלי כיול ותהליכי ניתוח נתונים לקריאות של כוח והעתקה.
- כולל שיקולי התאמה במעבר מבדיקות מבוססות חרוזיים לתאים ראשוניים או לנתחי רקמה, בשל מקדמי שבירה משתנים ומגבלות חיוניות של הדגימות.
- מוגבל על ידי מורכבות היישור ואבberations פוטנציאליות הנובעות מפרופילי קרן שאינם תואמים, במיוחד כאשר תבניות הולוגרפיות מקיימות אינטראקציה עם הגאומטריה של הש modulator של האור המרחבי.
