הכנה משופרת ושימור פרוסות עכבר היפוקמפוס להקלטה יציבה מאוד ושחזור של הגברה לטווח ארוך

מאמר זה מציג מתודולוגיה שלמה להכין ולשמור

המטרה הכוללת של הליך זה היא להיות מסוגל לרשום חיזוק יציב מאוד וניתן לשחזור לטווח ארוך בפרוסות היפוקמפוס חריפות . זה מושג על ידי חילוץ מוח העכבר וניתוח ההיפוקמפוס ב-CSF קר תחת המיקרוסקופ. השלב השני הוא לחתוך פרוסות היפוקמפוס רוחביות בעזרת קוצץ רקמות.

לאחר מכן, הפרוסה מונחת בתא ההקלטה של הממשק, אשר יוזרם בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן. השלב האחרון הוא למקם את האלקטרודות ולתעד את הפעילות הסינפטית באזור CA אחד של ההיפוקמפוס. בסופו של דבר, נעשה שימוש בפרוטוקול של גירוי בתדר גבוה כדי להראות אינדוקציה של חיזוק יציב מאוד לטווח ארוך.

באמצעות שיטה זו יכול לספק תובנה לגבי המנגנון העומד בבסיס הפלסטיות הסינפטית. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון מודלים של בעלי חיים של מערכת עצבים ניוונית או עצבית, או על מחלות חיסוניות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שכל המניפולציות דורשות מיומנות רבה ותרגול רב.

התחל הליך זה על ידי שטיפת מעגל הזלוף במים מזוקקים למשך 20 דקות לפחות. ואז הפעל את מערכות החימום. התחל את הקרבוגן מבעבע במעגל.

הקרבוגן מועבר לאמבט המים מתחת לתא ההקלטה דרך מפזרי אוויר. לאחר מכן, שלוט בקצב הזרימה באמבט המים על ידי מד זרימה לאחר מכן, רוקנו את המעגל ומלאו אותו בהקשה מסוננת של CSF כדי להסיר את הבועות. לאחר מכן הניחו את הטבעת, שתתמוך בפרוסה בתא האחיזה.

הסר בזהירות את כל בועות האוויר מהמעגל. לאחר מכן כוונן את רמת ה-A CSF בתא ההקלטה עם בורג מחט היניקה, מהירות משאבת הכניסה מותאמת למיליליטר אחד לדקה, ומשאבת היציאה מותאמת לחמישה מיליליטר לדקה. לפני הדיסקציה הכינו את כל מכשירי הניתוח.

להסיר את מוחו של עכבר שהוקרב. החזק את ראשו עם האצבע המורה והאגודל, ובצע חתך עם המספריים המנתחים לאורך אמצע החלק העליון של הראש, החל מקצה הגיליוטינה, חתוך ורץ עד העצם הקדמית. לאחר מכן, חתכו את השריר העורי בכל צד של הראש כדי לחשוף את לוחות הגולגולת במלואם.

לאחר מכן הסר את השרירים בצד החיבוק של הראש. לאחר מכן חותכים את שריר הטמפורליס מכל צד לאורך צלחת הטמפורליס. ואז חותכים את הלוחות הקדמיים באמצע לרוחב.

כעת חתכו מעט את עצם העורף בין שתי הלוחות. חותכים בבסיס הפינוק של הלוחות העורפיים מכל צד. ואז בעזרת המספריים הקפיציים, חותכים לאורך התפר הסגיטלי.

לבסוף, הסר את הגולגולת על ידי פיזור החצאים זה מזה בעזרת מלקחיים. כעת, כשהאזמל נחתך ממש לפני המוח הקטן וממש אחרי פקעת הריח, העבירו לרוחב את המוח המופק לכלי הניתוח עם CSF קר. ברגע שהמוח יוצא בצלחת הניתוח, נתק את שתי ההמיספרות זו מזו עם אזמל המוחדר באמצע תחת מיקרוסקופ כירורגי דו-עיני, פרש בזהירות את המבנה של חצי כדור אחד כדי לחשוף את החדר הצדדי.

הסר את גזע המוח והצפלון על ידי הנחת מרית אחת על קליפת המוח הקדמית והמרית השנייה על הצפלון. היזהר לא לגעת בהיפוקמפוס עם המרית ולא למתוח אותו במהלך חתך הרקמות. לאחר מכן, חתכו את הפורניקס.

לאחר מכן דחף בעדינות את ההיפוקמפוס החוצה מקליפת המוח על ידי החדרת מרית לחדר. כאשר מוציאים את ההיפוקמפוס, הסר עודפי רקמת קליפת המוח וכלי הדם הנותרים בעזרת פיפטת מרעה מפלסטיק עם פה רחב. העבירו את ההיפוקמפוס בכפית כשפני השטח שלו כלפי מעלה אל פלטפורמת המסוק.

מוציאים עודפי נוזלים מהכף בעזרת פיפטת מרעה רגילה מפלסטיק. לאחר מכן, הטה את הכף אנכית וכמעט נוגע בנייר הסינון שעל המסוק. הורידו את ההיפוקמפוס על ידי נגיעה מהירה בנייר המסנן.

ואז משוך את הכפית. לאחר מכן, כוונו את ההיפוקמפוס ופרסו אותו. לרוחב עד 400 מיקרון עם המסוק.

בצע את ההליך במהירות האפשרית. לאחר מכן, הסר את נייר הסינון עם פרוסות ההיפוקמפוס ועטוף אותו סביב הגליל המתכתי על מנת לפזר מעט את הפרוסות. לאחר מכן שחררו את הפרוסות בתרסיסים של CSF בעזרת פיפטה פסטורלית מפלסטיק סטנדרטית ואספו אותן בצלחת פטרי מלאה בקור.

CSF. העבירו את הפרוסה שנבחרה לתא ההקלטה בעזרת פיפטה רגילה מפלסטיק. אפשר לפרוסה להתאושש מטראומת הדיסקציה בתא ממשק ההקלטה ב-28 מעלות צלזיוס.

אם הפרוסה שוקעת, הורידו את רמת A CSF לרמת הפרוסה, והרימו שוב את רמת A CSF כדי לגרום לפרוסה לצוף. לאחר מכן, כוון את הפרוסה למצב שיקל על מיקום האלקטרודות באזור CA אחד. הפסק להוריד את רמת ה- CSF A כאשר היא נמצאת בממשק.

המניסקוס של המדיה סביב הפרוסה מעיד על רמה מספקת של A CSF. הרשת חייבת להיות רוויה במדיה אך לא שקועה לחלוטין. לאחר מכן שמור את החדר מכוסה בניירות סינון מעל המכסה המחורר.

הניחו לפרוסה לנוח לפחות שעה ו-30 דקות בחום של 28 מעלות צלזיוס לפני ההקלטה. להלן סקיצה המציגה שני קלטים סינפטיים בלתי תלויים כ-1 ו-S 2 לאותה אוכלוסייה עצבית. מסלול S אחד שימש לגרימת LTP ואילו מסלול S שני שימש כבקרה.

אלו הן עקבות ה-F-E-P-S-P לדוגמה שנרשמו ממש לפני השראת ה-LTP כפי שמצוין על ידי העקבות האדומות ושעה לאחר השראת LDP המסומנת על ידי העקבות הכחולות. הנה ה-F EPSPs מפרוסה בריאה לחלוטין, והנה ה-F EPSPs מפרוסה המציגים רמה גבוהה של ריגוש כאשר הפרוסות אינן בריאות לחלוטין. נצפות תגובות סינפטיות של פוליס, ועוצמת שיפוע F-E-P-S-P מופחתת.

להלן השוואה של מסלולי הזמן של שיפוע F-E-P-S-P לאחר LTP המושרה על ידי רכבת אחת של גירוי בתדר גבוה שתועדה ב-2005, 2010 ו-2011 במעבדה שלנו. ניסויים ראשונים תועדו ב-2005 שצוינו על ידי עיגולים מלאים. הקלטות עוקבות שצוינו על ידי ריבועים מלאים נהנו מהליך חיתוך משופר.

התוצאות הנוכחיות נובעות מאופטימיזציה של חמצון ממשק ובקרת טמפרטורה, יחד עם סטנדרטיזציה של אלקטרודות כפי שמצוין על ידי מעגלים פתוחים. כאן אנו מראים כי הגדלת קצב זרימת החמצן באמבט המים מתחת לתא ההקלטה מ-0.15 ל-0.25 ליטר לדקה כפי שמצוין על ידי העקומה הכחולה, גורמת לירידה בשיפוע F-E-P-S-P ב-20%, מה שמעלה את הטמפרטורה מ-28 ל-29 מעלות צלזיוס. כפי שצוין, העקומה הירוקה גורמת לעלייה של יותר מ-50% בשיפוע F-E-P-S-P.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל שלב הוא קריטי ושגיאות בפרוטוקול עלולות להוביל לתוצאות שונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד להשיג חיזוק יציב מאוד לטווח הארוך. הקלטה בפרוסות היפוקמפוס חדות.