Name: Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: למדו לבודד נוירונים טהורים מתרבות תאי גזע עצביים אנושיים באמצעות Microdissection לכידת לייזר. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ספציפי לנוירונים במחקר נוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הצטיינות סקירה (NEUD-004-07F) מהמנהל הוותיקים (לSP).

1. הרחבת NPCs האדם (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות את המניה הקפואה של NPCs אדם מהמוח העוברי (Lonza, Walkersville, MD, ארצות הברית) ותרבותם בהשעיה בT-75 צלוחיות כneurospheres (איור 1 א) במדיום neurobasal המכילה תוספי התפשטות, EGF (10 ng / ml) ו FGF (10 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים בתרבות, להעביר את neurospheres לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant והותיר אחריו ~ 100 בינוני μl מעל התא גלולה ולהעביר לתוך צינור Eppendorf. גלולה 100 תא μl מספיק להתפצל ל2 T-75 צלוחיות. אם פחות, לצמצם את מספר צלוחיות כתאי neuroprogenitor מצליחים להתרבות אם לפצל דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate את הכדור עם קצה μl 200 50x, תוך שמירה על קצה 200 μl נגד החלק התחתון של הצינור. מחלקים את ההשעיה התא באופן שווה לשני חלקים ולהוסיף אותם ל2 T-75 צלוחיות (1-2 מפוצל), אחת להמשיךהתרחבות ונוספת לבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך התרבות של תאי neuroprogenitor להרחבה (בקבוק הראשון) על ידי שינוי הבינוני כל 4-5 ימים עד neurospheres להגיע לגודלם המקורי של 300-500 מיקרומטר. השנה בינונית על ידי צנטריפוגה (סל&quot;ד 500; 5 דקות), לבטל את המדיום הישן ולהוסיף מדיום חדש. </li></ol> 2. בידול של NPCs האדם לתרבות Neuron עשירה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמיינות של תאי neuroprogenitor לתרבות עשירה של תאי עצב, במקום coverslip יחיד לבאר כל צלחת 24 גם ומעיל עם 100 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי-L-ליזין על ידי הוספת 500 μl לכל אחד. דגירה את הכלים ל30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב-L-ליזין פולי הפתרון ולשטוף את הצלחת עם מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, מעיל הבארות של הצלחת עם 500 μl 5 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את הבארות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ימים לאחר splitting התאים (שלב 1.4), להעביר את neurospheres הקטנה בבקבוק שכותרתו &#39;לבידול&#39; לכלים מצופים בצפיפות של ~ 500 neurospheres לכל טוב של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות, כאשר neurospheres לצרף הצלחת, להסיר את מדיום ההתפשטות ולהוסיף בינוני בידול בהיקף של מדיום neurobasal, תוסף B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 מ&quot;מ), וחומצה רטינואית (2 מיקרומטר). </li></ol> 3. הכתמה Immunofluorescence של NPCs הבדיל (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התרבות של תאי neuroprogenitor במדיום בידול עצבי במשך שבועיים, תרבות נוירון עשיר מתקבלת. יש לשטוף את תאי העצב פעם אחת ב PBS ולאחר מכן לתקן אותם בparaformaldehyde 4% במשך 30 דקות. ברגע שנקבע, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חיץ permeabilization (BSA 5% ו0.2% טריטון X-100 PBS) ב RT עבור 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות O / N ב 4 i C °שייקר na עם השילוב הבא של polyclonal ונוגדנים חד שבטיים בBSA 3% ב-PBS: NeuN (1:250) וsynapsin (1:250); אצטיל כולינסטרז (1:500) וsynaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) וGAP43 (1:250); STAT3 (1:500) וGFAP (1:1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה אותם עם נגד ארנב-Cy3 ונוגדנים משני אנטי עכבר FITC ב RT בחושך במשך 90 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10 μl של מדיום הרכבה על גבי זכוכית, להוציא את coverslip ממנת התרבות עם מלקחיים, ולמקם אותו במהופך על ההרכבה בינונית. בעדינות, לנגב כל מדיום הרכבה עודף וסוגר את הקצוות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הנוירונים immunostained במיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 4. Microdissection לכידת לייזר של נוירונים (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל NPCs לתרבות נוירון עשיר בשקופית קרום PENs מצופה laminin פולי-L-ליזין והעכבר בעקבות ההליכים המתוארים באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל השלבים הבאים בתנאי RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התרבויות באמצעות HistoGene כתם (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא האזורים של אוכלוסיות נוירונים טהורות נטולות האסטרוציטים באמצעות תמונת מפת הדרכים של כל השקופית עם מערכת Veritas LCM. סמן את תאי העצב באמצעות כלי הציור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע לכידת לייזר של אזורים אלה באמצעות דיוק מבוקר מחשב ואוטומציה בתהליך בן שני שלבים. ראשית, IR (אינפרא אדום) הוא ירה בנקודות מרובות עם הגדרת חשמל לייזר של 70 mW ודופק של 2,500 μsec כדי לקבל הקרום לצרף את הכובע. בשלב בא, באזור המסומן הוא נכרת באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 mV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב של תהליכים אלה באופן סלקטיבי לוכד את האזורים המסומנים מן הקרום PEN על כובעי מאקרו CapSure LCM. כאשר הכובע הוא הרים, הקרום עם neurons שומרת על הכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA הכולל דגימות LCM באמצעות ערכת PicoPure RNA בידוד (ארקטורוס) ולטפל עם DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את RNA הבודד באמצעות ערכת ההגברה RiboAMP RNA הבאה הוראות מהערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח בזמן אמת RT-PCR באמצעות בדיקות TaqMan לזהות שרשרת כבדה neurofilament האנושי (hNFHc). </li></ol> קיצורים: לספירה, מחלת אלצהיימר; BDNF, גורם נוירוטרופי שמקורם במוח; CREB חלבון, מחזורי אלמנט תגובת AMP מחייב; DBC, AMP המחזורי Dibutyryl; EGF, גורם הגדילה באפידרמיס, FGF, גורם גדילה פיברובלסטים; GFAP, חלבון חומצי fibrillary גליה; LCM, לייזר ללכוד microdissection; NGF, גורם גדילה עצבי; NPC, neuroprogenitor תא; PEN, naphthalate פוליאתילן.

<ol><li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+identity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li>
<li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li>
<li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li>
<li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li>
<li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li>
<li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer%27s+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).</li>
<li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation%3A+from+neurotransmitters+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li>
<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים להכריז.

אנו מתארים במחקר זה מודל הנוירון עשיר בתרבית תאים בהתמיינות של תאי neuroprogenitor אנושיים עצמי חידוש ושיטה לבודד את אוכלוסייה טהורה של תאי עצב על ידי microdissection ללכוד לייזר. יש לנו השתמשתי בשילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לבידול עצבי של NPCs. DBC משמש להפעלת CREB, גורם שעתוק שמשפר את הנוירוגנזה 12. חומצה הרטינואית גורמת ליציאת מחזור התא ומפחיתה את אוכלוסיית גליה 13. השיטה המתוארת במחקר זה משלבת שינויים על הדוח הקודם שלנו 14. אנחנו קוד...

נוירוגנזה חיים ארוכים ידועה להתרחש באזור subventricular של החדרים לרוחב ובשכבת subgranular של gyrus משוננת של המוח של היונקים הבוגרים 1. תאי Neuroprogenitor (NPCs) שמקורם באזורים אלה הם תאי multipotent שיכול להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes 2. NPCs יצרו עניין בשל הפוטנציאל שלהם להיות מושתלים בחולים עם הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) 3. מחקרים עם NPCs יש בדרך כלל מתמקדים בזווית ההשתלה הזה, אבל את הפוטנציאל של תאי עצב שמקורם בNPC כמודל תרבית תאים כדי לקבוע את המנגנון של ניוון מוחיים לא נוצל במלואו. מחקרים קודמים המשמשים בדרך כלל נוירונים לאחר mitotic בודדו מרקמות המוח מכרסם אשר צריכים להיות מבודדים עבור כל ניסוי כפי שהם לאחידוש עצמי. למרות שניתן להרחיב שורות תאי נוירובלסטומה האדם כולל SH-SY5Y ותאי SK-N-MC, אין להם את המאפיינים של נוירונים עיקרי. NPCs אדם, לעומת זאת, מציע גם יתרונות כי הם יכולים להיות מורחבים למעברים מרובים ויכולים להיות מובחן כדי לייצר אוכלוסיית תא עם המאפיינים של נוירונים העיקרי 4,5. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול בידול חדש כדי להשיג אוכלוסיית נוירון עשיר עקבית מNPCs זמין מסחרי מבודד מהמוח העוברי אנושי. מכיוון שתרבויות אלה מכילות אחוז קטן של תאי גליה, אנחנו צריכים שיטות נוספות כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי עצב לאפיון מולקולרי. microdissection ללכוד לייזר (LCM) הוא טכניקה חדשנית שבו אוכלוסייה הומוגנית של תאים מקטע רקמה יכולה להיות שנתפסו באופן סלקטיבי לניתוח ביטוי גנים 6. המוח הוא רקמה הטרוגנית המורכבת של נוירונים, גליה וטאי הסלולרי האחרPES. LCM נעשה שימוש כדי לקבוע ביטוי נוירון הספציפי גן מנתח 7-10. אנחנו ביצענו בעבר LCM של נוירונים בהיפוקמפוס מחלקים לספירה (Tg2576) מוח עכבר כדי להראות ביטוי ירידה של חלבון מחייב אלמנט תגובת AMP המחזורי (CREB) וBDNF במיוחד בנוירונים בהיפוקמפוס 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליכים להרחבת NPCs אדם, בידול עצבי, מכתים immunofluorescent עבור סמנים עצביים ו LCM עבור הבידוד של נוירונים בתרבית בשקופיות קרום PEN.

<table><tbody><tr><td>תאי נוירו-פרוגניטור (NPCs) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A מדיום בסיסי אנושי</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A תוסף התפשטות</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A תוסף התמיינות</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27 (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים </td><td>סיגמא</td><td>F0291</td><td></td></tr> <tr><td>איתות תאי</td><td>גורם נוירוטרופי שמקורו במוח </td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה עצבי </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>דיבוטיריל מחזורי AMP</td><td>סיגמא</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין </td><td>סיגמא</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>למינין עכבר </td><td>סיגמא</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>סיגמא</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3 נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP</td><td>איתות תאים</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43</td><td>מעבדות העברת נוגדנים</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן BDNF</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אצטיל כולינאסטראז </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Synaptophysin</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן</td><td>NeuN Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן סינפסין</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>אנטי עכבר FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מעבדות</td><td></td><td></td>מחקר</tr><tr><td>אנטי ארנב Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מעבדות</td><td></td><td></td>מחקר</tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (החלקת כיסוי עיגול גדול)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה (זהב מאריך)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת עט</td><td>יישומית ביו-מערכות יישומיות</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת חתך קפוא Histogene LCM</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הגברת RNA RiboAmp</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA של Picopure</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>Capsureכובעי LCM</td><td>של Macro ביו-מערכות יישומיות</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים neuroprogenitor אדם בתרבות

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

תאי Neuroprogenitor (NPCs) מבודדים מהמוח העוברי האנושי הורחבו בתנאי שגשוג בנוכחות גורם אפידרמיס צמיחה (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) כדי לספק שפע של תאים. NPCs הובדלו בנוכחות שילוב חדש של גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורם במוח (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) וחומצה רטינואית על מנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר כדי להשיג נוירון עשירה בתרבויות. NPCs גם הובדלו בהעדר neurotrophins, DBC וחומצה רטינואית ובנוכחותו של גורם נוירוטרופי הריסים (CNTF) להניב תרבויות astrocyte עשיר. NPCs המובחן התאפיינו מכתים immunofluorescence לפנל של סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43. חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) וSTAT3, סמני astrocyte, התגלו ב10-15% מNPCs המובחן. כדי להקל עלאפיון מולקולרי תאים מסוג מסוים, microdissection ללכוד לייזר בוצע לבודד את תאי עצב בתרבית על naphthalate פוליאתילן שקופיות קרום (PEN). השיטות שתוארו במחקר זה מספקים כלים רבי ערך כדי לקדם את ההבנה של המנגנון המולקולרי של ניוון מוחיים שלנו.

הרחבת NPCs (איור 1) כאשר neurospheres מפורקים להשעית תא בודדת על ידי טחינה דקה, קצה פיפטה צריך לגעת בתחתית של התחתית, כך שיש התנגדות מסוימת, כאשר השעית pipetted למעלה ולמטה. את מספר הפעמים של טחינה דקה ינוע בין יחידים וצריך להיות מוכרע על ידי ניסוי וטעייה על ידי בחינת ההשעיה תא וכתוצאה מכך מתחת למיקרוסקופ. זה קריטי כדי לספק צפיפות מספקת של השעיה תא בגלל הריבוי יהיה בקצב מהיר יותר כאשר NPCs בא במגע ק...

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח מודל של תרבית נוירונים אנושיים, לזהות סמנים נוירונליים ולבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים לצורך אנליזה של ביטוי גנים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הרחבת תאי אב נוירוגניים אנושיים כדי ליצור אספקה רציפה של תאי אב. כשלב שני, תאי האב הנוירוגניים נתרבטים בנוכחות תוספי דיפרנציאציה וגורמי גדילה נוירוטרופיים בצלחות מצופות בגורמי היצמדות.בשלב הבא, מבוצע צביעה אימונופלואורסצנטית לסמני עצביים כדי לקבוע את גורלן של תאי progenitor עצביים מובחנים. לבסוף, מבוצע מיקרו-דיסקציה בשביעת לייזר (laser capture microdissection) של נוירונים שגודלו על גשריות עם ממברנת PEN, כדי לאפשר ניתוח של ביטוי גנים ספציפי לנוירונים. התוצאות המתקבלות מראות כי תאי progenitor עצביים מובחנים הם בעלי אופי נוירונלי ברובם.בהתבסס על צביעה אימונופלואורסצנטית ולכידת נוירונים. באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר (laser capture microdissection), ניתן להרבות תאי אב עצביים אנושיים ולהבדילם לתרביות עשירות בנוירונים. עבור מחקרים in vitro, מכיוון שתרביות אלו מכילות תאי גליה, ניתן להשתמש במיקרודיסקציה בלייזר כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים.את הפרוצדורות הללו ידגים רון בושאר (Ron Bouchard), עמית מחקר בכיר במעבדת המיקרוסקופיה המרכזית שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש להחזיר למצב פעיל מאגר קפוא של תאי אב עצביים אנושיים (human neuro progenitor cells) שבודדו ממוח עוברי על ידי חימום מהיר ל-37 °C, ולאחר מכן הוספתם לבקבוק T 75 המכיל 15 milliliters של מצע בסיסי לעצבים (neuro basal medium) שחומם מראש והועשיר ב-10 nanograms per milliliter של EGF ו-FGF. לאחר גידול התאים במשך שלושה ימים, העבירו את הנוירוספירות (neurospheres) למבחנה של 15 milliliters והשקיעו אותן באמצעות סבב צנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant), והשאירו כ-100 µL של מצע, והעבירו את משקע התאים למבחנת אפנדורף.משקע תאים של 100 µl מספיק כדי לפצל לשני בקבוקי T 75. אם הכמות קטנה יותר, יש להפחית את מספר הבקבוקים כיוון שתאי אב עצביים נכשלים בהתרבות. אם הפיצול דליל, יש לפרק ביסודיות את הנוירוספירות לתלים של תאים בודדים על ידי פיפטינג של 50 פעמים למעלה ולמטה, תוך הצמדת טיפ של 200 µl לתחתית המבחנה.בדקו ויזואלית את ההתקדמות באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא את התפרקות הנוספירות (neurospheres). לאחר מכן, חלקו את תרחיף התאים באופן שווה והוסיפו אותו לשני בקבוקי T 75. בקבוק אחד להמשך הרחבה ובקבוק שני לצורך דיפרנציאציה.לאחר מכן, דגרו את הבקבוקים. החליפו את המצע של תאי המוצא העצביים בבקבוק המיועד להרחבה באמצעות סנטריפוגציה. לאחר מכן, השליכו את המצע הישן והוסיפו מצע חדש.החליפו את המצע מדי ארבעה עד חמישה ימים עד שהנוספירות (neurospheres) יגיעו לגודלן המקורי של 300 עד 500 מיקרון. כדי להתחיל את התמיינות תאי progenitor עצביים לתרבית עשירה בנוירונים, הניחו זכוכית כיסוי בודדת בכל באער של פלטת 24 באערים וצפו אותן על ידי הוספת 500 µL של 100 µg/mL poly L lysine לכל באער. הדגרירו את הצלחות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאבו את תמיסת ה-poly L lysine.שטפו את הפלטה במים סטריליים דה-יוניזים ושאבו את הנוזל שוב. לאחר מכן, ציפו את בארות הפלטה ב-500 µL של laminin מעכבר בריכוז של 5 µg/mL והדגירו למשך 30 דקות; לאחר ההדגרה, שטפו את הבארות ב-PBS, שאבו את הנוזל שוב והניחו להן להתייבש במנדף לתרביות רקמה. ארבעה ימים לאחר פיצול התאים, העבירו את הנוספירות הקטנות מהבקבוק המסומן לדיפרנציאציה אל פלטת 24 הבארות המצופה.הוסיפו צפיפות של כ-500 נוירוספירות למבחנה. לאחר הדגרה של שש שעות, כאשר הנוירוספירות נצמדו למדחף, הסירו את מצע ההתרבות והוסיפו מצע דיפרנציאציה. המצע מורכב מ-neuro basal medium, תוספת B 27, NGF, BDNF, bFGF וחומצה רטינואית. החזירו את הפלטה לאינקובטור. לאחר גידול של תאי אב עצביים במצע דיפרנציאציה עצבית למשך שבועיים, מתקבל תרבית עשירה בנוירונים.שטפו את הנוירונים פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן קבעו אותם ב-4%paraform aldehyde למשך 30 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הכינו את התאים לצביעה אימונוהיסטוכימית על ידי דגירה של התאים עם בופר חדירה (permeable buffer) בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.בשלב הבא, יש להוסיף לבארות נוגדנים פוליקלונליים ומונוקלונליים בריכוז 3%BSA ב-PBS. לאחר הוספה של זוג נוגדנים שונה לכל בארה, יש לדגרה אותן למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בשייקר. למחרת בבוקר, יש לשטוף את לביבות הזכוכית (cover slips) שלוש פעמים ב-PBS ולאחר מכן לדגרה עם נוגדנים משניים anti-rabbit P SI 3 ו-anti-US fitzy בטמפרטורת החדר, בחשיפה מוגבלת לאור, למשך 90 דקות לאחר הדגירה.שטפו את לבישוני הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הניחו 10 µL של תמיסת קיבוע על זכוכית של סלייד. הוציאו את לבישון הכיסוי ממעטחת התרבית והניחו אותו, כשהוא הפוך, על תמיסת הקיבוע.נגבו בעדינות שאריות של מדיום קיבוע וחתמו את הקצוות באמצעות לק ציפורניים. כדי להכין את התאים למיקרו-דיסקציה, הגדילו תחילה תאי אב עצביים (neuro progenitor cells) לתרבית עשירה בנוירונים על ממב كرة PEN. השתמשו בلامיסות המצופות ב-poly L lysine ובלמינין.בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נקיים מ-RNA. לאחר מכן, צבע את התרביות באמצעות צבע histo gene כדי להדמיא את התאים; צבע ה-histo gene צובע את הגרעינים בסגול ואת הציטופלזמה בוורוד בהיר, מה שמקל על ההבחנה בין נוירונים לתאי גליה על פי המורפולוגיה המובחנת שלהם. הנח את הפסחית ב-75% ethanol ובמים סטריליים דה-יוניזציה למשך 30 שניות.לאחר מכן, הניחו את הזריקה על נייר Kim wipe. הוסיפו 200 µL של histo gene והמתינו 20 שניות. לאחר מכן, טבלו את הזריקה באופן רצף למשך 30 שניות בכל אחד מהנוסחאות הבאות: מים סטריליים דה-יוניים, 75% ethanol, 95% ethanol ו-100% ethanol.לאחר מכן, הניחו בחילון למשך חמש דקות וייבשו על נייר Kim wipe למשך חמישה דקות. לאחר מכן, הניחו שקופית עם ממבברת PEN מעל השקופית הרגילה והכניסו אותן למערכת Veritas לביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection) או LCM באמצעות התוכנה. בצעו צילום מיפוי (roadmap image) כדי לאתר אזורים של אוכלוסיות נוירונליות טהורות נטולות אסטרוציטים.סמנו נוירונים אלו באמצעות כלי הרישום. לאחר מכן, בצעו לכידה בלייזר (laser capture) של אזורים אלו תוך שימוש בדיוק ואוטומציה מבוקרי מחשב בתהליך בן שני שלבים. ראשית, קרן IR נורה במספר נקודות עם הגדרת עוצמת לייזר של 70 milliwatts ופעימה של 2,500 microseconds כדי להצמיד את הממברנה למכסה.בשלב הבא, מסירים את האזור המסומן באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 millivolts. השילוב של תהליכים אלה לוכד באופן סלקטיבי את האזורים המסומנים על גבי מכסי לכידה של LCM. לאחר לכידה של לפחות 100 נוירונים, השתמש במיקרוסקופ כדי להסיר את הממברנה מהמכסה ולהניח אותה בתוך מבחנה.בודד RNA כולל מדגימות LCM באמצעות ערכה לבידוד RNA של P OPU וטפל ב-DNAs. לאחר מכן, הגבר את ה-RNA המבודד באמצעות ערכה להגברת RNA מסוג ribo amp בהתאם להוראות המצורפות לערכה. לבסוף, בצע אנליזת real-time R-T-P-C-R באמצעות גששים מסוג TAC MAN לזיהוי שרשראת כבדה של נוירופילמנט אנושי.תרבית עשירה בנוירונים מתקבלת על ידי גזירה של נוירוספירות בנות ארבעה ימים באמצעות משטחים מצופים ב-poly L lysine ובלמינאט, בשילוב עם גורמי גדילה ספציפיים לגזירה. לאחר שבועיים, מתקבלת תרבית עשירה בנוירונים, כפי שמוצג כאן, באזורים בעלי צפיפות נמוכה. התאים עשויים לגזור לאסטרוציטים, כפי שניתן לראות כאן.ניתן להכווין גם את התמיינות האסטרוציטים על ידי שימוש בגורם הגדילה CNTF במקום אלה המשמשים לתמיינות נוירונים. ניתן לזהות תמיינות נוירונים באמצעות נוגדנים לסממנים נוירונליים ספציפיים, כגון NeuN ו-synapsin, acetylcholinesterase ו-synaptophysin, וכן BDNF ו-GAP 43. צביעה חיובית מהווה עדות לכך שהתאים המובחנים הם בעלי מאפיינים של נוירונים ראשוניים. בנוסף, ניתן לזהות אסטרוציטים באמצעות צביעת אימונו-היסטוכימיה חיובית ל-stat3 ו-GFAP.מיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture microdissection) של נוירונים מבוצעת על תאים שעברו דיפרנציאציה על שקופיות ממברנת PEN מצופות poly L lysine ולמינין; המוצגים כאן הם נוירונים שנצבעו ב-histo stain. כדי להדמינ את התאים, ניתן לסמן את התאים הרלוונטיים באמצעות לייזר, הממיס את ממברנת ה-PEN וגורם לה להיצמד למכסה הלכידה הממוקמת מעליה. לבסוף, ניתן לסמן וללכוד תאים רבים על אותו מכסה לצורך אנליזת DNA או RNA.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידוד נוירונים באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection).

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מתאר את המניפולציה של נוירונים בתרבית באמצעות לייזר פינצטה במבחנה.

בעזרת פינצטה לייזר עבור מניפולציה נוירונים מבודד במבחנה

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

מקור: Palma-Tortosa, S., et.al. תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים השתלה של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות רקמת קליפת המוח האנושית. ההליך כולל בידוד והשעיה מחדש של תאי אב במטריצת קרום מרתף, ולאחר מכן הזרקתם לפרוסה קליפת המוח המונחת על מכלול טרנסוול. לאחר הדגירה כדי לאפשר התמצקות מטריצה והתמיינות עצבית, הרקמה המושתלת מוכנה לניתוח נוסף.

השתלת אבות עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות קליפת המוח האנושיות

סרטון זה מדגים שיטה להתמיין תאי אב עצביים אנושיים (NPCs) לנוירונים. ה-NPCs מוכנסים לתרבית משותפת של נוירונים קורטיקליים אסטרוציטים-חולדות בעכברים, ומקדמים התמיינות NPC לנוירונים. ההתמיינות מאושרת על ידי הדמיה של התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

טכניקת תרבית משותפת להבחנה של תאי אב עצביים אנושיים לתאי עצב

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

במחקר זה, פלטפורמה חדשנית לחקור חתימות מולקולריות intraneuronal של תגובה לטיפול בהפרעה דו-קוטבית (BD) פותחה ומאומת. אפיתל ריח מחולי BD הושג באמצעות ביופסיות האף. אז microdissection לייזר ללכוד היה בשילוב עם זמן אמת RT PCR לחקור את החתימה המולקולרית של תגובה ליתיום בBD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

למדו לבודד נוירונים טהורים מתרבות תאי גזע עצביים אנושיים באמצעות Microdissection לכידת לייזר. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ספציפי לנוירונים במחקר נוירולוגי.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

גלה סרטונים נוספים