Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות
16 בספטמבר 2013
תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח מודל של תרבית נוירונים אנושיים, לזהות סמנים נוירונליים ולבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים לצורך אנליזה של ביטוי גנים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הרחבת תאי אב נוירוגניים אנושיים כדי ליצור אספקה רציפה של תאי אב. כשלב שני, תאי האב הנוירוגניים נתרבטים בנוכחות תוספי דיפרנציאציה וגורמי גדילה נוירוטרופיים בצלחות מצופות בגורמי היצמדות.
בשלב הבא, מבוצע צביעה אימונופלואורסצנטית לסמני עצביים כדי לקבוע את גורלן של תאי progenitor עצביים מובחנים. לבסוף, מבוצע מיקרו-דיסקציה בשביעת לייזר (laser capture microdissection) של נוירונים שגודלו על גשריות עם ממברנת PEN, כדי לאפשר ניתוח של ביטוי גנים ספציפי לנוירונים. התוצאות המתקבלות מראות כי תאי progenitor עצביים מובחנים הם בעלי אופי נוירונלי ברובם.
בהתבסס על צביעה אימונופלואורסצנטית ולכידת נוירונים. באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר (laser capture microdissection), ניתן להרבות תאי אב עצביים אנושיים ולהבדילם לתרביות עשירות בנוירונים. עבור מחקרים in vitro, מכיוון שתרביות אלו מכילות תאי גליה, ניתן להשתמש במיקרודיסקציה בלייזר כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים.
את הפרוצדורות הללו ידגים רון בושאר (Ron Bouchard), עמית מחקר בכיר במעבדת המיקרוסקופיה המרכזית שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש להחזיר למצב פעיל מאגר קפוא של תאי אב עצביים אנושיים (human neuro progenitor cells) שבודדו ממוח עוברי על ידי חימום מהיר ל-37 °C, ולאחר מכן הוספתם לבקבוק T 75 המכיל 15 milliliters של מצע בסיסי לעצבים (neuro basal medium) שחומם מראש והועשיר ב-10 nanograms per milliliter של EGF ו-FGF. לאחר גידול התאים במשך שלושה ימים, העבירו את הנוירוספירות (neurospheres) למבחנה של 15 milliliters והשקיעו אותן באמצעות סבב צנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant), והשאירו כ-100 µL של מצע, והעבירו את משקע התאים למבחנת אפנדורף.
משקע תאים של 100 µl מספיק כדי לפצל לשני בקבוקי T 75. אם הכמות קטנה יותר, יש להפחית את מספר הבקבוקים כיוון שתאי אב עצביים נכשלים בהתרבות. אם הפיצול דליל, יש לפרק ביסודיות את הנוירוספירות לתלים של תאים בודדים על ידי פיפטינג של 50 פעמים למעלה ולמטה, תוך הצמדת טיפ של 200 µl לתחתית המבחנה.
בדקו ויזואלית את ההתקדמות באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא את התפרקות הנוספירות (neurospheres). לאחר מכן, חלקו את תרחיף התאים באופן שווה והוסיפו אותו לשני בקבוקי T 75. בקבוק אחד להמשך הרחבה ובקבוק שני לצורך דיפרנציאציה.
לאחר מכן, דגרו את הבקבוקים. החליפו את המצע של תאי המוצא העצביים בבקבוק המיועד להרחבה באמצעות סנטריפוגציה. לאחר מכן, השליכו את המצע הישן והוסיפו מצע חדש.
החליפו את המצע מדי ארבעה עד חמישה ימים עד שהנוספירות (neurospheres) יגיעו לגודלן המקורי של 300 עד 500 מיקרון. כדי להתחיל את התמיינות תאי progenitor עצביים לתרבית עשירה בנוירונים, הניחו זכוכית כיסוי בודדת בכל באער של פלטת 24 באערים וצפו אותן על ידי הוספת 500 µL של 100 µg/mL poly L lysine לכל באער. הדגרירו את הצלחות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאבו את תמיסת ה-poly L lysine.
שטפו את הפלטה במים סטריליים דה-יוניזים ושאבו את הנוזל שוב. לאחר מכן, ציפו את בארות הפלטה ב-500 µL של laminin מעכבר בריכוז של 5 µg/mL והדגירו למשך 30 דקות; לאחר ההדגרה, שטפו את הבארות ב-PBS, שאבו את הנוזל שוב והניחו להן להתייבש במנדף לתרביות רקמה. ארבעה ימים לאחר פיצול התאים, העבירו את הנוספירות הקטנות מהבקבוק המסומן לדיפרנציאציה אל פלטת 24 הבארות המצופה.
הוסיפו צפיפות של כ-500 נוירוספירות למבחנה. לאחר הדגרה של שש שעות, כאשר הנוירוספירות נצמדו למדחף, הסירו את מצע ההתרבות והוסיפו מצע דיפרנציאציה. המצע מורכב מ-neuro basal medium, תוספת B 27, NGF, BDNF, bFGF וחומצה רטינואית. החזירו את הפלטה לאינקובטור. לאחר גידול של תאי אב עצביים במצע דיפרנציאציה עצבית למשך שבועיים, מתקבל תרבית עשירה בנוירונים.
שטפו את הנוירונים פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן קבעו אותם ב-4%paraform aldehyde למשך 30 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הכינו את התאים לצביעה אימונוהיסטוכימית על ידי דגירה של התאים עם בופר חדירה (permeable buffer) בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
בשלב הבא, יש להוסיף לבארות נוגדנים פוליקלונליים ומונוקלונליים בריכוז 3%BSA ב-PBS. לאחר הוספה של זוג נוגדנים שונה לכל בארה, יש לדגרה אותן למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בשייקר. למחרת בבוקר, יש לשטוף את לביבות הזכוכית (cover slips) שלוש פעמים ב-PBS ולאחר מכן לדגרה עם נוגדנים משניים anti-rabbit P SI 3 ו-anti-US fitzy בטמפרטורת החדר, בחשיפה מוגבלת לאור, למשך 90 דקות לאחר הדגירה.
שטפו את לבישוני הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הניחו 10 µL של תמיסת קיבוע על זכוכית של סלייד. הוציאו את לבישון הכיסוי ממעטחת התרבית והניחו אותו, כשהוא הפוך, על תמיסת הקיבוע.
נגבו בעדינות שאריות של מדיום קיבוע וחתמו את הקצוות באמצעות לק ציפורניים. כדי להכין את התאים למיקרו-דיסקציה, הגדילו תחילה תאי אב עצביים (neuro progenitor cells) לתרבית עשירה בנוירונים על ממב كرة PEN. השתמשו בلامיסות המצופות ב-poly L lysine ובלמינין.
בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נקיים מ-RNA. לאחר מכן, צבע את התרביות באמצעות צבע histo gene כדי להדמיא את התאים; צבע ה-histo gene צובע את הגרעינים בסגול ואת הציטופלזמה בוורוד בהיר, מה שמקל על ההבחנה בין נוירונים לתאי גליה על פי המורפולוגיה המובחנת שלהם. הנח את הפסחית ב-75% ethanol ובמים סטריליים דה-יוניזציה למשך 30 שניות.
לאחר מכן, הניחו את הזריקה על נייר Kim wipe. הוסיפו 200 µL של histo gene והמתינו 20 שניות. לאחר מכן, טבלו את הזריקה באופן רצף למשך 30 שניות בכל אחד מהנוסחאות הבאות: מים סטריליים דה-יוניים, 75% ethanol, 95% ethanol ו-100% ethanol.
לאחר מכן, הניחו בחילון למשך חמש דקות וייבשו על נייר Kim wipe למשך חמישה דקות. לאחר מכן, הניחו שקופית עם ממבברת PEN מעל השקופית הרגילה והכניסו אותן למערכת Veritas לביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection) או LCM באמצעות התוכנה. בצעו צילום מיפוי (roadmap image) כדי לאתר אזורים של אוכלוסיות נוירונליות טהורות נטולות אסטרוציטים.
סמנו נוירונים אלו באמצעות כלי הרישום. לאחר מכן, בצעו לכידה בלייזר (laser capture) של אזורים אלו תוך שימוש בדיוק ואוטומציה מבוקרי מחשב בתהליך בן שני שלבים. ראשית, קרן IR נורה במספר נקודות עם הגדרת עוצמת לייזר של 70 milliwatts ופעימה של 2,500 microseconds כדי להצמיד את הממברנה למכסה.
בשלב הבא, מסירים את האזור המסומן באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 millivolts. השילוב של תהליכים אלה לוכד באופן סלקטיבי את האזורים המסומנים על גבי מכסי לכידה של LCM. לאחר לכידה של לפחות 100 נוירונים, השתמש במיקרוסקופ כדי להסיר את הממברנה מהמכסה ולהניח אותה בתוך מבחנה.
בודד RNA כולל מדגימות LCM באמצעות ערכה לבידוד RNA של P OPU וטפל ב-DNAs. לאחר מכן, הגבר את ה-RNA המבודד באמצעות ערכה להגברת RNA מסוג ribo amp בהתאם להוראות המצורפות לערכה. לבסוף, בצע אנליזת real-time R-T-P-C-R באמצעות גששים מסוג TAC MAN לזיהוי שרשראת כבדה של נוירופילמנט אנושי.
תרבית עשירה בנוירונים מתקבלת על ידי גזירה של נוירוספירות בנות ארבעה ימים באמצעות משטחים מצופים ב-poly L lysine ובלמינאט, בשילוב עם גורמי גדילה ספציפיים לגזירה. לאחר שבועיים, מתקבלת תרבית עשירה בנוירונים, כפי שמוצג כאן, באזורים בעלי צפיפות נמוכה. התאים עשויים לגזור לאסטרוציטים, כפי שניתן לראות כאן.
ניתן להכווין גם את התמיינות האסטרוציטים על ידי שימוש בגורם הגדילה CNTF במקום אלה המשמשים לתמיינות נוירונים. ניתן לזהות תמיינות נוירונים באמצעות נוגדנים לסממנים נוירונליים ספציפיים, כגון NeuN ו-synapsin, acetylcholinesterase ו-synaptophysin, וכן BDNF ו-GAP 43. צביעה חיובית מהווה עדות לכך שהתאים המובחנים הם בעלי מאפיינים של נוירונים ראשוניים. בנוסף, ניתן לזהות אסטרוציטים באמצעות צביעת אימונו-היסטוכימיה חיובית ל-stat3 ו-GFAP.
מיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture microdissection) של נוירונים מבוצעת על תאים שעברו דיפרנציאציה על שקופיות ממברנת PEN מצופות poly L lysine ולמינין; המוצגים כאן הם נוירונים שנצבעו ב-histo stain. כדי להדמינ את התאים, ניתן לסמן את התאים הרלוונטיים באמצעות לייזר, הממיס את ממברנת ה-PEN וגורם לה להיצמד למכסה הלכידה הממוקמת מעליה. לבסוף, ניתן לסמן וללכוד תאים רבים על אותו מכסה לצורך אנליזת DNA או RNA.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידוד נוירונים באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בפיתוח מודל תרבית נוירונים אנושית לצורך זיהוי סממנים נוירונליים ובידוד אוכלוסייה טהורה של נוירונים לצורך ניתוח ביטוי גנים. תאי פרוגניטורים נוירונליים אנושיים (NPCs) מורבים ומובחלים לתרביות עשירות בנוירונים באמצעות נוירוטרופינים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- התפתחות עצבית
רקע
- ניתן להרחיב תאי פרוגניטור עצביים אנושיים (NPCs) תחת תנאים ספציפיים.
- נוירוטרופינים ממלאים תפקיד מכריע בדיפרנציאציה עצבית.
- צביעה אימונופלואורסצנטית משמשת לזיהוי סמנים עצביים.
- מיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות.
מטרת המחקר
- ליצירת אספקה רציפה של תאי מוצא עצביים אנושיים.
- להגשמה (דיפרנציאציה) של NPCs לנוירונים לצורך ניתוח המשך.
- לבידוד אוכלוסיות נוירונליות טהורות לצורך מחקרי ביטוי גנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרחבה של תאי פרוגניטורים עצביים אנושיים בתנאי שגשוג.
- תרבית של NPC עם גורמי גדילה נוירוטרופיים.
- צביעה אימונופלואורסצנטית לגילוי סממנים עצביים.
- מיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר על שקופיות עם ממברנת PEN לבידוד נוירונים.
תוצאות עיקריות
- תאי פרוגניטור עצביים מובחנים מראים בעיקר מאפיינים נוירונליים.
- בידוד מוצלח של אוכלוסיות נוירונליות טהורות לצורך אנליזה.
- זיהוי של סממנים נוירונליים ספציפיים באמצעות אימונופלורסצנציה.
- סיוע בניתוח ביטוי גנים בנוירונים מבודדים.
מסקנות
- המחקר ביסס בהצלחה מודל של תרבית נוירונים אנושית.
- נוירוטרופינים יעילים בקידום דיפרנציאציה נוירונלית.
- מיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר היא טכניקה בעלת ערך לבידוד נוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture microdissection) של נוירונים מתאי אב עצביים אנושיים מובחנים מאפשרת ביצוע פרופיל מולקולרי מדויק של אוכלוסיות ספציפיות לנוירונים, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים במחקרים על ניוון עצבי. תהליך עבודה זה מגביר את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי בידוד דגימות נוירונליות טהורות לצורך ניתוח ביטוי גנים בהמשך. גישה זו ממוקמת באופן אסטרטגי כדי לספק מידע לתיקוף מטרות ולהבטיח המשכיות תרגומית בתיקי מחקרים הממוקדים בביולוגיה של מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולי התמיינות נוירונלית ומנגנונים מולקולריים הרלוונטיים למחלות נוירודגנרטיביות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות בידוד אוכלוסיות ספציפיות לנוירונים לצורך ניתוח ביטוי גנים.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין תרומות נוירונליות לתרומות גליאליות בתרביות מעורבות.
- משפר את הביטחון החזוי להקידום מטרות נוירוביולוגיות בצינור הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין תרביות עשירות בנוירונים שעברו תיקוף עבור בדיקות מולקולריות כמותיות.
- מנרמל זיהוי סמנים המבוסס על אימונופלורסצנציה לצורך אפיון ש可חזור של סוגי תאים.
- מאפשר בידוד אמין של אוכלוסיות נוירונליות טהורות עבור סינונים במורד הזרם או זרימות עבודה של omics.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על ידי אספקת מקור מתחדש של נוירונים מובחנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים נוירונליים in vitro עם נקודות קצה מולקולריות הרלוונטיות למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- מספקת רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוחים מולקולריים ספציפיים לנוירונים.
- מפחיתה עמימות מכניסטית במודלים של ניוון עצבי על ידי בידוד של אוכלוסיות נוירונליות טהורות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מהתרחבות תאי מוצא עצביים (neuroprogenitors), דרך דיפרנציאציה נוירונלית ועד לאנליזה מולקולרית, ובכך היא תומכת הן בשלבי הגילוי המוקדמים והן בשלבים של מחקר פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לאפיון ביטוי גנים ספציפי לנוירונים.
- סריקה: מספקת תרביות נוירונליות הניתנות לשחזור ומאומתות באמצעות סמנים, לצורך פיתוח בדיקות כמותיות.
- אנליזה: מספקת דגימות RNA באיכות גבוהה מנוירונים מבודדים עבור קריאות מולקולריות חזקות.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה של ממצאים in vitro עם חתימות מולקולריות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר בארגון: קובעת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לבידוד נוירונים, הישmime ל 적용 בכל פרויקטים של נוירוביולוגיה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד נוירונים ואנליזה מולקולרית לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלות של המשך או הפסקה (go/no-go) וקידום יעיל של תוכניות נוירוביולוגיה מבחינת ניצול הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים של ניוון עצבי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרבית תאי פרוגניטורים עצביים, דיפרנציאציה נוירונלית וצביעה באימונופלואורסצנציה.
- נדרשת גישה לציוד למיקרודיסקציה באמצעות לכידת לייזר (laser capture microdissection) ותשתית לניתוח RNA.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים של פרוטוקולי תרבית התאים והצביעה.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מקורות שונים של תאי פרוגניטורים עצביים או מודלים של מחלות.
- טוהר הדגימה ושלמות ה-RNA הם קריטיים לניתוחים מולקולריים המשכיים.
