Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח מודל תרבית עצבית אנושית, לזהות סמנים עצביים ולבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים לניתוח ביטוי גנים. זה מושג על ידי הרחבת תאי אב עצביים אנושיים ליצירת אספקה רציפה של תאי אב. כשלב שני, תאי האב העצבי מתורבתים בנוכחות תוספי התמיינות וגורמי גדילה נוירוטרופיים בכלים המצופים בגורמי התקשרות.

לאחר מכן, מבוצעת צביעה אימונו-פלואורסצנטית לסמנים עצביים כדי לקבוע את גורלם של תאי האב העצביים המובחנים. לבסוף, לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה של נוירונים שגודלו על שקופיות קרום PEN מבוצעת כדי להקל על ניתוח ביטוי גנים ספציפיים לנוירונים. מתקבלות תוצאות המראות שתאי אב עצביים מובחנים הם בעיקר עצביים באופיים.

מבוסס על צביעה אימונו-פלואורסצנטית ולכידת נוירונים. על ידי לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה, ניתן להרחיב את תאי האב העצביים האנושיים ולהתמיין לתרביות עשירות בנוירונים. עבור מחקרי מבחנה, מכיוון שלתרביות אלה יש כמה תאי גל, אנו יכולים להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים.

מי שידגים את ההליכים הללו יהיה רון בושארד, עמית מחקר בכיר במתקן הליבה של המיקרוסקופ שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, החיו מלאי קפוא של תאי אב עצביים אנושיים שבודדו ממוח העובר על ידי חימום מהיר שלהם ל-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוספתם ל-T 75 המכיל 15 מיליליטר של מדיום נוירו-בסיסי חם מראש, בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר, EG, F ו-FGF. לאחר תרבית התאים במשך שלושה ימים, העבירו את הנוירוספרות לתוך צינור של 15 מיליליטר וגלולו אותן בצנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט, והשאירו מאחור כ-100 מיקרוליטר מדיום, והעבירו את כדורית התא לתוך צינור איינור.

כדור תאים של 100 מיקרוליטר מספיק כדי להתפצל לשתי צלוחיות T 75. אם פחות, הפחיתו את מספר הצלוחיות מכיוון שתאי אב עצביים לא מצליחים להתרבות. אם מפוצלים דק, אז לפרק היטב את הנוירוספרות למתלה תא בודד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 50 פעמים תוך שמירה על קצה 200 מיקרוליטר כנגד תחתית הצינור.

בדוק ויזואלית את ההתקדמות באמצעות מיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק של הנוירוספרות. לאחר מכן, חלקו את מתלה התאים באופן שווה והוסיפו אותו לשתי צלוחיות T 75. אחד להמשך התרחבות ואחר לבידול.

ואז דגרו על הצלוחיות. שנה את המדיום של תאי האב העצביים בבקבוק המסומן להרחבה על ידי צנטריפוגה. ואז זורקים את המדיום הישן ומוסיפים מדיום חדש.

החלף את המדיום כל ארבעה עד חמישה ימים עד שהנוירוספרות מגיעות לגודלן המקורי של 300 עד 500 מיקרון. כדי להתחיל בהתמיינות תאים של אבות עצביים לתרבית עשירה בנוירונים, הנח החלקת כיסוי אחת לכל באר של צלחת וציפוי של 24 בארות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר פולי L ליזין לכל אחד. ובכן דגרו את הכלים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שאפו את תמיסת הפוליאול ליזין.

שוטפים את הצלחת במים סטריליים דה-יונים ושואבים שוב. לאחר מכן, מצפים את בארות הצלחת ב -500 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר, למינין עכבר ודוגרים למשך 30 דקות לאחר הדגירה, שוטפים את הבארות עם PBS שואבים שוב ומניחים אותם לייבוש במכסה המנוע של תרבית הרקמות. ארבעה ימים לאחר פיצול התאים, העבירו את הנוירוספרות הקטנות מהבקבוק המסומן להתמיינות לתוך צלחת 24 הבארות המצופה.

הוסף צפיפות של כ -500 נוירוספרות לבאר לאחר דגירה של שש שעות כאשר הנוירוספרות נצמדו לצלחת, הסר את מדיום ההתפשטות והוסף התמיינות. מדיום המורכב ממדיום נוירו-בסיסי B 27 תוסף N-G-F-B-D-N-F-D-B-C וחומצה רטינואית. החזר את הצלחת לחממה לאחר תרבית של תאי אב עצביים במדיום התמיינות עצבית למשך שבועיים, מתקבלת תרבית עשירה בנוירונים.

שטפו את הנוירונים פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן קבעו אותם באלדהיד 4% פרפורמים למשך 30 דקות. לאחר התיקון, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן הכינו את התאים לצביעה חיסונית על ידי דגירה עם חיץ חדיר בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.

לאחר מכן, הוסף לבארות נוגדנים רב-שבטיים וחד שבטיים ב-3%BSA ב-PBS. הוסיפו זוג נוגדנים שונה לכל אחד מהם, ודגרו אותם היטב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בשייקר למחרת בבוקר. שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגרו אותן עם נוגדנים משניים נגד ארנב P SI שלוש ונוגדנים משניים נגד US בטמפרטורת החדר בחושך למשך 90 דקות לאחר הדגירה.

שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן הניחו 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשת זכוכית. הוצא את החלקת הכיסוי מצלחת התרבות והניח אותה הפוכה על מדיום ההרכבה.

נגב בעדינות את כל אמצעי ההרכבה העודף ואטום את הקצוות עם לק. כדי להכין את התאים למיקרודיסקציה תחילה, יש להבדיל תאי אב עצביים לתרבית עשירה בנוירונים על קרום PEN. שקופיות מצופות פולי L ליזין ולמינין.

בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נטולי RNA. לאחר מכן, צבעו את התרביות באמצעות כתם גן היסטו כדי לדמיין את התאים שגן היסטו מכתים את הגרעינים בסגול ואת הציטופלזמה, בצבע ורוד בהיר, מה שמקל על הבחנה בין נוירונים ותאי גליה לפי המורפולוגיה הייחודית שלהם. הנח את המגלשה ב-75% אתנול ומים סטריליים נטולי יונים למשך 30 שניות.

לאחר מכן הניחו את השקופית על מגבון קים. הוסף 200 מיקרוליטר של גן היסטו והמתן 20 שניות. לאחר מכן, הנח את השקופית ברצף למשך 30 שניות כל אחת במים סטריליים נטולי יונים, 75% אתנול, 95% אתנול ו-100% אתנול.

לאחר מכן מניחים בקסילן למשך חמש דקות ומייבשים על מגבון קים למשך חמש דקות. לאחר מכן הנח קרום PEN החלק מעל השקופית הרגילה והנח אותם לתוך מערכת המיקרו דיסקציה של לכידת לייזר Veritas או LCM באמצעות התוכנה. צלמו תמונת מפת דרכים כדי למצוא את האזורים של אוכלוסיות עצביות טהורות נטולות אסטרוציטים.

סמנו את הנוירונים האלה באמצעות כלי הציור. לאחר מכן, בצע לכידת לייזר של אזורים אלה באמצעות דיוק ואוטומציה מבוקרים על ידי מחשב בתהליך דו-שלבי. ראשית, IR נורה במספר נקודות עם הגדרת הספק לייזר של 70 מילי-וואט ודופק של 2, 500 מיקרו-שניות כדי לחבר את הממברנה למכסה.

לאחר מכן, האזור המסומן נכרת באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 מילי-וולט. השילוב של תהליכים אלה לוכד באופן סלקטיבי את האזורים המסומנים על לכידת מכסי מאקרו של LCM. כאשר לפחות 100 תאי עצב נלכדו, השתמשו במיקרוסקופ כדי להסיר את הממברנה מהכובע ולהניח אותה על צינור.

בודד את סך ה-RNA מדגימות LCM באמצעות ערכת בידוד P OPU RNA וטפל ב-DNA. לאחר מכן הגביר את ה-RNA המבודד באמצעות ריבו amp ערכת הגברת RNA על ידי ביצוע ההוראות מהערכה. לבסוף, בצע ניתוח R-T-P-C-R בזמן אמת באמצעות בדיקות TAC MAN כדי לזהות שרשרת כבדה של נוירופילמנטים אנושיים.

תרבית עשירה בנוירונים מתקבלת על ידי התמיינות של נוירוספרות בנות ארבעה ימים באמצעות משטחים מצופים פולי L ליזין ולמינציה בשילוב עם גורמי גדילה ספציפיים להתמיינות. לאחר שבועיים מתקבלת תרבית עשירה בנוירונים המוצגת כאן באזורים בעלי צפיפות נמוכה. התאים עשויים להתמיין לאסטרוציטים כמו אלה שנראים כאן.

התמיינות אסטרוציטים יכולה להיות מכוונת גם על ידי שימוש בגורם הגדילה CNTF במקום אלה המשמשים להתמיינות נוירונים. ניתן לזהות התמיינות נוירונים באמצעות נוגדנים כלפי הסמנים העצביים הספציפיים, N וסינפסין חדשים, אצטילכולין אסטראז וסינפטופיזין, ו-BDNF ו-GAAP 43 צביעה חיובית היא עדות לכך שלתאים הממוינים יש מאפיינים של נוירונים ראשוניים. בנוסף, ניתן לזהות אסטרוציטים באמצעות סטטיסטיקה שלישית חיובית וצביעה חיסונית GAP.

לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה של נוירונים מתבצעת על תאים שהתמיינו על קרום PEN מצופה פולי L ליזין ולמינין השקופיות המוצגות כאן הן נוירונים מוכתמים בכתם היסטו. כדי לדמיין את התאים, ניתן לשרטט את התאים המעניינים באמצעות לייזר, שממיס את קרום ה-PEN, וגורם לו להיצמד למכסה הלכידה המונח מעליו. בסופו של דבר, ניתן לתאר תאים רבים וללכוד אותם על אותו כובע לניתוח DNA או RNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נוירונים באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר.